Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о физиолого-биохимических механизмах функционировапия костной ткани (обзор литературы) 9
1.1. Морфо-функциональная характеристика костной ткани 9
1.2. Общая характеристика неорганических компонентов костной ткани 12
1.3. Общая характеристика органического компонента и его роль в формировании костной ткани 19
1.4. Эндокринная регуляция обмена костной ткани 26
1.5. Особенности действия низкоинтенсивных магнитных полей на организм млекопитающих и на метаболизм костной ткани 33
Глава 2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Объект исследований и условия постановки эксперимента 39
2.2. Методы исследований 43
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
3.1. Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия 46
3.2. Влияние инъекций гидрокортизона на обменные процессы в организме крыс 51
3.3- Изменения процессов костной резорбции при многократном воздействии ПМП 56
3.4. Комбинированное влияние инъекций ГАП и ПМП па организм животных на фоне теплового воздействия 63
3.5. Биологические эффекты хронического действия ПМП на состояние костной резорбции 69
3.6. Комбинированное влияние инъекций ГАП и хронического действия ПМП на организм животных при тепловом воздействии 73
Глава 4. Обсуждение результатов 81
Выводы 98
Список использованных источников литературы 100
Приложения ..117
- Общая характеристика неорганических компонентов костной ткани
- Особенности действия низкоинтенсивных магнитных полей на организм млекопитающих и на метаболизм костной ткани
- Объект исследований и условия постановки эксперимента
- Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия
Введение к работе
Актуальность проблемы, В последнее время возросло количество различных заболеваний опорно-двигательного аппарата, расширился контингент лиц, страдающих нарушениями регуляции обмена костной ткани. Часто причинами подобных нарушений могут быть неблагоприятная экологическая обстановка, заболевания внутренних органов, постоянные стрессы. Как известно, в стрессовых ситуациях активизируется гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система, в результате чего повышается выработка стероидных гормонов, усиливающих процессы резорбции костей (Дедов И.И. и соавт., 2002).
С целью борьбы с потерей костной ткани в медицинской практике широко используют целый ряд препаратов, регулирующих обмен кальция и фосфора в организме. Весьма перспективным в этом отношении нам представляется ал-логенный гидроксиапатит (Волова Л.Т., Подковкин В.Г\, 2000), Он получается из натуральной кости и кроме кальция и фосфора содержит микроэлементы в тех же количествах, в которых они имеются в костной ткани. Поэтому его применение способствует более эффективному протеканию процессов регенерации костной ткани (Власов МЮ., 2002; Волова Л.Т, и соавт., 2003), Однако для теоретического обоснования применения аллогенного гидроксиапатита с целью предотвращения потери костной массы необходимо более детальное изучение механизмов его воздействия на регуляцию метаболических процессов.
Хорошо известно, что магнитные поля обладают большой биологической активностью. Они способны изменять функциональное состояние нервной и эндокринной систем и, таким образом, оказывать свое влияние на различные стороны метаболизма (Холодов Ю.А., 1998). Имеются сведения и о воздействии этого физического фактора на обмен костной ткани и кальция. Это находит применение в медицинской практике. Был разработан способ стимуляции ос-тсогенеза с помощью магнитного поля, успешно применяемый для ускорения срастания переломов костей (Савельев B.FL, Муравьев М.Ф., 1976).
Недостатком этого способа лечения является применение магнитного поля высокой напряженности - 500 Э. В настоящее время имеются данные о не-
благоприятном влиянии на организм человека магнитных полей высокой интенсивности. При этом известно, что поля, сравнимые по своей величине с геомагнитным полем, также обладают высокой биологической активностью (Пре-смаи А.С., 1968). Однако их использование в медицинской практике к настоящему времени еще не нашло широкого распространения в связи с недостаточной изученностью физиологических и биохимических механизмов влияния на живой организм.
Цель исследования. Произвести в эксперименте комплексную оценку реакции организма па влияние ПМП различной продолжительности действия при эктопическом введении аллогенного ГАП в условиях искусственно вызванного усиления костной резорбции.
Основные задачи исследования,
Проанализировать в эксперименте влияние повышенной температуры воздуха на морфо-функциональное состояние костной ткани, функцию коры надпочечников и биохимические показатели крови, характеризующие метаболизм костной ткани у животных.
Выявить особенности многократного периодического воздействия пиз-коинтенсивного постоянного магнитного поля на морфо-функциональное состояние костной ткани, функцию коры надпочечников и показатели метаболизма костной ткани у животных в условиях влияния высокой температуры воздуха.
3. Исследовать влияние хронического действия магнитного поля на
функциональное состояние коры надпочечников, процессы перекисного окис
ления липидов и антиоксидантной зашиты на фоне повышенной температуры.
Выявить влияние внутримышечного введения аллогенного гидроксиа-патита на морфо-функциональное состояние костной ткани.
Проанализировать реакцию коры надпочечников и показатели метаболизма костной ткани на введение гидроксиалатита на фоне термического воздействия.
6, Выявить особенности реакции коры надпочечников, состояние антиоксидантних систем и изменения показателей обмена костной ткани в условиях комбинированного воздействия теплового фактора, магнитного поля и введения гидроксиапатита.
Научная новизна.
В проведенном исследовании впервые дана комплексная оценка реакции организма животных на влияние низкоиптенсивного магнитного поля с различной продолжительностью действия и эктопического введения аплогенного ГАП на ряд жизненно важных систем у животных, у которых было воспроизведено усиление костной резорбции» Выявлены изменения биохимических показателей метаболизма костной ткани, свидетельствующие о стимулирующем влиянии исследованных факторов на остеогенез и уменьшении морфологических признаков резорбции.
Впервые проанализированы изменения гормональных показателей, характеризующих состояние симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем в условиях низко интенсив ного магнитного поля. Выявлено уменьшение реакции коры надпочечников на термическое воздействие под влиянием данного физического фактора.
Обнаружена ел абовы раженная реакция коры надпочечников, не носящая характер стрессовой, на фоне активизации антиоксидантных систем в условиях комбинированного воздействия теплового фактора, постоянного магнитного поля и введения ГАП.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенной работы дополняют современные представления о реакции организма на низкоинтенсивные ПМП в условиях усиления костной резорбции.
Впервые произведено моделирование процесса усиления резорбции костной ткани у крыс с помощью воздействия повышенной температуры окружающей среды.
Разработан способ стимуляции остеогенеза с помощью действия ПМП низкой интенсивности, величина которого значительно ниже предельно допустимого уровня.
Установлено, что реакция организма на ПМП в условиях эктопического введения аллогенного ГАП и усиления костной резорбции имеет комплексный характер и включает физиологические изменения ряда систем: метаболизм костной ткани, функциональное состояние САС, ГТНС, перекисное окисление липидов в печени.
Получено экспериментальное обоснование эффективности применения комбинированного воздействия низкоинтенсивного ПМП и однократного введения аллогенного гидроксиапатита, полученного из костной ткани, состав которого близок к минеральному компоненту кости, для профилактики развития остеопороза. Установлено, что эктопическое введение ГАП не вызывает отрицательных сдвигов в состоянии исследованных показателей метаболизма костной ткани, перекисного окисления липидов, САС и ГГНС.
Основные положения, выносимые на защиту.
Воздействие повышенной температуры воздуха (70 С 10 минут) ежедневно в течение 2 недель вызывает усиление костной резорбции у крыс.
В результате ежедневного кратковременного воздействия низкоинтенсивного ПМП происходит ослабление морфологических признаков резорбции костной ткани, а также характерных для него изменений биохимических показателей метаболизма костной ткани и функционального состояния коры надпочечников.
Внутримышечное введение суспензии аллогенного гидроксиапатита вызывает уменьшение проявлений резорбции костной ткани и биохимических показателей метаболизма костной ткани.
Апробация работы. Апробация работы проведена на кафедрах биохимии и физиологии Самарского государственного университета. Материалы диссертации доложены на II всероссийском симпозиуме с международным участием по проблемам тканевых банков "Клинические н фундаментальные аспекты тка-
8 невой терапии- Теория и практика клеточных технологий" (Самара, 2004); на итоговых научных конференциях Самарского государственного университета и Самарского воєнно-медицине кого института (Самара, 2004, 2005), а также на четвертом всемирном конгрессе по проблемам тканевых банков (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, получено положительное решение на выдачу патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, результатов собственных исследовании, анализа и обсуждения полученных данных, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Работа содержит 30 рисунков и 11 приложений. Список литературы включает 191 источник, в том числе 68 зарубежных.
Эксперименты на животных выполнены на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Самарского государственного медицинского университета. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории за оказанную всестороннюю помощь в работе.
Общая характеристика неорганических компонентов костной ткани
Основную массу минерального компонента костной ткани оргаїгазма человека составляют кальций и фосфор (99%), где они вместе образуют кристал 13 лы гидроксиапатита Саш(Р04)б(ОН)і (Капланский Я.С., 1966; Клишов АА, 1971; Марри Р. и соавт., 1998; Дубов Я.Т., 1967; Мазуров В.И., 1974). Кость -это динамическая ткань, претерпевающая перестройку в зависимости от нагрузки (Елисеев В.Г.,1961; Касавина Б.С., Торбенко В,П., 1979), По мнению В.П. Торбенко (1977), снятие физической нагрузки на костную систему вызывает нарушение белкового и минерального (фосфорного и кальциевого) обменов костной ткани, снижение плотности костей и увеличение уровня кальция в крови. В состоянии динамического равновесия процессы образования и резорбции костной ткани сбалансированы.
Большая часть кальция не может свободно обмениваться с кальцием внеклеточной жидкости. Итак, в дополнение к своей роли механической опоры кости служат резервуаром кальция. Около 1% кальция скелета находится в пе-риостальном пространстве (надкостнице), 1% общего количества составляет легкообменивающийся пул, и вместе эти два источника составляют мобильный (смешанный) пул ионов кальция. Помимо этих функций кальций в организме выполняет еще ряд других (Бабанский Е.Б., 1972). Благодаря способности образовывать прочное соединение с белками, органическими кислотами и другими веществами, он играет важную пластическую роль при формировании тканевых структур и влияет на многие физиологические и биохимические процессы, постоянно протекающие в организме человека и животных (Држевецкая И.А., 1983). Хорошо известно об участии кальция в регуляции клеточных мембран, молекулярных механизмах мышечного сокращения, активировании ряда ферментных систем. Отклонения содержания кальция в крови и тканях от нормы приводят к развитию функциональных и морфологических нарушений в деятельности ряда органов, что подтверждается многими исследованиями (Дубов ЯЛ\, 1967; Колобов Б.В., 1962). Нарушения кальциевого обмена лежат в основе заболеваний костной системы.
В плазме крови кальций присутствует в трех формах: 1). в комплексе с органическими и неорганическими кислотами; 2). в связанной с белками фор 14 мс; 3). в ионизированном виде. В комплексы с цитратом, фосфатом и другими анионами вовлечено около 6% общего кальция.
Ион кальция и парный ему нон фосфата присутствуют в плазме крови в концентрациях, близких к пределу растворимости их соли; отсюда следует, что связывание Са2+ с белками предупреждает возможность образования осадка и эктопической кальцификации. Изменения плазменных белков (альбумины, глобулины) сопровождаются соответствующими сдвигами уровня общего кальция в плазме крови. Связывание кальция с белками плазмы зависит от рН; ацидоз способствует переходу кальция в ионизированную форму, а алкалоз повышает связывание с белками, т.е. снижает концентрацию Са + (Березин И.В., Савинов Ю.В., 1990).
Количество образовавшегося в кишечнике наиболее трудно растворимого фосфорнокислого кальция в большей степени зависит от соотношения кальция и фосфора в пище (Сычеников И.А. и соавт., 1978; Корж А.А., 1972), По имеющимся данным (Попоников А,В.3 1981; Ткаченко Б.И., 1994; New S.A., 2002)5 для образования сравнительно легко растворимых и всасывающихся двухосновных фосфорнокислых солей кальция наиболее благоприятно соотношение кальция и фосфора в молоке. Если в пище имеется значительный избыток фосфора по сравнению с кальцием, то образуется наиболее трудно растворимый трехосновный фосфорнокислый кальций5 в связи с чем, всасывание кальция заметно ухудшается; аналогичным действием обладает и избыток жиров в пище, что подтверждено исследованиями Б.С. Касавиной, Торбенко В.П. (1979) и В.И. Покровского (1992).
Уровень потребления кальция, поскольку он связан с ростом, должен быть таким, чтобы была предотвращена зависящая от него остановка роста. Считается, что потребление кальция не должно быть меньше 400 мг в день (Ньюман У,Ф,Э Ныоман М.У., 1961). В настоящее время точно установлено, что развитие рахита и кариеса зубов в основном зависит не от количества кальция в пище, а от процессов его всасывания (Лиознер Л.Д., 1982; Миклошевская Н.Н. исоавт., 1988). Имеются немногочисленные данные (Клишов А,А., 1971) о том, что обычно низкое потребление кальция не оказывает отрицательного влияния на состав и физическую плотность костей. Старческий остеопороз, очень распространенное заболевание среди лиц преклонного возраста, ииогда связывают с понижением всасывания кальния (Бабаиский Е.Б., 1972; Насонов Е.Л., 1999, 2002; Dempster D.W., Lindsay R., 1993). Так как около 99% кальция, имеющегося в организме, сосредоточено в костях, то можно ожидать, что на кальциевый - обмен оказывает рост костей, их минеральный состав, общая масса. Организм новорожденных содержит примерно 25-30 г кальция, а у взрослых (при весе от 50 до 70 кг) от 850 до 1400 г, что подтверждается исследованиями (Попоников А.В., 1981). Рост и вес тела не влияют на содержание минеральных солей. Их количество зависит от толщины кости, ее формы, размеров. Неширокие компактные кости с небольшой толщиной больше минерализованы (Ныоман У.Ф., НьюманМ.У., 1961).
Содержание солей в кости с возрастом увеличивается. При этом молодые кости больше содержат аморфного фосфата кальция Саз(РОд)2, а зрелые - кристаллического Са]п(Р04)б(ОН)2. Особенно активно происходит минерализация в эмбриональном периоде (Држевецкая И.А., 1983). В развивающейся кости соли кальция первоначально накапливаются в основном веществе в виде диффузных агрегатов, позднее они превращаются в кристаллы апатита (Есипова Н.Г., 1973; Савельев В.И., Родюкова Е.Н., 1992).
Парным кальцию ионом является фосфат. Для минерализации костей необходимо поддержание определенных концентраций Са2+ и Р043"во внеклеточной жидкости и надкостнице (Марри Р. и соавт., 1998). Фосфора значительно больше в эпифизах, чем в диафизах, и обновление его в них идет в 4 раза быстрее (Каплапский Я.С., 1966).
Интересны данные ряда исследователей о стимулирующем остеогенсз влиянии синтетического и аллогенного (полученного из кости) гидроксиапати-та. В большинстве случаев применяли синтетический кальций-фосфатный препарат - гидроксиапатит; в стоматологии его использовали для заполнения костпых дефектов (Безруков В.М., Григоръян A.C,S 1996); для заполнения челюст-но-лицевых дефектов (Панкратов А,С«Э 1995; Хамраев Т.К. и соавт., 1994; Во-nucci Е. е.а., 1997), А.К. Gosain е.а. (2002) изучали остеоиндуктивные свойства гидроксиапатит-содержащих биоматериалов на модели. В работе T.Goto е.а. (2001) обнаружили, что пористый исісусствешіо полученный гидроксиапатит заменяется в организме новой костной тканью. G. Zambonin и М. Grano (1995) исследовали влияние различных биоматериалов, в том числе кальций-фосфатных па функции остеобластов. В свою очередь J, Zong е.а.. (1997) изучали реакцию организма на клеточном уровне на эктопическую имплантацию в мышцы пористой кальций-фосфатной керамики. В работе U.Ripamonti (1996) доказана возможность внутримышечного костеобразования при введении ГАП в мышцы живота животных. Существует мнение, что пористый гидроксиапатит может быть растворимой матрицей для адсорбции, хранения и контроля за выделением белковых факторов, вызывающих локальное формирование кости.
Особенности действия низкоинтенсивных магнитных полей на организм млекопитающих и на метаболизм костной ткани
В литературе имеется ряд работ, посвященных исследованию влияния низкоинтенсивпьтх магнитных полей на различные стороны жизнедеятельности животных (Григорьев Ю.Г., 1982, 1995; Копанев В.И., Шакула А.В., 1985; Под-ковкин В.Г. и соавт., 2000), однако регуляции обмена соединительной ткани уделено недостаточное внимание. Между тем, физические лечебные факторы, такие как магнитные поля различной интенсивности, играют важную роль в стимуляции регенерации тканей, устраняют локальные воспалительные явления, улучшая тем самым обменные процессы (Дудин М.Г. и соавт., 2001; Сосин ИЛ., Буявых АХ., 1998; Botti R е.а.э 1996),
В медицинской практике широкое применение получили магнитные поля с различными характеристиками. Установлено (Жуков Б.Н., 1982), что они способны оказывать благотворное влияние на многообразные физиологические и биохимические процессы в организме.
Наиболее xopotuo изучены и часто применяются в терапии высокоинтенсивные магнитные поля. Так, М.Ф. Муравьев и соавт. (1984) применяли при ангиопластике магистральных вен нижних конечностей при остром тромбофлебите постоянное магнитное поле. Оказалось, что МП усиливает регенеративные процессы в тканях и ускоряет репарацию ран. Обнадеживают исследования Л;Х.Гаркави и соавт. (1990, 1996). Они для большей эффективности лечения онкологических больных повышали неспецифическую резистентность организма с помощью малых доз адреналина, мумие и магнитного поля с малой индукцией. Кроме того, в ряде работ было выявлено спазмолитическое, противоотечное, анальгетическое, противотромбическое, противовоспалительное действие постоянного магнитного поля (Гаркави Л.Х. и соавт., 1990, 1996; Муравьев М.Ф. и соавт., 1984; Плеханов Г.Ф,, 1990; Жуков Б.Н., Лазаревич В.Г., 1989). В ходе ряда исследований (Botticelli A.R. е.а.,1998; Сапе V. е.а., 1998; Caruso А. е.а., 1996) было обнаружено положительное влияние низкочастотного электромагнитного поля на дифференцировку остеобластов. Авторы отмечают, что эффект электромагнитного поля сходен с эффектом применения некоторых факторов роста, вызывающих в клетках усиление синтетических процессов. В итоге был сделан вывод о регулирующем воздействии магнитных полей на костные клетки, которое обусловлено увеличением скорости экспрессии мРНК коллагена I типа и других белков внеклеточного матрик-са.
Магнитные поля оказывают влияние и на множество других физиологи ческих и биохимических процессов. В.Н. Аристархов (1979, 1982) обнаружил влияние магнитных полей на процесс перекисного окисления липидов. Н.А. Удинцев и соавт. (1977, 1982) выяснили, что низкочастотные магнитные поля различной напряженности и длительности действия снижают уровень гликогена, активность дегидрогеназ пентозного цикла, гексокиназы и повышают концентрацию лакгата, активизируют фосфорилазу и лактатдегідрогеназу. Им же удалось обнаружить увеличение содержания 11-оксикортикостероидов в крови и стимуляцию функции щитовидной железы. Полученные результаты свидетельствуют о повышении функционального уровня гипофизарно-надпочечниковой системы под действием низкочастотных полей.
Следует отметить снижение уровня свободнорадикального окисления липидов в сердце при действии постоянного магнитного поля низкой напряженности (Удинцев Н.А., Иванов В.В., 1982).
"С точки зрения герапиивысокоинтенсиьные МП "обладают благотворным лечебным действием, но с точки зрения гигиенического нормирования они небезопасны для организма (Григорьев Ю.Г., 1982; Холодов Ю.А., 1998),
Долгое время считалось, что слабые МП безразличны для живых организмов. Е.М. Владимирским и соавт. (1982) было выявлено, что магнитное поле действительно является биологически значимым фактором, начиная уже с напряженности 1(Г3 А/м: у животных меняются поведенческие реакции, физиологические показатели, картина крови. Более того, слабые магнитные поля способны оказывать лечебное воздействие па организм,
В большом количестве работ выявлено воздействие низкоинтенсивных МП на кровеносную, нервную и иммунную системы (Григорьев Ю.Г., 1982; Удинцев Н.А., Капская Н.В., 1977; Холодов Ю.А., Шишко НА., 1978). По имеющимся данным исследований (Пресман А.С., 1971; Холодов Ю.А., 1982), в центральной нервной системе существуют управляющие механизмы, способные оценивать тенденцию к повышению или понижению длительно действующих факторов внешней среды и приспосабливать к этой тенденции уровень и скорость протекания физиологических процессов, обеспечивая при этом необходимое "опережение" в физиологических сдвигах. Эти управляющие механизмы тесно связаны с функцией гипоталамуса.
Кроме того, низкоинтенсивные магнитные поля нашли применение и при заживлении переломов костей (Савельев В.Н., Муравьев М.Ф., 1976). Сеансы магнитотерапии ускоряли срастание обломков трубчатых костей. В.И. Копаневым и А.В. Шакулой (1985) в ходе морфологических исследований установлены дистрофические изменения соединительной ткани печени у крольчат, находившихся с момента рождения в течение 1 месяца в условиях гипогеомагнитного поля. Изменение уровня естественного магнитного поля Земли оказывало существенное влияние на поведение животных и на формирование условных рефлексов. У крольчат отмечались вялость, снижение общей двигательной активности. Кроме того, снижение двигательной активности наблюдалось и у взрослых мышей, находящихся в течение трех месяцев в условиях гипогеомагнитного поля. Предполагается, что отмеченное снижение двигательной активности подопытных животных может быть следствием снижения выработки АТФ в организме.
Отмечено снижение двигательной активности животных при длительном пребывании в условиях гипогеомагнитного поля (Нахильиицкая З.Н., 1978). При этом обнаружено 30% снижение двигательной активности животных, помещаемых в искусственное, ослабленное до 10"7 Тл магнитное поле. В большом количестве работ выявлено воздействие на кровеносную и иммунную системы. Результаты экспериментов показали, что у крыс содержащихся в течение трех месяцев в металлической камере, обеспечивающей экранирование в 172,5 раза, происходит изменение ряда параметров свертываемости крови; снижение показателя упругости и эластичности кровяного сгустка, уменьшение численности тромбоцитов, изменение геометрических характеристик эритроцитов (Смирнов Р.В., Чулкова Г.Ф., 1991). Отмечено изменение миелограммы у крыс после пребывания в ослабленном 175,5 раза геомагнитном поле в течение 90 суток (АзаренкоВ.В.? Смирнов Р.В., 1991).
Объект исследований и условия постановки эксперимента
Температурному воздействию (70 С в течение 10 минут) крыс подвергали в течение двух недель. Воздействие горячим воздухом производили на оригинальной установке. Животных помещали в камеру из фанеры с крышкой из оргстекла размером 0,6 х 0,4 х 0,22 м. Одновременно там находилось 5-6 крыс. В полу камеры имелось большое количество мелких отверстий диаметром 5 мм, через которые подавался"нагретый воздух от электрокалорифера. В верхней части камеры в стенках были сделаны несколько закрывающихся отверстий диаметром 20 мм для регуляции скорости прохождения воздуха. Температура регулировалась с помощью реле с контактным термометром, к которому был подключен источник тепла. Во всех частях камеры температура воздуха была одинаковая. Температуру в камере измеряли ртутным термометром.
Во второй серии экспериментов животным в мышцы ежедневно вводили растворы гидрокортизона нескольких концентраций: 1, 2, 5 и 10 мкг/кг массы тела в объеме 0,1 мл в течение двух недель.
В третьей серии экспериментов в течение первых 2 недель применяли ежедневное тепловое воздействие. В течение последующих 2 недель ежедневно животные подвергались действию ПМП различной продолжительностью: 30 минут, 60 минут и 3 часа. Общее время продолжительности эксперимента 4 недели.
Для изучения эффекта влияния ПМП на организм животных их содержа-ли в камере из пермаллоя толщиной 1 мм (сваренной из полос шириной 170 мм, которые крепились к алюминиевому каркасу). Ширина, высота и длина камеры равны 0,5 м. Для обеспечения свободного газообмена сверху камера была открыта. Пермаллой обладает способностью экранировать слабые магнитные поля, т. е. значительно снижать их интенсивность. В данном случае существенным свойством данной камеры является экранирование магнитного поля Земли. Кроме этого камера была искусственно намагничена. В соответствии с поставленной задачей магнитное поле в ней было сильно искаженным и неравномерным по величине и направлению. В результате дополнительного намагничивания индукция магнитного поля в разных частях экранирующей камеры варьировала от 0 до 100 мкТл. Градиент индукции составлял от 0 до 5 мкТл/см. Измерение индукции МП проводилось магнитометром однокомпонентним типа МО.
В четвертой серии экспериментов изучали комбинированное влияние однократных инъекций суспензии ГАП, многократного действия ПМП продолжительностью 3 часа и повышенной температуры. ГАП получали из солянокислых растворов после деминерализации компактной костной ткани путем осаждения гидроокисью натрия при значениях рН 12 с добавлением фосфатного буфера (NaiHPO + КН2Р04; ОД М; рН 7,4) (Волова Л.Т., Подковкин ВТ., 2001), Осажденный ГАП высушивали (20 часов 150 С). Полученный препарат содержал Са2+, Mg2"1", РО3", Fe3+ в соотношениях, близких к составу минерального компонента кости. Путем качественного анализа выявлено наличие ионов Zn +, Си +, Mn2+, F (Власов М.Ю., 2003). Суспензии стерильного ГАП в изотопическом растворе хлорида натрия (40 мг/0,2 мл) однократно вводили с помощью одноразового шприца в бедренные мышцы крыс. В течение первых двух недель эксперимента животных подвергали ежедневному воздействию повышенной температуры. Затем вводили суспензии аллогенного ГАП и в течение последующих двух недель каждый день крыс помещали в камеру из пермаллоя на 3 часа. Одну группу животных (ГАП и ПМП 3 часа) подвергали температурному воздействию на протяжении всего эксперимента. Продолжительность эксперимента составила 4 недели.
В пятой серии экспериментов исследовали двухнедельное хроническое влияние ПМП при ежедневном действии повышенной температуры на обменные процессы соединительной ткани крыс.
В шестой серии изучали комбинированное влияние физических факторов, примененных в предыдущей серии эксперимента, и однократных инъекций ГАП на выбранные нами биохимические показатели. Все животные содержались в одинаковых условиях вивария на сбалансированном по жирам, углеводам, белкам и минеральным веществам питании при комнатной температуре. Каждая экспериментальная серия содержала контрольную группу животных, которые не подвергались описанным выше воздействиям,
Объектом исследований являлись кровь, надпочечники, печень и мышечная ткань животных. В экспериментах изучали содержание 1І-ОКС в надпочечниках и плазме, адреналина в надпочечниках, связанного и свободного ок-сипролина в плазме, активность ЩФ, концентрацию неорганического фосфата и Са2+ в сыворотке крови, содержание МДА и активность каталазы, СОД, АлАТ в печени, в селезенке - активность каталазы и СОД.
Для проведения биохимических исследований животных умерщвляли путем декапитации с помощью специально разработанного устройства "гильотины" (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.), У крыс брали кровь, извлекали надпочечники, печень, селезенку.
Кровь для получения плазмы собирали в стакан с 1 мл 5% раствора три-лона-Б, непрерывно перемешивая круговыми движениями, после чего немедленно переливали в мерную центрифужную пробирку и центрифугировали 15 мин. при 3000 об/мин. Количество плазмы и эритроцитов записывали, затем плазму отсасывали и хранили в холодильнике несколько суток. Кровь для получения сыворотки собирали в центрифужную пробирку. После свертывания центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. и хранили в морозильной камере при -18 С.
Надпочечники быстро извлекали, очищали от жировой и соединительной ткани, взвешивали на торсионных весах ВТ-500, измельчали в гомогенизаторе из оргстекла при 5000 об/мин, в 2,5 мл 30% этанола для определения 11-ОКС и в 2,5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты для определения адреналина. Печень и селезенку быстро извлекали, отмывали от крови 0,9 % раствором NaCl, взвешивали, измельчали в стеклянном гомогенизаторе с эбонитовым пестиком при 5000 об/мин. с помощью размельчителя тканей РТ-2 в фосфатном буфере (Na HPC + KH2POv, ОД М; рН 7,4) в отношении веса ткани к буферу 1:5.
Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия
В печени крыс, которым делали инъекции гормонального препарата с концентрацией 1 и 5 мкг/кг, произошло повышение активности каталазы, В первом случае это возможно связано с увеличением содержания МДА в тканях железы. У животных, которым вводили гидрокортизон с концентрацией 2 мкг/кг, напротив, отмечалось снижение активности фермента. Стоит заметить, что в группе крыс, на которую оказывали влияние максимальной дозой гормо нального препарата, изменений изучаемого показателя не обнаружено.
Введение гидрокортизона не оказало существенного влияния на активность другого важного в антноксидантной системе фермента - на активность супероксиддисмутазы. Хотя отмечается тенденция к увеличению количества энзима для протекания реакции окисления адреналина в группе животных, которым делали инъекции гормона с максимальной концентрацией, по сравнению с контролем.
Очевидно, выбранный срок воздействий не достаточен для ярко выраженного на биохимическом уровне усиления процесса резорбции, тогда как нами изучается именно двухнедельный срок воздействия. Поэтому данный способ ускорения разрушения костной ткани не отвечает нашим требованиям.
Одним из перспективных направлений является разработка наиболее оптимальных способов воздействия магнитных и электромагнитных полей на организм с лечебными целями. Поэтому наши исследования были посвящены изучению реакции организма со стороны соединительной ткани на разные по продолжительности воздействия постоянного магнитного поля при тепловом воздействии, вызывающем её еірукгурньїе нарушения. "
Зксперимеїгтьт по исследованию реакции метаболизма костной ткани на ПМП и повышенную температуру проведены на 42 крысах-самцах массой 140-180 г. Для теплового воздействия животные помещались в камеру, куда через отверстия в полу подавался нагретый до 70 С от элекгрокалорифера воздух. Нагрев осуществляли при экспозиции 10 минут ежедневно в течение 2 недель. После завершения теплового воздействия животных помещали в специальную камеру, создающую ПМП, на 30, 60 минут и 3 часа в течение последующих двух недель. Для изучения эффекта влияния ПМП на организм животных их содержали в камере из пермаллоя, описанной в главе 2.1. Вес животные, включая контрольные, которые не подвергались выше перечисленным воздействиям, содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе при комнатной температуре. Воздействие горячего воздуха привело к увеличению содержания свободного оксипролина в плазме крови (Рис. 9Э Приложение 5). Изменения концентрации белковосвязанной формы данной аминокислоты относительно контроля не наблюдались. Соответственно, подобные изменения могут привести к развитию остеопороза при неизменной скорости анаболизма коллагена. При комбинированном влиянии ПМП и тепловой нагрузки статистически значимых изменений свободного оксипролина не выявлено. Отмечалась лишь некоторая тенденция к повышению величины данного показателя. Содержание белковосвязанного оксипролина изменялось волнообразно по группам в зависимости от времени воздействия ПМП, В группах животных, подвергавшихся влиянию ПМП 30 и 60 минут наблюдалось увеличение данно го показателя на 25 % и 21 % соответственно, В группе крыс, которых помеща ли в гипомагнитную камеру на три часа, отмечалось максимальное повышение концентрации белковосвязанного оксипролина на 58 %. Полученные данные свидетельствуют о влиянии ПМП на метаболизм коллагена, сопровождающееся снижением степени его разрушения/- - продолжительности на метаболизм коллагена при тепловом воздействии Примечания: - отличия достоверны по сравнению с контролем (р 0,05). Таким образом, полученные данные свидетельствуют об интенсификации обмена коллагена при применении ПМП после теплового воздействия. Следующим этапом наших исследований было изучение состояния минерального обмена. Достоверных изменений содержания ни кальция, ни неорганического фосфора не было обнаружено (Рис. 10, Приложение 5). Все показатели находились в пределах нормы, т. е, комбинированное влияние ПМП различной продолжительности и действия горячего воздуха не привело к нарушению гомеостаза основных минеральных веществ, входящих в состав соединительной ткани. Наряду с отсутствием изменений содержания свободного кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови также не удалось выявить изменений активности ЩФ у экспериментальных животных. Исключение составила группа крыс, на которых воздействовали ГТМГТ с минимальной продолжительностью, 30 минут. продолжительности на активность ЩФ, содержание кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови при тепловом воздействии Примечания; - отличия достоверны по сравнению с контролем (р 0,05), Отсутствие отклонений содержания свободного и неорганического фосфора свидетельствует об отсутствии развития остеопороза у экспериментальных животных.
Воздействие изолированной гипертермии повышало концентрацию 11-ОКС в надпочечниках на 25 % (Рис. 1Ц Приложение 5). Тогда как у животных, которые находились под влиянием ПМП в течение 60 минут, произошло снижение уровня гормонов, что свидетельствует об угнетении функции надпочечников. В остальных группах крыс изменений уровня кортикостероидов в тканях железы не отмечалось. Параллельно с этим было выявлено существенное уменьшение содержания 11-OKC в плазме в двух группах. У крыс, подвергавшихся только тепловому воздействию, снижение уровня гормонов составило 63 В группе животных, находившихся в условиях экранирования естественного геомагнитного поля по 30 минут в течение двух недель, выявлено уменьшение содержания 11-ОКС в крови на 44%. В остальных группах комбинированное воздействие не приводило к существенному изменению данного показателя.
