Введение к работе
Актуальность темы. Антиоксидантная Функция глутатиона (ЗЗН'і привлекает внимание исследователей. Глутатион способен влиять на активность прооксидантоЕ, ингнбировать своболнсраднкальные стадні: переписного окисления, разрушать перекиси нерадикальным путем, взаимодействовать с неперекисными продуктами перекиснете окисления. Многочисленные литературные данные доказывают участие глутаткока в процесса:-: клеточного деления. Несомненно, что функция глутатиона определяется, е перЕую очередь, состоянием ферментной системы, регулирующей соотношение его окисленной si Еосстанозленной форм. Широкое признание получило представление, что тнолы, к которым относится и глутатион, играют важную роль б клеточном цикле и/или контролируют деление д могут давать сигнал для запуска пролиферации (.Оєлькое Е. Е. , 1970; Напшап М. Н, . Fitot Н. С. , 1985^.
Пролиферация клеток по мнению Шапота В. С.' 197?; является обязательной предпосылкой для реализации действия оккогенных Факторов; покоящиеся клетки не подвержены неопластическому превращению. Восстановленный глутатиок в опухолях является доминирующим тиолом. Выраженным влиянием на концентрацию глутатиона обладают многие канцерогены. Некоторые цитостатики исто-зают клеточный запас G3H и вызывают лизис опухолевых клеток, ингибіфование биосинтеза глутатиона резко потенцирует их эффекты. Изменения концентрации тиолов и дисульфидов при пролиферации и злокачественном росте, естественно, должны отражать баланс между ферментами их синтеза и метаболизма: глутатпенре-дуктазой, глутатионпероксидазой, глутатиок: дегидроаскорбат оксидоредуктазой, глутатион-З-трансферазой, тиелтрансферазок, гамма-глутамилтранспептидазой и другими. Лимфоидный аппарат представляет исключительную значимость в поддержании гемеоста-за организма (ЧерткоЕ И. Л. ,5риденштейн А. Я., 1977; Чертков И. Л. 1990,1992; Штров Р. Б. и соавт.,1981; 1991), в регуляции процессов регенерации, клеточного размножения и клеточной диффе-ренцпровкк (Бабаева А. Г. ,1978; Васильев КІМ., 1989;
Принятые сокращения: ОЗК-восстановленный глутатион; ЗЗЗб-окисденный глутатиок: ГР-глутатионредуктаза; ГП-глута-тионпероксидаза; ГТ-глутатионтрансфераза; РДАР-глутати-он: дегидроаскорбат оксидоредуктава; тиолтраксфераза; ГГГ-гамма-глітакилгранспептидаза; ЖТ-ферментная редокс-система глутатиона, ПОЛ-перекпсное окисление липидов,
ГБО-гипербарическая оксигенация. Burwell R. G. , 1963: Grossman L. ,1985). По мнению Ляшенко В. А. (. 1988) дифференцироЕка иммунакомпетентных клеток является обязательным условием их участия в защитных реакциях организма. Активатор иммунокомпетентных клеток является сигналом к лифференцироЕке.
Активаторами могут быть медиаторы-полипептиды, нейропептиды (эндорфикы), иктерлейкины (Ляшенко В. А. и соавт., 1988,1993; Петров Р. В. и соавт. 1989, 1992), внутриклеточные трансмиттеры, кейротрансмиттеры f ацетилхолин, катехоламины.) (Еузников Г. А. ,1939,1992). Каким бы по химической природе не был активатор, ранние признаки активации характеризуются "окислительным" ьзрыЕом, образованием и выделением в среду перекиси водорода, ОН, 02, ив которых могут возникать ещё более реакционно-способные 02 и ОН. Происходит интенсификация процессов ГОЛ клеточных мембран (Козлов А. Е , 1975, 1991; Владимиров Ю. А. 1975,1993V Перекисные и свободнорадикальные процессы являются нормальными компонентами физиологии клетки и их выраженность регулируется различными механизмами (Владимиров Ю. А., Арчаков А. И., 1972; Герасимов А. М., 1981, 1990; ЕурлакоЕа Е. Б. и соавт. ,1980, 1992; Ланкин Е. 3. ,1939,1993). Е физиологических условиях между системами антиоксидантоЕ и свободных радикалов существует биологическое равновесие. С другой стороны, регуляция многих жизненно важных процессов в организме основана на свободнорадикальном и перекисном механизмах (Еарабой А. В. и соавт., 1992; Oterley L. V. , 1986). По мнению Герасимова А. М. (1981, 1990) онтогенез предусматривает возникновение зеолюци-онно выбранной сбалансированности организменных, тканевых и внутриклеточных факторов защиты от кислорода, по-видимому, с сохранением принципа "избыточности" внутриклеточной антиокислительной системы. Биоактиоксидант-глутатион и его ферментная редокс-система, несомненно, должны играть вахную роль как в процессах ПОЛ, гак и в механизма:-: пролиферации иммунокомпетентных клеток.
Сведения о состоянии ФРСТ иммунокомпетентных клеток при опухолевом росте е литературе крайне немногочисленны. КеЕыяснена также ее роль при лимфопролифератиЕНЫх процессах, как в нормальных тканях, так и при лимфопролиферативной патологии. Рост гемоблаетозов, в том числе лимфопролиферативных заболеваний, требует поиска новых или дополнительных специфических подходов к терапии. Комбинирование методов химической терапии с антиоксидантами, сочетание химиотерапии с гипербарической оксиге-
- s -нацией являются перспективными подходами к лечению лимфопро-лиферативных и других онкозаболеваний.
Цель и задачи исследования. Главной целью настоящей работы было изучение состояния ФРСГ в иммунокомпетентных тканях при различной активности пролиферативного процесса, а также осуществление поиска взаимосвязи антиоксидантной системы глутати-она с процессами пролиферации лимфоидных клеток.
Для достижения этой цели было необходимо реиить следующие задачи:
-
изучить состояние системы глутатионзависимых ферментов при физиологической пролиферации пренатального, антенатального периодов и физиологической беременности;
-
исследовать состояние ФРСГ при стимуляции процессов пролиферации после частичной спленэктомии;
-
выяснить влияние некоторых веществ различного механизма действия: иммуномодуляторов, цитостатиков, индукторов, про-оксидантов, антиоксидантов, микотоксинов , пестицидов и ГБО на состояние ФРСГ лимфопролиферативных органов;
-
изучить состояние системы глутатиона в иммунокомпетентных органах при иммуносупрессивном влиянии перевивных опухолей ( саркомы 37 и лимфосаркомы ЛИС-1);
-
осуществить поиск корреляционных взаимоотношений между активностью глутатионзависимых ферментов и морфологическим вариантом, ; либо активностью (стадией) болезни при лимфопролифе. ративной патологии.
Научная новизна. Признание кислородной токсичности, как постоянно действующего фактора эволюции, позволяет в новом свете оценить эмбриональное и онтогенетическое формирование иммунокомпетентных органов.
Исследование состояния ФРСГ лимфопролиферативных органов в пренатальном, антенатальном и половозрелом возрасте крыс и мышей, проведённое нами впервые показало, что уровень активности иследованных глутатионовых ферментов отражает состояние антиокислительной системы в тканях при переходе от пренатального, гипоксического состояния плода, к антенатальному, аэробному. Необходимость аашиты лимфопролиферативных тканей от агрессии кислорода, всплеска цепных радикальных реакций, усиления процессов ПОЛ, вызывает индукцию активности актиокислительных ферментов, характеризуется "избыточностью" активности ферментов ло отношению к уроеню оксигенации ткани, сбалансированностью компонентов ферментов антиокислительной- системы.
При беременности, на фоне физиологической стимуляции про-
- 4 -лиферативных процессов в тканях плода, наблюдается одновременная супрессия пролиферации, в первую очередь, в иммунокомпе-тентных органах матери, характеризующаяся низким уровнем активности глутатионзазисимых ферментов.
Состояние ферментной редоке-системы глутатиона, регулирующей интенсивность свободнорадикальных процессов в селезёнке при стимуляции митозов частичной спленэктомией, отражает метаболические потребности органа, характеризуясь циклическими изменениями. Циркадность активности ферментов антиокислительной системы наблюдается также в иммунокомпетентных органах.
.Показано, что ФРСГ лимфопролиферативных органов отражает иммуномодулируюшее влияние препаратов. Иммуномодулируюший эффект (стимуляция или депрессия) препарата определяется его химической природой, концентрацией и.уровнем пролиферативной активности клеток органа. Введение антигена стимулирует лимфоп-ролиферативные процессы, что отражается на состоянии ФРСГ, вызывая её дисбаланс. "Разбалансировка" между отдельными её звеньями с преобладанием активности ГР может быть в дальнейшем стимулом к лимфопролиферации, на смену которой приходит лимфодепрессия. Комбинированное применение индукторов и анти-оксидантов с цитостатическими препаратами может модифицировать биологическое действие лекарственных веществ, являясь отражением сложных процессов биотрансформации, определяемых химической природой препарата.
При опухолевом росте наблюдается полиморфизм обеспеченности клеток ферментами антиокислительной зашиты. Иммуносуп-рессирующее влияние растущей опухоли сопровождается дисбалансом ФРСГ, комбинированное применение цитостатиков с антиоксидантами, либо ГБО уменьшает дисбаланс между звеньями системы глутатиона в лимфопролиферативных органах. Впервые найдена корреляционная зависимость между активностью ФРСГ и морфологическим вариантом, либо активностью (стадией) патологического процесса при лимфопролиферативной патологии (острый и хронический лейкозы, лимфогранулематоз, лимфосаркома). Комплексный подход при изучении состояния ФРСГ позволил предложить метод дифференциальной диагностики острого лимфобластного лейкоза и лимфобластной лимфосаркомы в стадии лейкемизации.
Практическая ценность. Известно, что выбор терапии при злокачественных неходжкинских лимфомах, остром и хроническом лейкозе, лимфогранулематозе (болезнь Ходжкина) определяется морфологическим вариантом и стадией заболевания, т.е. активностью процесса. Осуществлённый нами поиск взаимосвязи между-.v
- 5 -различными цитоморфологическими вариантами и активностью процесса (стадией) позволил получить дополнительный биохимический тест для диагностики и контроля ва течением болевни. Комплексный подход при выяснении состояния ФРСГ при лимфобластном варианте лймфосаркомы в стадии лейкемизации и лимфобластном остром лейкозе дал дополнительный чувствительный биохимический тест для их дифференциальной диагностики, снимая существующую условность цитологического контроля. Сочетание химиотерапии с антиоксидантной, либо рациональной оксигекотерапией уменьшает токсический эффект применяемых цитостатиков при лечении лимфо-пролиферативных и других онкозаболеваний, что может быть рекомендовано для более широкого применения этих комбинаций. Возникновение блеомициновых пульмонитов, как осложнений химиотерапии, также может быть предупреждено комбинированным применением блео-мицина и дозированной оксигенотерапией. Предложен биохимический тест для оценки токсичности пестицидов. Разработано 5 рационализаторских предложений отраслевого значения.
Внедрение в практику. Теоретические положения и методы исследования внедрены в педагогический и научный" процесс кафедр биологической химии, гематологии и челюстко-лицезой хирургии Кишинёвского государственного медицинского университета им. Н. А. Тестемицану. Предложенные биохимические методы в качестве дополнительных методов диагностики активности лимфопро-лиферативных заболеваний, дифференциальной диагностики лимфоб-ластного лейкоза и лимфобластной лймфосаркомы в стадии лейкемизации, комбинированное применение цитостатической терапии в сочетании с регламентированной ГБО и антиоксидантами с целью уменьшения токсичности химиопрепаратов и стимуляцій дифферен-., цировки клеток могут быть рекомендованы для Енедрения в онкологическую практику. Для разработки конкретных вариантов лечения в зависимости от стадии, способа предшествующей терапии, с целью индивидуального подхода к лечению больного. Еызоды и результаты работы доложены на многочисленных конференциях, симпозиумах и изложены в публикациях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены з качестве секционных и стендовых докладов на 1 Республиканской научно-практической конференции_-гастроэнтерологов "Актуальные вопросы гастроэнтерологии" (Кишинёв,1988), 4-ом Всесоюзном съезде ' патофизиологов "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" (Кишинёв,1989), 3-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва,1989), Всесоюзной научной конференции "Актуальные проб-
лемы лекарственной токсикологии" (Москва, 1990), Межгосударственном симпозиуме "Современные методы диагностики и лечения злокачественных лимфом"(Санкт-Петербург,1992), Всесоюзном симпозиуме "Каротикоиды в онкологии" (Москва,1992), Съезде медико-биологических обществ Молдовы (Кишинёв,1993), 1 Международной медико-биологической конференции (КишинёЕ,1995), Совещании по ГБО "Применение кислорода в медицине" (Гродно,1989), ежегодных научных конференциях ГМУ им. Н. А. Тестемицану (Кишинёв, 1938-1995).
Публикации. Материалы диссертации представлены в 17 научных публикациях.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), материалов и методов исследования (2 главы), собственных исследований (3 главы), общего обсуждения и выводов. Работа представлена на 246 страницах машинописи, иллюстрирована 37 таблицами и 114 рисунками. Список цитированной литературы включает 476 наименований, из них 06 на русском языке и 270 на иностранных.
Биологические методы. Основная часть экспериментов выполнена на белых беспородных мышах (весом 30-40 г) и крысах (150-200 г), содержавшихся на стандартной диете вивария. Кровь здоровых людей-доноров получали на Республиканской станции переливания крови. Кровь людей с лимфопролиферативной патологией ( лейкоз, с лимфосаркома, лімфогранулематоз) получали из отделения гематологии Молдавского онкологического центра (зав.кафедрой гематологии ГМУ им. Н. А. Тестемицану проф. , д. м: н. Корчмару И. Ф. ).
Перевивка штаммов опухолей осуществлялась беспородным мышам.
Аецитная саркома 37 и солидная лимфосаркома ЖО-1 были получены из лаборатории экспериментальных моделей Онкологического научного центра АМН СССР (ВОНЦ) г. Москва. Аецитная саркома 37 прививалась с питательной средой Игла или 199 внутрибрюшинно. Солидная лимфосаркома ЛИО-1 прививалась мышам на питательной среде Игла в мышцу бедра. Частичная спленэктомия (50%) мышей-самцов проводилась по методике Хардовой Г. В. (1975) под лёгкой эфирной анестезией. Консервация селезёнки осуществлялась в условиях гипотермии. В опытах использовали препараты: фенобарбитал натрия в дозе 80 мг на кг веса; циклофосфан - 100
- V -мг/кг и 6 мг/кг; винкристин - 0,15 мг/кг и 2 иг/кг; рубомицин -0,2 мг/кг; блеомицин -2 мг/кг и 10,5 мг/кг; гидрокортизон -100 мг/кг; лезамигол (декарис) - 5 мг/кг; интерферон (альфа-2.) -ампула/5 мл 0,9% раствора NaCl, веодили по 0,1-0,2 мл/мышь; Na2Se02 - 5 мг/кг; тималин - 4,0 мг/кг; альфа-токоферол - 90 мг/кг; аскорбат натрия - 0,3 мг/кг; ретинол - 5 мг/кг. Сеансы ГБ0 проводили в течение 1 часа в режиме 2 ата в Проблемной лаборатории кафедры общей и клинической фармакологии (зав. кафедрой, проф. , д. м. н. Гикавый В. И.). Проведение исследований in > vitro выполнялось с использованием плазмы, лейко-, лимфо- и гемолизатов, полученных из периферической крови здороЕых людей. В экспозиции использовали Na2Se02, цинеб (зтиленбисдитио-карбамат), ТмТД (тетраметилтиурамдисульфид) в концентрации 1 тМ. Иммунизацию мышей проводили путём введения экстракта тимуса, полученного от инбредных мышей (Шмаков А, Е и соавт. ,1986).
Биохимические методы. Дифференциальное получение полиморф-ноядерных лєйкоцитое и лимфоцитов проводилось по методу Бейум A.M. (1980) с использованием двухступенчатого градиента плотности смеси фиколл-урографина и силиконированной посуды. Бее процедуры проводили с охлаждением, микроскопический контроль на чистоту полученных клеточных фракций проводили после фиксации 'метиловым спиртом с последующим окрашиванием по Нохту (Козловская Л. В. ,Мартынова М. А. ,1975). Частично очищенный ли-пофильный токсин выделяли из мицелия Aspergillus flavus (Ников И.О. ,1977). ^
Определение активности ГР проводили по методу Conn Е. Е. , Vennesland А. (1951) с модификациями Герасимова А. МЛ 1981) спектрофотометрически. Активность ГП определяли по Paglia D. Е. .Valentine V.N. (1957) в модификации Flohe L., Brand 1.(1970). Определение активности ГДАР проводили по разработанному нами ранее методу (Герасимов А. М. и соазт., 1976,1979). Активность ГТ определяли по методу Habig W. Н. .Jacoby W. В. (1981). Активность ТТ определяли в сопряженной системе с глутатионре-дуктазой по Tietze F.(1970). Активность ГП определяли по методу Ujister A. et al. ,(1981). Использовали также наборы фирмы "Lachema" (ЧР). Активность каталазы исследовали модифицированным методом Aebi Н. при 240 км. Активность Г6ФДГ определяли по методу Сейц И. Ф., Лугановой И. С. (1967). Определение содержания несвязанных с белком кизкомолекулярных тиолое проводили по модифицированному Герасимовым А. М. (1981J методу Sedlak I., Lindsay R. Н. (1963). Содержание белка определяли по методу
- 8 -Lowry A. H. et al. (1951). Содержание ДНК определяли по методу Burton К. (1956). Содержание -гемоглобина крови определяли ге-миглобинцианидным методом,' используя наборы фирмы "Реа-нал"(ВНР) спектрофотометрически. Определение содержания альфа-токоферола и ретинола в сыворотке крови проводили флуори-метрическими методами Ogihara Т. et al. , 19S8; Ulang Ch. et al. ,1978; на СФ фирмы "Hitachi MPF-4". Получение и очистку дрожжевой ГР проводили по модифицированному нами методу Mavis R.D. .Stellwagen Е.(1968). Статистическую.обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента (Венчиков А.И.,Еек-чиков Е А. ,1974) с использованием пакета прикладных программ . "Microstat" (Microsoft,США) ка персональном компьютере IBM1386. Коэффициенты корреляции по методам Спирмена и Пирсона рассчитывали по Гублеру Е. Е,Генкину А. А. (1973).
