Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярный водород занимает важное место в метаболизме бактерий и некоторых эукариотических микроорганизмов. H2 может использоваться как источник энергии при дыхании, как донор электронов при фотосинтезе и в процессе метаногенеза. При брожении H2 часто является конечным продуктом. Кроме того, выделение H2 может регулировать уровень восстановленности пула пиридиннуклеотидов при разных типах питания. Выделение водорода в процессе азотфиксации катализируется нитрогеназами, в остальных случаях поглощение и выделение водорода катализируется гидрогеназами. Несмотря на то, что H2 является простейшей молекулой, оказалось, что для каждого типа метаболизма бактерии синтезируют отдельную гидрогеназу, имеющую свои структурные гены и механизмы регуляции (Vignais et al., 2007). Поэтому бактерии, способные к росту за счет разных типов питания с участием H2, как правило, синтезируют несколько гидрогеназ.
Пурпурная серная бактерия Thiocapsa roseopersicina BBS способна расти в фотоавтотрофных и хемолитоавтотрофных условиях с использованием H2, фиксировать молекулярный азот и осуществлять брожение с выделением водорода (Кондратьева и др., 1981). Поэтому неудивительно, что T. roseopersicina синтезирует, по крайней мере, 4 различных гидрогеназы, выполняющих разные функции (Rakhely et al., 2004, 2007; Maroti et al., 2010).
Одной из первых гидрогеназ, выделенных из пурпурных бактерий, была HydSL-гидрогеназа T. roseopesicina (Гоготов и др., 1976). Оказалось, что это удивительно стабильный фермент, имеющий температурный оптимум около 80оС, способный к активации молекулы H2 в присутствии О2 (Morozov et al., 2006). По сравнению с платиной этот фермент более устойчив к воздействию таких каталитических ядов, как H2S и CO (Зорин и др., 1986). Единственной обнаруженной к настоящему времени функцией этого фермента является участие в восстановлении серы, в соответствии с уравнением: H2 + S0 = H2S (Laurinavichene et al., 2007).
В то же время мало известно не только о причинах термостабильности и устойчивости к кислороду HydSL гидрогеназы, но также о структуре и механизме её действия. Поскольку этот фермент является гетеродимерным Ni-Fe металлоферментом с несколькими кластерами, его сборка и созревание представляют сложный и неизученный процесс и, судя по всему, не все вспомогательные гены к настоящему моменту известны (Weyman et al., 2011).
Показано, что HydSL гидрогеназа является перспективным ферментом для создания водородных электродов как в качестве сенсора, так и для использования в топливных элементах без благородных металлов (Karyakin et al., 2007).
Таким образом, разработка подходов к изучению и целенаправленной модификации свойств указанной гидрогеназы представляется необходимой как в научном, так и в практическом отношении.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка генетических подходов для изучения HydSL гидрогеназы пурпурной серной бактерии T. roseopersicina.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработка генетической системы для модификации HydSL-гидрогеназы T roseopersicina BBS как в геноме, так и на плазмиде, автономно реплицирующейся в данной бактерии;
- создание генетической основы для изучения синтеза HydSL-гидрогеназы при гетерологичной экспрессии структурных генов на плазмиде в клетках E. coli и роли вспомогательных генов в этом процессе;
- создание штамма T. roseopersicina, несущего в геноме модифицированную вставкой 6His-метки субъединицу HydS гидрогеназы HydSL, и изучение свойств полученного двухсубъединичного фермента;
- модификация штамма T. roseopersicina GB11, не несущего структурных генов HydSL-гидрогеназы, плазмидой с геном субъединицы HydL, модифицированным вставкой 6His-метки;
- конструирование и тестирование вырожденных праймеров для поиска структурных генов HydSL-, HoxYH и HupSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.
Научная новизна. Создана генетическая система модификации генов HydSL-гидрогеназы T. roseopersicina BBS, локализованных как в геноме, так и на поддерживающейся в клетках бактерий плазмиде. С использованием этой системы впервые получен трансгенный штамм T. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина, расположенными на С-конце малой субъединицы. Показано, что модифицированный фермент обладает близкими к исходному ферменту гидрогеназной активностью и термостабильностью, сохраняя ту же локализацию и функцию в клетках. Путем введения в трансгенный штамм T. roseopersicina GB11 поддерживающейся плазмиды, несущей hydL, впервые получен штамм T. roseopersicina, экспрессирующий только большую субъединицу HydSL-гидрогеназы, модифицированную полигистидиновой меткой с N-конца. Показана важная роль малой субъединицы в сборке активного центра и функционировании фермента.
Практическая значимость. Впервые сконструированы и апробированы вырожденные праймеры для поиска структурных генов HupSL, HoxYH и HydSL гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях. Использование этих праймеров позволяет проводить скрининг и отбирать перспективные штаммы.
Получены штаммы E. сoli, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL T. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Разработанная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы, поскольку гетерологично экспрессированные структурные гены практически не обладают гидрогеназной активностью.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 8-й международной конференции «Гидрогеназы и выделение водорода» (Брекенридж, США, 2007), Молодёжной школе-конференции с международным участием «Возобновляемые источники энергии» (Москва, 2008), 13-м международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Монреаль, Канада, 2009), Симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), 14 международной школе-конференции молодых учёных «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2010).
Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49658, 08-08-12196, 11-04-01383), частично финансировалась из подпрограммы «Нанобиотехнология» программы РАН «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов».
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 8 глав и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 27 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 242 источника.
