Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотосинтез – это глобальный биосферный процесс, в ходе которого происходит преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей органических соединений, от которых зависит большинство живых форм на Земле. Фотосинтезирующие бактерии обладают одной из наиболее простых и стабильных систем для сбора и эффективной трансформации солнечной энергии по сравнению с другими фотосинтезирующими организмами (растения, водоросли и др.). Основой фотосинтетического аппарата бактерий являются светособирающие комплексы, которые поглощают энергию квантов солнечного света и переводят ее в энергию электронного возбуждения с последующей передачей этой энергии на реакционные центры (RC), где происходит первичное запасание энергии в виде энергии разделенных зарядов [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Gabrielsen et al., 2009].
Выделяют две группы светособирающих комплексов, согласно расположению относительно RC: периферийные антенные комплексы (LH2) и прицентровые антенные комплексы (LH1) [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Sturgis and Niederman, 2009]. RC расположен внутри структуры комплекса LH1 и образует с ним ядерный (core) комплекс LH1-RC [Zuber and Cogdell, 1995], вокруг которого в мембране располагаются комплексы LH2 [Bahatyrova et al., 2004]. Для комплексов LH2 и LH1-RC определена пространственная структура с высоким разрешением [McDermott et al., 1995; Koepke et al., 1996; Hu and Schulten, 1997; Roszak et al., 2003]. Установлено, что эти комплексы построены по универсальному модульному принципу из одинаковых субъединиц, каждая из которых состоит из двух низкомолекулярных полипептидов ( и ), БХл и каротиноидов [Zuber and Cogdell, 1995; McDermott et al., 1995; Roszak et al., 2003]. В комплексе LH2 из Rbl. acidophilus 10050 каждый /-гетеродимер связывает 3 молекулы БХл и 1 молекулу каротиноида (родопин-глюкозид) [Papiz et al., 2003; Prince et al., 2003]. Основными функциями каротиноидов являются светособирающая, защитная и структурная [Москаленко и Ерохин, 1981; Moskalenko and Karapetyan, 1996; Cogdell et al., 2006; Scheer, 2006; Поляков и Лёшина, 2006; Theiss et al., 2008; Telfer et al., 2008; Frank and Polivka, 2009]. В настоящее время проблемой является получение бескаротиноидных комплексов LH2. Установлено, что комплексы LH2 не собираются в бескаротиноидных мутантах несерных пурпурных бактерий, полученных классическим мутагенезом или транспозоновым методом [Jones et al., 1992; Lang and Hunter, 1994]. Единственный на сегодняшний день метод для получения бескаротиноидных комплексов LH2 – это ингибирование биосинтеза каротиноидов в клетках бактерий при их выращивании [Goodwin and Osman, 1953; Bramley, 1993; Moskalenko and Makhneva, 2012]. К настоящему времени найдены только две пурпурные серные бактерии Alc. vinosum и Alc. minutissimum, у которых биосинтез каротиноидов можно ингибировать на 95-99% и сохранить полный набор светособирающих комплексов [Cohen-Bazire and Stanier, 1958; Brill, 1963; Moskalenko and Makhneva, 2012; Большаков, 2012]. Попытки
подавить синтез каротиноидов у несерных бактерий не дали положительного результата: клетки или прекращали рост в присутствии ингибитора или синтез каротиноидов подавлялся на 30-45% [Gall et al., 2005]. Бескаротиноидный комплекс LH2 был выделен только из пурпурной серной бактерии Alc. minutissimum [Москаленко, 1993; Москаленко и др., 2001; Makhneva et al., 2008; Moskalenko and Makhneva, 2012]. Особенностью комплексов LH2 из Alc. minutissimum является гетерогенность полосы поглощения БХл800 [Москаленко, 1993]. Предполагается, что именно эта гетерогенная полоса определяет способность указанного комплекса собираться без каротиноидов [Cogdell et al., 2006]. Аналогичные комплексы LH2 из несерных бактерий имеют гомогенную полосу поглощения БХл800 и, по общему мнению, не могут собираться без каротиноидов. Поэтому представляло интерес изучить бактерию, которая содержит комплекс LH2 с гомогенной полосой при 800 нм, и исследовать в ее клетках взаимосвязь биосинтеза каротиноидов и сборки светособирающих комплексов.
Цели работы: 1) получить бескаротиноидный комплекс LH2 и комплексы LH2 с разным составом каротиноидов из пурпурной серной бактерии Ect. haloalkaliphila и изучить их свойства; 2) исследовать встраивание каротиноидов in vivo и in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila.
Были поставлены следующие задачи:
-
Вырастить клетки Ect. haloalkaliphila с различным уровнем ингибирования биосинтеза каротиноидов, используя разные концентрации дифениламина. Выделить из них светособирающие комплексы и изучить распределение в них каротиноидов. Выделить бескаротиноидный комплекс LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучить его свойства.
-
Изучить встраивание разных каротиноидов in vivo в светособирающие комплексы в ходе восстановления биосинтеза каротиноидов в клетках Ect. haloalkaliphila.
-
Провести встраивание in vitro разных каротиноидов в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila и изучить свойства комплексов LH2 со встроенными каротиноидами.
Научная новизна работы. Получены клетки и светособирающие комплексы c разным качественным и количественным составом каротиноидов при выращивании клеток Ect. haloalkaliphila в присутствии различных концентраций дифениламина (ДФА). Показано, что ингибитор подавляет активность фитоинсинтетазы или ферментов из более ранних стадий биосинтеза каротиноидов. Изменение состава и количества каротиноидов не влияет на сборку ПБК. Впервые получен бескаротиноидный комплекс (ДФА-комплекс) LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучены его свойства. Показано, что каротиноиды не являются обязательным компонентом для сборки комплексов LH2. Установлено, что структура ДФА-комплекса LH2 менее
устойчива к действию различных повреждающих факторов (температуры, синглетного кислорода, детергентов и органических растворителей) по сравнению с контрольным комплексом. Показано, что при восстановлении биосинтеза каротиноидов in vivo спириллоксантин преимущественно встраивается в комплекс LH1-RC, а ангидрородовибрин, спириллоксантин, ликопин и родопин – в комплекс LH2. Выяснено, что скорость восстановления биосинтеза каротиноидов опережает скорость роста культуры клеток. Установлено, что после встраивания разных каротиноидов in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila они восстанавливают свои свойства. Эффективность встраивания каротиноидов составляет от 80 до 100%. Показано, что процессы встраивания каротиноидов в клетке и in vitro отличаются.
Практическая значимость. Полученные данные вносят существенный вклад в фундаментальные знания об организации ПБК, функционировании и свойствах каротиноидов в этих комплексах и могут быть полезны для разработки искусственных систем сбора и преобразования солнечной энергии на основе ПБК.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XVII, XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2012); XIV, XV, XVI, XVII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012, 2013); всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); VI съезде Российского фотобиологического общества (Краснодарский край, пос. Шепси, 2011); XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); школе-конференции молодых ученых на базе ИФПБ РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 2012, 2013); международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012, 2013).
Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих статьях и разделах диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статьи: 3 статьи в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 14 в материалах конференций.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и
их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 10 таблиц и иллюстрирована 56 рисунками. Список литературы содержит 215 источников (из них 183 на английском языке).