Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Ротовая жидкость как объект исследования в клинике и эксперименте 10
1.2. Неинвазивная диагностика в педиатрии 29
Глава 2. Объекты и методы исследований 34
2.1. Общая характеристика обследованных детей 34
2.2. Методы исследования ротовой жидкости и крови 35
2.3. Статистическая обработка результатов исследований 40
Глава 3. Аналитические подходы к изучению показателей метаболизма ротовой жидкости 41
3.1. Выбор оптимального режима пробоподготовки ротовой жидкости на преаналитическом этапе: оценка влияния температуры, длительности хранения, условий центрифугирования 41
3.2. Аналитическая надежность биохимических методов исследования... ротовой жидкости 47
3.2.1. Оценка сходимости результатов (внутрисерийная воспроизводимость) 48
3.2.2. Оценка воспроизводимости измерений 51
3.2.3. Оценка чувствительности измерений 53
Глава 4. Показатели метаболизма в ротовой жидкости детей в разные возрастные периоды 56
4.1. Физико-химические параметры ротовой жидкости детей в разные... возрастные периоды 56
4.2. Параметры белкового обмена в ротовой жидкости 60
4.3. Показатели углеводного и липидного обмена в ротовой жидкости...71
4.4. Показатели минерального обмена в ротовой жидкости детей 79
4.5. Взаимосвязь параметров метаболизма в ротовой жидкости и с гематологическими показателями 91
Глава 5. Метаболические и физико-химические показатели ротовой жидкости у детей, больных инсулинозависимым сахарным диабетом 98
5.1 Оценка теста толерантности к глюкозе в крови и ротовой жидкости здоровых детей 98
5.2. Параметры ротовой жидкости у детей при сахарном диабете 101
5.3. Гематологические показатели детей, больных сахарным диабетом.. 125
Заключение 129
Выводы 144
Практические рекомендации 146
Список литературы 147
- Неинвазивная диагностика в педиатрии
- Статистическая обработка результатов исследований
- Оценка сходимости результатов (внутрисерийная воспроизводимость)
- Взаимосвязь параметров метаболизма в ротовой жидкости и с гематологическими показателями
Введение к работе
Актуальность темы. Трудности в получении крови у детей и широкое распространение трансмиссивных заболеваний обуславливают актуальность исследований, направленных на научное обоснование целесообразности внедрения новых неинвазивных методов диагностики в педиатрии (Sreebny L. М., 2000). В этом плане интересным объектом для изучения является ротовая жидкость.
Ротовая жидкость обращает внимание исследователей доступностью получения в практически не ограниченном количестве в физиологических условиях (Меньшиков В.В. 1994., Jurjus A. et al.., 1999, Денисов А.Б., 2003).
Получены данные о закономерностях функционировании слюнных желез, об изменении состава и физико-химических свойствах смешанной слюны при стоматологической (Вавилова Т.П. с соавт., 1995; Воложин А.И. с соавт., 1997, 2000, 2001; Грудянов А.И., 1997,1998; Леонтьев В.К.с соавт. 1996, 1999; Соловьева A.M., 2000; Бережной В.П. с соавт., 1999, 2003; Гильмияров Э.М., 2003; Денисов А.Б., 2003) и соматической патологии (Терехина Н.А. с соавт., 1995; Herzog A.G. et al., 2001). Исследованиями последних лет выявлен параллелизм изменений параметров метаболизма в крови и ротовой жидкости при ряде заболеваний (Григорьев И.В. 1998,2000). Сведения об изменении состава ротовой жидкости у детей представлены в единичных работах, согласно которым состав ротовой жидкости имеет некоторые особенности, обусловленные возрастными отличиями метаболизма, эндокринной регуляцией, влиянием комплекса экологических факторов (Гильмиярова Ф.Н. с соавт., 2004).
В настоящее время отсутствуют нормативные данные о составе ротовой жидкости в различные возрастные периоды, нет законодательно оформленных правил сбора и хранения, отсутствуют наборы реактивов для исследования в ротовой жидкости большинства аналитов, за исключением
5 наборов фирмы IBL (Hamburg) для определения содержания стероидных гормонов.
Цель настоящего исследования заключается в обосновании аналитической надежности и диагностической информативности изучения показателей метаболизма в ротовой жидкости у детей.
Задачи:
Отработать условия преаналитического этапа при исследовании ротовой жидкости.
Оценить аналитическую надежность биохимических методов, предлагаемых для определения параметров метаболизма в ротовой жидкости.
Определить в ротовой жидкости детей в разные возрастные периоды показатели обмена: содержание общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, холестерина, триглицеридов, билирубина, кальция, фосфора, железа, натрия, калия, хлоридов, магния, активность аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрансферазы, а-амилазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, значение тимоловой пробы.
Изучить физико-химические параметры ротовой жидкости в разные возрастные периоды детства и при сахарном диабете.
Оценить возможность проведения глюкозотолерантного теста у детей по определению содержания глюкозы в ротовой жидкости.
Исследовать показатели белкового, углеводного, липидного и минерального обменов в ротовой жидкости у детей, больных инсулинозависимым сахарным диабетом с учетом уровня гликемии.
Провести корреляционный анализ между параметрами метаболизма в ротовой жидкости и гематологическими показателями.
Научная новизна. На большом экспериментальном и клиническом материале аргументирована диагностическая информативность оценки состояния организма по показателям ротовой жидкости, что раскрывает широкие возможности для неинвазивной диагностики.
Новыми являются результаты оценки аналитической надежности методов биохимического анализа ротовой жидкости путем проверки сходимости, воспроизводимости, аналитической чувствительности. Определены оптимальные условия пробоподготовки образцов ротовой жидкости для биохимических и физико-химических исследований.
Впервые получены данные, характеризующие состав и свойства ротовой жидкости у клинически здоровых детей в разные возрастные периоды с определением широкого спектра метаболических показателей углеводного, белкового, липидного, минерального обменов, и физико-химических параметров: скорости саливации и водородного показателя.
Впервые при проведении глюкозотолерантного теста у здоровых детей получены данные об однотипной динамике содержания глюкозы в ротовой жидкости и крови.
В ротовой жидкости детей, больных инсулинозависимым сахарным диабетом, обнаружено повышение уровня глюкозы в ротовой жидкости. В фазу декомпенсации отмечено уменьшение содержания холестерина, железа, повышение содержания кальция и активности а-амилазы.
Блок данных о составе, физико-химических свойствах, метаболических характеристиках ротовой жидкости у детей может служить научной базой для широкого использования саливодиагностики в педиатрии.
Научно-практическая значимость. Результаты, полученные при проведении исследований, имеют теоретическое и практическое значение.
Определены оптимальные условия сбора, центрифугирования и хранения проб ротовой жидкости у детей, что способствует повышению качества исследований. Хорошая воспроизводимость, чувствительность
7 методов биохимического анализа свидетельствует об их аналитической надежности.
Полученные результаты исследования ротовой жидкости здоровых детей трех возрастных групп могут служить основой для выработки референтных пределов для биохимических показателей в разные периоды детства.
Показана информативность оценки теста толерантности к глюкозе по анализу ее содержания в ротовой жидкости, поскольку динамика концентрации этого метаболита в крови и ротовой жидкости однотипна. Это расширяет возможности ранней неинвазивнои диагностики скрытого сахарного диабета у детей при скрининговых исследованиях.
Перспективно проводить мотиторинг эффективности лечения и
адекватности подбора дозы инсулина при инсулинзависимом сахарном
диабете у детей по изучению показателей ротовой жидкости. Дополнены
критерии степени тяжести инсулинозависимого диабета по скорости
саливации, содержанию в ротовой жидкости глюкозы, альбумина,
билирубина, активности аминотрансфераз, характеризующих
функциональное состояние печени.
Положения, выносимые на защиту:
Обоснование аналитической надежности, выбор оптимального режима пробоподготовки образцов ротовой жидкости при определении показателей углеводного, белкового, липидного и минерального обмена.
Динамика показателей ротовой жидкости у клинически здоровых детей в разные периоды детского возраста. В 3-5 лет отмечается наиболее высокое содержание глюкозы, холестерина, триглицеридов, кальция, магния, железа, билирубина, значения тимоловой пробы. В 5-7 лет наблюдаются наиболее высокое содержание альбумина, активность аспартатаминотрансферазы, скорость саливации. В 9 - 12 лет отмечены
максимальные значения содержания мочевины, мочевой кислоты,
креатинина, хлоридов, активности а-амилазы, лактатдегидрогеназы.
В разные возрастные периоды детства содержание общего белка,
натрия, калия, фосфора, значение рН колеблется в одинаковых
пределах.
3. Расширение возможности ранней неинвазивной диагностики сахарного
диабета. Информативность проведения теста толерантности к глюкозе
по определению содержания глюкозы в ротовой жидкости на
основании однотипной динамики ее концентрации в крови и ротовой
жидкости. Мониторинг эффективности лечения при
инсулинозависимом сахарном диабете у детей по определению уровня
глюкозы в ротовой жидкости. Возможность оценки тяжести
заболевания по содержанию в ротовой жидкости глюкозы, альбумина,
билирубина, активности аспартатаминотрансферазы, значению
тимоловой пробы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на
Межрегиональной научно-практической конференции «Новая идеология в
единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005),
Всероссийской конференции «Современные проблемы охраны труда и
здоровья работающих женщин» (Самара, 2005), VI Международной
научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке»
(Москва, РУДН, 2005), X Международной научной конференции
«Здоровье семьи - 21 век» (Бангкок-Паттайя, 2006), VIII Российском
Съезде травматологов-ортопедов «Травматология и ортопедия XXI века»
(Самара, 2006), VII Международной научно-практической конференции
«Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, РУДН, 2006), совместном
заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического
общества, Ассоциации медицинской лабораторной диагностики, кафедр
общей, бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной
9 и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2006).
Внедрение результатов в практику. Результаты исследований используются в работе клинико-диагностической лаборатории Клиник Самарского государственного медицинского университета, клинико-диагностической лаборатории 118 детской городской поликлиники Юго-западного административного округа г. Москвы, Клинической больницы Управления делами Президента РФ г. Москвы, в учебном процессе на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Публикации. Всего опубликовано 11 работ все по теме диссертации, в том числе одна монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию объектов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.
Диссертация изложена на 171 страницах, иллюстрирована 21 рисунком,
содержит 32 таблицы. В работе использовано 233 источника, из них 106
отечественных и 127 зарубежных авторов.
Неинвазивная диагностика в педиатрии
Благодаря успехам в области фундаментальных наук, эффективности междисциплинарного взаимодействия, широкому внедрению высоких технологий в диагностический процесс, сложились предпосылки для пересмотра роли ротовой жидкости в процессах жизнедеятельности организма и использования ее диагностического потенциала (Вавилова Т.П. с соавт., 1988, 1995; Петрович Ю.А. с соавт., 1995; Денисов А.Б., 2003; Hofman L.F, 2001; Humphrey S.P., Williamson R.T, 2001).
Рост заболеваемости гемотрансмиссивными социально опасными инфекциями, такими как ВИЧ, гепатит В, С и другими, делают остро необходимым поиск новых, неинвазивных и безопасных методов диагностики и контроля состояния пациентов. В этом отношении анализ ротовой жидкости представляет собой одну из наиболее значительных альтернатив анализу крови, в ряде случаев не только дополняя, но даже заменяя его. Возрастает актуальность использования ротовой жидкости для проведения скриннинга врожденных, приобретенных заболеваний неинвазивным путем, что особенно важно для детского контингента обследуемых. Это поможет решать как санологические, так и валеологические задачи. Сведения о показателях метаболизма в ротовой жидкости у детей представлены в единичных работах (Кирюхина С.Л., 1968; КухтаС.И., 1975;РединоваТ.Л., 1989).
М.Н.Кузнецова с соавт. (1995) исследовали содержание электролитов в слюне детей из экологически благополучного и неблагоприятного регионов. Обнаружено, что в слюне дошкольников, проживающих в районе химических заводов, достоверно выше уровень натрия и хлора, в то время как по содержанию калия и ионизированного кальция различий не выявлено. С возрастом содержание ионов натрия, калия и хлора в слюнном секрете повышается пропорционально увеличению количества удаленных зубов (Денисов А.Б. с соавт., 1999).
Физические упражнения снижают активность свободных радикалов в цельной слюне детей (Atsumi Т. et al., 1999). У взрослых содержание свободных радикалов и активных форм кислорода в слюне не зависит от возраста и пола. В то же время у детей в возрасте 4-11 лет обнаружены значительные колебания в содержании свободных радикалов до и после танцев в течение часа.
Показано, что в слюне детей, находящихся на грудном вскармливании, в два раза выше содержание сиаловых кислот, чем в ротовой жидкости детей, получавших искусственные смеси (Wang В. et al., 2001). По мнению авторов, высокая концентрация сиаловых кислот в слюне способствует повышению ее вязкости и защищает слизистую оболочку полости рта.
Изучение биохимических параметров смешанной слюны можно использовать в качестве тестов для определения тяжести воспалительно-деструктивного процесса в тканях пародонта и осуществления контроля за правильностью выбора лечения. Так, болгарские ученые в 1988 при обследовании 26 подростков в возрасте 15-17 лет с катаральной формой гингивита и начальной степенью воспалительно-деструктивного заболевания пародонта выявили повышение активности щелочной фосфатазы и содержания лактата в зависимости от тяжести воспалительного процесса в пародонте.
Изучение активности ферментов обмена аминокислот и оксидоредуктаз в смешанной слюне детей разного возраста показало, что развитие кариеса и гингивита сопряжено с изменением активности этих ферментов, зависящим как от вида заболевания, так и от возраста детей. По данным А.П.Левицкого (2000) при кариесе и гингивите количество магния в слюне у детей снижено. В.К.Леонтьев (1996) обнаружил достоверное повышение содержание общего кальция в слюне при кариесе. Это согласуется с данными В.М.Елизаровой и Ю.А.Петровича (1997). У детей 4-12 лет при кариесе в слюне увеличивается концентрация как общего, так и ионизированного кальция, в то время как в крови, только ионизированного. При этом уровень неионизированного кальция в слюне снижался; в сыворотке крови изменения его были незначительными. При обследовании 473 итальянских школьников в 9 и 13-летнем возрасте установлена положительная корреляционная зависимость между содержанием Streptococcus mutans и уровнем лактобактерий в ротовой полости и между микробной инвазией обоих типов и распространенностью кариеса (Brambilla E.etal., 1999).
У детей 8-12 лет (США) определяли содержание тестостерона в слюне с помощью высоко чувствительного метода с минимальным пределом обнаружения 0,8 пг/мл, с хорошей воспроизводимостью, коэффициент вариации 3,6 - 6, 8 % при концентрациях от 9,25 до 86,41 пг/мл. Показано, что между содержанием гормонов в сыворотке крови и слюне и в детском возрасте имеется высокая линейная корреляционная зависимость (Granger D.A. etall., 1999).
С помощью исследования гормонов в ротовой жидкости обследованы дети в возрасте от 6 до 9 лет с признаками преждевременного полового созревания. По сравнению со здоровыми детьми в группе детей с ранним семяизвержением имелись значительно более высокие концентрации надпочечного андрогена, эстрадиола, тиротропина и кортизола в сыворотке крови и слюне (Dorn L.D. etall., 1999).
Обнаружено, что у детей, проживающих в городе с развитой химической промышленностью, в крови уровень тиреотропного гормона находился в пределах нормы (0,85 - 6,5 мЕд/л), при этом среднее содержание свободных Т4 и ТЗ было ниже референтных пределов, что свидетельствует о тенденции к гипотиреозу. В ротовой жидкости показатель Т-захвата у детей был близок к уровню у взрослых, что свидетельствует о функциональной полноценности тироксинсвязывающего глобулина. Содержание общего и свободного трийодтиронина в ротовой жидкости было выше, чем в сыворотке крови. По мнению авторов, это связано с высокой активностью в тканях зубочелюстной области ферментов дейодиназ, превращающих Т4 в ТЗ. Физиологический смысл накопления активных тиреоидных гормонов в ротовой жидкости детей дошкольного возраста, связывалось с необходимостью обеспечения метаболических процессов в тканях пародонта на уровне, достаточном для смены молочных зубов.
Статистическая обработка результатов исследований
Результаты биохимического исследования состава ротовой жидкости, оцениваемый в процессе лабораторного анализа, могут зависеть от широкого спектра факторов, к числу которых относятся (Мошкин А.В., Долгов В.В., 2004): подготовка пациента; методика сбора ротовой жидкости; центрифугирование; условия хранения и транспортировки ротовой жидкости; аналитическая надежность методов анализа.
В задачу настоящего исследования входила разработка оптимальных методик сбора, центрифугирования, хранения ротовой жидкости и выбор аналитически надежных методов исследования.
Общим правилом для всех видов проб является требование как можно быстрее отцентрифугировать полученный материал. Центрифугированию подвергается различный материал, поэтому эта процедура должна быть строго стандартизирована и изложена в виде инструкции, в которой отражают тип центрифуги, длительность центрифугирования, величину центробежной силы. При центрифугировании ротовая жидкость разделяется на супернатант и осадок, состоящий из муцинов. Качество исследования данной биологической жидкости зависит напрямую от полученного супернатанта.
При выборе оптимальных условий центрифугирования ротовой жидкости было проведено исследование зависимости концентрации глюкозы от длительности центрифугирования и скорости центрифугирования (табл. 1). Для исследования зависимости содержания глюкозы от условий центрифугирования, полученный образец ротовой жидкости, тщательно перемешивали и разливали по пробиркам. Одну пробирку, где измеряли исходную концентрацию глюкозы, не центрифугировали. Другие 6 пробирок с образцами ротовой жидкости центрифугировали при 3000 и 5000 оборотов в минуту в течение 10, 20 и 30 минут. В образце ротовой жидкости и полученном супернатанте определяли содержание глюкозы глюкозооксидазным методом в количестве 20 измерений, результаты исследования обрабатывали с помощью программы Статистика 6.0. Анализируя полученные данные, можно сделать следующий вывод: с увеличением скорости и времени центрифугирования, содержание глюкозы в ротовой жидкости уменьшается по сравнению с исходной концентрацией; содержание глюкозы в ротовой жидкости после центрифугирования при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут достоверно не отличается от исходной концентрации.
Согласно полученным результатам, оптимальными условиями центрифугирования при определении содержания глюкозы в ротовой жидкости, при которых уровень глюкозы не отличается от исходного, являются:
- количества оборотов в минуту - 3000 об/мин;
- длительность центрифугирования - 10 мин.
Большое влияние на качество результатов анализов оказывает время, прошедшее с момента подготовки биоматериала к исследованиям до их непосредственного выполнения (В.В.Меньшиков, 2005). Известно, что от 50 до 70 % лабораторного времени уходит на подготовку к исследованиям биоматериала.
Для определения времени, в течение которого концентрация глюкозы в ротовой жидкости стабильна, проведено исследование концентрации глюкозы через 3, 6 и 24 часа после получения ротовой жидкости (табл. 2). Таблица 2
Зависимость концентрации глюкозы в ротовой жидкости от времени проведения анализов после получения ротовой жидкости
Технология проведения исследования следующая: после получения образца ротовой жидкости, его центрифугировали и разливали по 4 пробиркам. В первой пробирке содержание глюкозы определяли сразу, другие 3 пробирки ставили на хранение в холодильник при +3 С на 3, 6 и 24 часа, затем определяли концентрацию глюкозы. Данные исследования обработали с помощью программы Статистика 6.0 и рассчитали коэффициент вариации для каждой серии исследований.
Полученные данные, отраженные в таблице, свидетельствуют о том, что концентрация глюкозы ротовой жидкости стабильна в течение 3 часов после получения и достоверно снижается после 6 часов хранения в холодильнике. После 24 часов хранения в холодильнике содержание глюкозы снизилось на 13 % (р 0,05).
Для получения качественных результатов исследования должно быть стандартизированы не только сбор ротовой жидкости, условия центрифугирования и время хранения, но и температура хранения проб ротовой жидкости. В настоящее время техническая оснащенность лабораторий не везде достигла современного уровня и остается актуальным вопрос хранения биоматериала в морозильных камерах. Мы провели исследования зависимости содержания глюкозы в образце ротовой жидкости от температуры хранения.
Технология проведения данного исследования следующая: после получения образца ротовой жидкости, его тщательно перемешали и разлили по 4 пробиркам. В первой пробирке исследовали содержания глюкозы сразу после получения, выполнено 20 измерений. Следующие 3 пробирки из 20 образцов поставили на 24 часа на хранение при разных температурных режимах: +5С, -ЮС, -20С. Через сутки измерили содержание глюкозы в образцах ротовой жидкости. Результаты обработали с помощью программы Статистика 6.0. и рассчитали коэффициент вариации. Результаты исследования представили в таблице 3.
Оценка сходимости результатов (внутрисерийная воспроизводимость)
Результаты биохимического исследования состава ротовой жидкости, оцениваемый в процессе лабораторного анализа, могут зависеть от широкого спектра факторов, к числу которых относятся (Мошкин А.В., Долгов В.В., 2004): подготовка пациента; методика сбора ротовой жидкости; центрифугирование; условия хранения и транспортировки ротовой жидкости; аналитическая надежность методов анализа.
В задачу настоящего исследования входила разработка оптимальных методик сбора, центрифугирования, хранения ротовой жидкости и выбор аналитически надежных методов исследования.
Общим правилом для всех видов проб является требование как можно быстрее отцентрифугировать полученный материал. Центрифугированию подвергается различный материал, поэтому эта процедура должна быть строго стандартизирована и изложена в виде инструкции, в которой отражают тип центрифуги, длительность центрифугирования, величину центробежной силы. При центрифугировании ротовая жидкость разделяется на супернатант и осадок, состоящий из муцинов. Качество исследования данной биологической жидкости зависит напрямую от полученного супернатанта.
При выборе оптимальных условий центрифугирования ротовой жидкости было проведено исследование зависимости концентрации глюкозы от длительности центрифугирования и скорости центрифугирования (табл. 1). Для исследования зависимости содержания глюкозы от условий центрифугирования, полученный образец ротовой жидкости, тщательно перемешивали и разливали по пробиркам. Одну пробирку, где измеряли исходную концентрацию глюкозы, не центрифугировали. Другие 6 пробирок с образцами ротовой жидкости центрифугировали при 3000 и 5000 оборотов в минуту в течение 10, 20 и 30 минут. В образце ротовой жидкости и полученном супернатанте определяли содержание глюкозы глюкозооксидазным методом в количестве 20 измерений, результаты исследования обрабатывали с помощью программы Статистика 6.0. Анализируя полученные данные, можно сделать следующий вывод: с увеличением скорости и времени центрифугирования, содержание глюкозы в ротовой жидкости уменьшается по сравнению с исходной концентрацией; содержание глюкозы в ротовой жидкости после центрифугирования при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут достоверно не отличается от исходной концентрации.
Согласно полученным результатам, оптимальными условиями центрифугирования при определении содержания глюкозы в ротовой жидкости, при которых уровень глюкозы не отличается от исходного, являются:
- количества оборотов в минуту - 3000 об/мин;
- длительность центрифугирования - 10 мин.
Большое влияние на качество результатов анализов оказывает время, прошедшее с момента подготовки биоматериала к исследованиям до их непосредственного выполнения (В.В.Меньшиков, 2005). Известно, что от 50 до 70 % лабораторного времени уходит на подготовку к исследованиям биоматериала.
Для определения времени, в течение которого концентрация глюкозы в ротовой жидкости стабильна, проведено исследование концентрации глюкозы через 3, 6 и 24 часа после получения ротовой жидкости (табл. 2). Таблица 2
Зависимость концентрации глюкозы в ротовой жидкости от времени проведения анализов после получения ротовой жидкости
Технология проведения исследования следующая: после получения образца ротовой жидкости, его центрифугировали и разливали по 4 пробиркам. В первой пробирке содержание глюкозы определяли сразу, другие 3 пробирки ставили на хранение в холодильник при +3 С на 3, 6 и 24 часа, затем определяли концентрацию глюкозы. Данные исследования обработали с помощью программы Статистика 6.0 и рассчитали коэффициент вариации для каждой серии исследований.
Полученные данные, отраженные в таблице, свидетельствуют о том, что концентрация глюкозы ротовой жидкости стабильна в течение 3 часов после получения и достоверно снижается после 6 часов хранения в холодильнике. После 24 часов хранения в холодильнике содержание глюкозы снизилось на 13 % (р 0,05).
Для получения качественных результатов исследования должно быть стандартизированы не только сбор ротовой жидкости, условия центрифугирования и время хранения, но и температура хранения проб ротовой жидкости. В настоящее время техническая оснащенность лабораторий не везде достигла современного уровня и остается актуальным вопрос хранения биоматериала в морозильных камерах. Мы провели исследования зависимости содержания глюкозы в образце ротовой жидкости от температуры хранения.
Технология проведения данного исследования следующая: после получения образца ротовой жидкости, его тщательно перемешали и разлили по 4 пробиркам. В первой пробирке исследовали содержания глюкозы сразу после получения, выполнено 20 измерений. Следующие 3 пробирки из 20 образцов поставили на 24 часа на хранение при разных температурных режимах: +5С, -ЮС, -20С. Через сутки измерили содержание глюкозы в образцах ротовой жидкости. Результаты обработали с помощью программы Статистика 6.0. и рассчитали коэффициент вариации. Результаты исследования представили в таблице 3.
Сходимость измерений - качество измерений, отражающие близость друг к другу результатов 10 или 20 контрольных определений, выполненных в одинаковых условиях (за один день, одним методом, одними руками) из одного и того же материала (разброс результатов в серии) (Денисова О.В., 2003).
Это может быть материал с неизвестным содержанием, т.к. сравнение результатов контрольных определений идет между собой, а не с истинным значением. Для оценки сходимости результатов использовали ротовую жидкость здорового пациента, которую получили методом сплевывания, центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин. Результаты 20 измерений содержания общего белка, определяемого биуретовым методом, представлены в таблицах 4 и 5.
Рассчитанный коэффициент вариации (CV) по результатам 20 измерений в первой серии составил 1,33. Рассчитанный коэффициент вариации (CV) по результатам 20 измерений во второй серии составил 1,45. CV табличное для общего белка в сыворотке крови равен 3 (Приказ № 45 МЗ РФ от 07.02.2000г.).
Для анализа сходимости результатов за день CV рассчитанное должно быть меньше или равно Уг CV табличного. (Приказ № 220 МЗ РФ от 26. 05. 2003г.).
В первой серии CV рассчитанное (1,33) Уг CV табличного (1,5). Во второй серии CV рассчитанное (1,45) Уг CV табличного (1,5), что свидетельствует о хорошей сходимости результатов исследований содержания общего белка в ротовой жидкости, выполняемых биуретовым методом. 3.2.2. Оценка воспроизводимости измерений
Воспроизводимость измерений - соответствие результатов повторных измерений в одном и том же материале, выполненных в различных условиях (в разное время, разными руками), т.е. в разных аналитических сериях. Чем меньше коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость результатов (Меньшиков В.В., 2002).
Для оценки воспроизводимости приготовили слитую ротовую жидкость. Ротовую жидкость собрали одновременно у 20 здоровых пациентов, смешали ее и отцентрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Далее разлили по стеклянным пробиркам и заморозили при - 20С в морозильной камере. Определяли содержание мочевины уреазным методом в 20 аналитических сериях в течение 3 недель, сомнительные результаты выбраковали. Результаты измерений представили в таблице с построением контрольной карты (таблица 6). Рассчитывали Хер, S и CV. Рассчитанный коэффициент вариации для мочевины ротовой жидкости составил 2,44. Табличное значение CV для мочевины сыворотки крови равно 10 (Приказ № 45 МЗ РФ от 07.02.2000г.).
Таким образом, CV рассчитанное для мочевины ротовой жидкости (2,44) меньше CV табличного для мочевины сыворотки крови (10), что свидетельствует о хорошей воспроизводимости результатов исследования содержания мочевины в ротовой жидкости, выполненных уреазным методом.
Оценку проводили по правилам Вестгарта. 3.2.3. Оценка чувствительности измерений
Аналитическая чувствительность метода - это способность метода выявлять наименьшее количество анализируемого вещества, которое еще можно определить, т. е. отличить от нуля. Нижний предел чувствительности аналитического метода характеризуется концентрацией анализируемого компонента, которая соответствует наименьшему результату измерений. Известно, что концентрация метаболитов в сыворотке крови, как правило, значительно выше, чем в ротовой жидкости, поэтому методы определения метаболитов в ротовой жидкости должны быть высокочувствительными (Денисова О.В.,2003).
Для проверки чувствительности глюкозооксидазного метода определения глюкозы в ротовой жидкости рассчитывали предел нижней чувствительности метода. Для этого были приготовлены растворы следующих концентраций глюкозы: 1) 0,27 ммоль/л, 2) 0,13 ммоль/л, 3) 0,07 ммоль/л, 4) 0,03 ммоль/л, 5) 0,01 ммоль/л. Готовые растворы глюкозы прибавляли к образцу ротовой жидкости с исходной концентрацией глюкозы 0,40 ммоль/л. Данные статистически обрабатывали и результаты исследований представили в таблице 3.2.4., где XI соответствует исходной концентрации; Х2 - сумме исходной концентрации и прибавляемой, равной 0,27 ммоль/л; ХЗ - сумме исходной концентрации и прибавляемой, равной 0,13 ммоль/л; Х4 - сумме исходной концентрации и прибавляемой, равной 0,07 ммоль/л; Х5 - сумме исходной концентрации и прибавляемой, равной 0,03 ммоль/л; Х6 - сумме исходной концентрации и прибавляемой, равной 0,015 ммоль/л.
Взаимосвязь параметров метаболизма в ротовой жидкости и с гематологическими показателями
Гематологические показатели обследуемых детей I, II и III групп представлены в таблице 19. Примечание: RBC - эритроциты; НОВ -гемоглобин; гематокрит - НСТ; MCV - средняя величина объема эритроцитов; МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроците; МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроците; RDW - средний диаметр эритроцитов; СОЭ - скорость оседания эритроцитов; PLT - тромбоциты; MPV - средний объем тромбоцитов.
Достоверно увеличилось количество эритроцитов в III возрастной группе детей (9-12 лет), оно составило 4,8 ± 0,1х1012 г/л; 95% интервал 4,6-5,0 хЮ12 г/л, по сравнению со II группой детей, где количество эритроцитов было 4,45 ± 0,07x1012 г/л; 95% интервал 4,3-4,6x1012 г/л.
Отмечено также изменения таких показателей, как: МСН и МСНС. Особенно выражено снижение МСНС (средней концентрации гемоглобина в эритроците) с 39,8 ± 0,6 во II группе детей (5-7 лет) до 34 ± 0,2 в III группе детей (9-12 лет). Значение МСН, незначительно снижается в III группе детей и составляет 28,5 ± 0,3 по сравнению со значением МСН во II группе детей, где оно было 30,7 ± 0,4.
Полученные гематологические данные обследуемых детей I, II и III групп входят в референтные возрастные пределы (Лившиц В.М., 2004).
Нами были проанализированы корреляционные связи между гематологическими показателями и биохимическими показателями ротовой жидкости. Данные представлены в таблице 20.
Выявлена зависимость количества лейкоцитов от концентрации калия, альбумина и фосфора в ротовой жидкости. Обращает внимание сильная положительная связь количества лейкоцитов и содержания калия ротовой жидкости (R = 0,71).
Обнаружена умеренная отрицательная связь количества эритроцитов и содержания триглицеридов ротовой жидкости (R = 0,69), а также зависимость количества эритроцитов от концентрации калия, кальция и натрия. Обращает внимание отрицательная связь между количеством эритроцитов и концентрацией калия, кальция и положительная связь между количеством эритроцитов и другим электролитом - натрием.
Величина гемоглобина связана с содержанием таких показателей минерального обмена ротовой жидкости как: натрий, железо и кальций. Причем величина гемоглобина положительно связана от концентрации натрия в ротовой жидкости и отрицательно от концентрации кальция.
Обнаружена умеренная отрицательная корреляция величины гемоглобина крови и концентрации мочевины в ротовой жидкости.
Поэтому, диагностическое значение гематокрита аналогично диагностическому значению величины эритроцитов в крови.
Обнаружены сильная отрицательная связь значения НСТ с содержание мочевины (R = 0,76, р 0,05), а также умеренная отрицательная связь значения гематокрита с концентрацией кальция (R - 0,60, р 0,05).
Значение MCV (средний объем эритроцитов) имеет корреляционные связи:
- с концентрацией общего белка (R = - 0,81, р 0,05);
- с концентрацией триглицеридов (R - 0,65, р 0,05);
- с концентрацией глюкозы (R = 0,64, р 0,05).
Нами обнаружены корреляционные зависимости значения МСН (среднее содержание гемоглобина в эритроците):
- сильная положительная связь с содержанием глюкозы (R - 0,83, р 0,05);
- сильная положительная связь с концентрацией билирубина (R = 0,72, р 0,05);
- умеренная отрицательная связь с концентрацией альбумина (R = 0,68, р 0,05);
- умеренная отрицательная связь с содержанием калия (R - 0,65, р 0,05).
МСНС характеризует среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, определяет насыщенность эритроцитов кислородом. Значение МСНС можно использовать при оценке нарушений водно-электролитной системы. Выявлены следующие зависимости значения МСНС: - сильная отрицательная связь с содержанием хлоридов (R = 0,71, р 0,05).
- умеренная отрицательная связь с содержанием натрия (R = 0,62, Р 0,05);
- умеренная положительная связь с концентрацией железа (R = 0,61, Р 0,05);
- умеренная отрицательная связь с концентрацией триглицеридов (R = 0,56, р 0,05);
МСНС коррелирует со значениями MCV и МСН, т. к. значения этих параметров зависят от значения гемоглобина, количества эритроцитов и величины гематокрита.
