Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. Секреция белков у Bacillus subtilis. Свойства секреторных белков
2.1. Введение 6
2.2. Какие белки секретируются? 8
2.3. Структура сигнального пептида в целом 9
2.4. Классификация сигнальных пептидов 11
2.4.1. Определение предположительных сигнальных пептидов компьютерными методами 11
2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся через главный секреторный путь (Sec-систему) 17
2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя аргининовыми остатками (RR-мотив) 18
2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов 20
2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков 24
2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов 28
2.5. Количество транспортируемых белков 28
2.6. Sec-зависимая секреторная система 32
2.6.1. Цитозольные шапероны 32
2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции 3 2
2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия 34
2.6.2. Транслоказа 36
2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I 39
2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II 42
2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов 43
2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 44
2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы 44
2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы 45
2.6.6.3. Пропептиды 46
2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы) 46
2.7. Контроль качества транспортируемых белков 46
2.8. Sec-независимый экспорт белков 51
2.8.1. Tat-система транспорта 51
2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков 53
2.8.3. ABC-система транспорта 54
2.9. Роль пропептида в секреции белков 55
2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке 60
2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке 60
2.10.2. Ковалентное связывание с клеточной стенкой 61
2.11. Транспорт белков во время споруляции 62
2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции 62
2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом транспорте белков 63
3. Материалы и методы исследования 64
3.1. Материалы 64
3.2. Методы 66
4. Результаты и обсуждение 85
4.1. Экспрессия гена глутамилэндопептидазы gseBL из Bacillus licheniformis 85
4.1.1. Получение предшественника GseBL в клетках Е. coli 85
4.1.2. Экспрессия гена gseBL в клетках L-форм P. mirabilis 90
4.2. Экспрессия гена cpt из Thermoactinomyces vulgaris 101
4.2.1. Экспрессия модифицированного гена cpt в клетках L-форм P. mirabilis 101
4.2.2. Экспрессия гена cpt в клетках В. subtilis 107
5. Заключение 110
6. Выводы 112
7. Благодарности 113
8. Список литературы 114
- Определение предположительных сигнальных пептидов компьютерными методами
- Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя аргининовыми остатками (RR-мотив)
- Получение предшественника GseBL в клетках Е. coli
- Экспрессия модифицированного гена cpt в клетках L-форм P. mirabilis
Определение предположительных сигнальных пептидов компьютерными методами
И в прокариотических, и в эукариотических клетках белки, транспортируемые через мембрану, обычно содержат особую N-концевую последовательность, называемую сигнальным, или лидерным, пептидом, который играет ключевую роль в определении пути белка для транслокации через мембрану. Его физическими свойствами определяются взаимодействия между экспортируемым белком, липидами мембраны и белками транслокационного пути.
Хотя первичная структура N-концевых сигнальных пептидов не обнаруживает значительного сходства ни в рамках таксономических групп микроорганизмов, ни в рамках тех или иных классов белков, тем не менее, в ней удается вычленить три функциональных домена (Pugsley, 1993; von Heijne, 1984, 1989,1990а, 1990b; von Heijne and Abrahmsen, 1989) (рис.1). N-концевой домен (N-домен) лидерного пептида содержит как минимум один остаток аргинина или лизина, хотя этот положительно заряженный остаток, по-видимому, не строго необходим для экспорта белка (Chen and Nagarajan, 1994). Предполагается, что положительно заряженный N-домен взаимодействует с секреторной системой (Akitaet al, 1990) и отрицательно заряженными фосфолипидами бислоя мембраны в процессе транслокации (Deuerlinge al, 1997). Н-домен, следующий за N-доменом, образован относительно протяженной последовательностью гидрофобных остатков, способных, по-видимому, принимать конформацию ос-спирали внутри мембраны (Briggse al, 1986). В центральной части этого гидрофобного ядра часто встречаются остатки глицина или пролина, нарушающие регулярность структуры спирали. Эти остатки, вероятно, позволяют сигнальному пептиду принимать петлевидную конформацию, облегчающую внедрение в мембрану. Согласно одной из моделей функционирования секреторного лидера было предложено, что разворачивание такой петли приводит к полному проникновению всего лидерного пептида в мембрану (Deuerling et. al, 1997) (рис. 2). Предполагается, что остатки, прерывающие спираль в конце Н-домена, облегчают его отщепление специфическими сигнальными пептидазами (СПазами) (Dalbey et. al, 1997; Paetzel et. al, 1998). С-домен, следующий за H-доменом, содержит сайт отщепления для СПазы, которая отделяет сигнальный пептид от оставшейся части секретируемого белка во время или сразу после транслокации. В результате белок, лишенный сигнального пептида, освобождается из мембраны и может принимать свою естественную конформацию. В конце концов, секреторный лидер деградируется пептидазами сигнального пептида (ПСПазы) и удаляется из мембраны (рис. 2). Несмотря на то, что сигнальные пептиды весьма схожи по своей структуре в целом, сравнительно небольшие различия между индивидуальными секреторными лидерами могут приводить к тому, что они отщепляются разными СПазами, экспортируются через разные пути и транспортируются в различные конечные пункты назначения.
В настоящее время на основании имеющихся данных по распознаванию СПазами специфических последовательностей можно выделить четыре класса N-концевых сигнальных пептидов. Первый главный класс образован «типичными» лидерными пептидами, которые присутствуют в пре-белках и отщепляются различными СПазами В. subtilis типаї (Tjalsmae . al, 1997; 1998; 1999b). Хотя большинство белков с подобными сигнальными пептидами, по-видимому, секретируются во внешнюю среду, некоторые из них все же удерживаются в клеточной стенке или специфически направляются во внутримембранное пространство эндоспоры после транслокации через мембрану посредством Sec-системы. Интересно, что подгруппа этих сигнальных пептидов содержит так называемый мотив с двумя аргининовыми остатками (twin-arginine motif, RR-motif), который может направлять белки в другую систему транслокации, известную как Tat-система.
Второй большой класс сигнальных пептидов присутствует в пре-липопротеинах. Отщепляются они липопротеин-специфичными СПазами В. subtilis типа II (Pragai et. al, 1997; Tjalsmae/. al, 1999a, 1999c). Основное отличие сигнальных пептидов липопротеинов и секреторных белков-присутствие высоко консервативного липобокса в предшественниках липопротеинов. Этот липобокс содержит инвариантный остаток цистеина, который модифицируется липидами с участием диацилглицерил-трансферазы до момента процессинга предшественника СПазой типа II. После транслокации через цитоплазматическую мембрану экспортируемый модифицированный белок остается заякоренным в мембране посредством липида, связанного с N-концевым цистеиновым остатком. Интересно, что и некоторые сигнальные пептиды липопротеинов содержат типичный RR-мотив. Следовательно, существует возможность экспорта таких липопротеинов скорее через Tat-путь, нежели через Sec-систему.
Третий класс образован сигнальными пептидами препилин-подобных белков, которые в В. subtilis отщепляются препилин-специфичными СПазой ComC (Chung and Dubnau, 1995). Последовательность для распознавания препилиновой СПазой локализована, в отличие от секреторных белков и липопротеинов, между N- и Н-доменами. Таким образом, Н-домен остается присоединенным к зрелому пилину после процессинга лидерного пептида (Chung and Dubnau, 1995, 1998; Pugsley, 1993).
Наконец, четвертый класс сигнальных пептидов выделяют среди синтезируемых рибосомами бактериоцинов и феромонов, которые транспортируются через АТФ-связывающую систему (ATP-binding cassete, ABC-транспортеры) (Banerjee and Hansen, 1988; Faikef. al, 1998). Эти сигнальные пептиды не имеют гидрофобного Н-домена и отщепляются от зрелого белка субъединицей ABC-транспортера, который ответствен за экспорт бактериоцинов и феромонов, либо специфическими СПазами.
Хорошо известно, что В. subtilis может секретировать определенные белки в среду в высокой концентрации (Simonen and Palva, 1993). Однако до недавнего времени было трудно оценить число экспортируемых белков, формирующих секретому В. subtilis. Завершение проекта по секвенированию генома В. subtilis (Kmst et. al., 1997) и доступность программ для идентификации сигнальных пептидов и трансмембранных сегментов в больших коллекциях последовательностей белков, имеющихся в открытом доступе в банках генов (Nielsenet. al, 1997; Sipos and von Heijne, 1993), сделали возможным предсказание наиболее вероятной локализации практически всех 4107 выявленных белков этого организма (то есть всей протеомы). Компьютерный анализ показал, что около 25% протеомы В. subtilis содержит сигналы для сортинга на мембране в форме гидрофобных последовательностей, которые могут проникать в мембрану и пересекать ее (Boyde/\ al, 1998; Wallin and von Heijne, 1997; http://pedant.mips.biochem.mpg.de). Некоторые из этих предполагаемых мембранных белков содержат N-концевой сигнальный пептид и в реальности могут оказаться экспортными белками, как будет показано ниже.
Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя аргининовыми остатками (RR-мотив)
Идентификация сигнальных пептидов с помощью компьютерных алгоритмов выявила 180 потенциальных субстратов для СПаз типаї. RR-мотив, содержащий как минимум три остатка в консенсусной последовательности R-R-X-#-# (где # - это остаток гидрофобной аминокислоты) (Cristobal et. al, 1999) был найден в 14 случаях из этих 180. На этом основании предполагается, соответствующие пре-белки могут транспортироваться другим способом, нежели через Sec-систему. Оставшиеся 166 предсказанных сигнальных пептидов «Sec-типа» (табл.1) варьируют по длине от 19 до 44 остатков, но пик распределения приходится на 28 остатков. Эти сигнальные пептиды содержат в среднем два или три положительно заряженных остатка лизина (К) или аргинина (R) в своих N-доменах, хотя некоторые N-домены несут от пяти до 11 положительно заряженных остатков. Гидрофобное ядро (Н-домен) имеет среднюю длину 19 остатков, хотя длина в 17 или 18 остатков является, по-видимому, более предпочтительной (рис. 3 и 4). С-домен предсказанных сигнальных пептидов несет сайт для отщепления СПазой типа I с консенсусной последовательностью А-Х-А в позициях от -3 до -1 относительно сайта процессинга СПазой типа I (табл. 2). Важно отметить, что С-домен должен иметь достаточно протяженную структуру (в виде (3-слоев) для эффективного взаимодействия с активным центром СПазы 1-го типа. Основываясь на кристаллической структуре СПазы типа I из Е. coli, считается, что боковые цепи остатков в позициях Р1 и РЗ связываются с двумя неглубокими гидрофобными субстрат-связывающими карманами (S1 и S3) активного центра, в то время как боковая цепь остатка в позиции Р2 экспонирована в окружающий фермент раствор (Paetzel et. al, 1998). Предположительно по этой причине остатки, допустимые в позициях -1 и -3 сигнального пептида, в основном являются небольшими и незаряженными, в то время как в позиции -2, по-видимому, допустимы практически любые остатки аминокислот (за исключением остатков цистеина и пролина) (табл. 2). Тем не менее, у В. subtilis существует предпочтение к остатку серина в позиции -2 (встречается у 18% сигнальных пептидов). В соответствии с компьютерными предсказаниями, остаток аланина наиболее часто встречается (у 27% белков с сигнальными пептидами) в позиции +1 зрелого белка, однако и все остальные остатки, за исключением остатков пролина и цистеина, по-видимому, в этой позиции разрешены (табл. 2). Отсутствие остатка пролина в позиции +1 согласуется с наблюдением, что СПаза типа I у Е. coli ингибировалась рекомбинантными пре-белками с остатком пролина в данном положении (Barkocy-Gallagher and Bassford, 1992). Наконец, приблизительно 60% предсказанных сигнальных пептидов содержат прерывающий а-спираль остаток (в основном, глицина) в середине Н-домена и около 50% несут прерывающий спираль остаток пролина или глицина в положении от -7 до -4 относительно предположительного сайта процессинга СПазой типа I.
Белки, несущие сигнальный пептид с RR-мотивом (R-R-X-#-#, где # -остаток гидрофобной аминокислоты), могут транспортироваться через Tat-систему транслокации. При поиске в базе данных на присутствие этого мотива среди N-концевых последовательностей было идентифицировано 27 белков с предполагаемым RR-типом сигнальных пептидов. Сайт процессинга для СПазьіІтипа предположительно присутствует в 14 из этих предсказанных лидерных последовательностей. Эти сайты процессинга не несут больших отличий от сайтов отщепления сигнальных пептидов Sec-типа (рис. 3 и табл. 3). Заметим, что RR-мотив также был найден в лидерных пептидах пяти предсказанных липопротеинов, так что эти белки также могут быть субстратами для системы транспорта Tat (табл. 4). Более того, было обнаружено восемь подобных секреторным последовательностей с RR-мотивом, не имеющих, однако, сайта для отщепления СПазойІ или II типа. Соответствующие белки, таким образом, могут оставаться присоединенными к мембране своим N-концевым трансмембранным доменом (табл. 3). Интересно, что некоторые из этих белков содержат дополнительные трансмембранные сегменты. Таким образом, существует возможность для транслокации определенных трансмембранных белков через Tat-систему. N-концевые сигнальные пептиды были идентифицированы, как описано в тексте. Консервативные остатки RR-мотива показаны жирным шрифтом. В таблицу включены сигнальные пептиды, содержащие, кроме двух смежных остатков аргинина, еще хотя бы один остаток консенсусной последовательности R-R-X-#-# (Cristobal et. ah, 1999). В С-домене положительно заряженные остатки, потенциально способные выполнять функцию сигнала, отменяющего взаимодействие пре-белка с Sec-системой транспорта, показаны наклонным жирным шрифтом. Гидрофобные Н-домены показаны на сером (фоне. В сигнальных пептидах, имеющих потенциальный сайт процессинга для СПазы Ітипа, остатки в позициях от -3 до -1 (относительно точки отщепления) подчеркнуты, а сам этот сайт отмечен пробелом в последовательности аминокислотных остатков. Белки, имеющие в зрелом домене дополнительные сигналы для удержания их в клеточной стенке, отмечены верхним индексом с. Белки, не несущие потенциального сайта отщепления для СПазы I типа, показаны с верхним индексом (некоторые из них имеют дополнительные трансмембранные сегменты).
В целом же N-домены предсказанных сигнальных пептидов с RR-мотивом у Б. subtilis имеют длину в среднем 13 остатков и обычно в два раза длиннее, чем N-домены типичных лидерных последовательностей (Sec-типа). Удивительно, однако, что между Н-доменами предсказанных сигнальных пептидов В. subtilis Sec-типа и с RR-мотивом не наблюдается больших различий. В противоположность этому, было предположено, что Н-домены сигнальных пептидов Е. coli с RR-мотивом в среднем длиннее и менее гидрофобны по сравнению с Н-доменами лидерных последовательностей Sec-типа у данной грам-отрицательной бактерии (Cristobal et. al, 1999). Подобные наблюдения могут говорить о том, что либо различие в Н-доменах сигнальных пептидов с RR-мотивом и Sec-типа не слишком важны для транслокации через Tat-систему у В. subtilis, либо некоторые из предсказанных сигнальных пептидов с RR-мотивом все же не направляют белки в Tat-систему транслокации (Tjalsma et. al, 2000). К примеру, последнее предположение можно применить к WapA и WprA, секреция которых ухудшается в условиях недостатка Ffh и SecA и, следовательно, является Sec-зависимой (Hirose et. al, 2000). И, наконец, положительно заряженные остатки (аргинина или лизина) в С-домене, который может функционировать в качестве так называемого Sec-отменяющего сигнала, предотвращающего взаимодействие белка с компонентами Sec-системы, присутствуют в восьми из 27 предполагаемых сигнальных пептидов, несущих мотив с двумя аргининовыми остатками.
Получение предшественника GseBL в клетках Е. coli
Sec-система транслокации пре-белков у Е. coli представлена как минимум семью белками: SecA, который является главным двигателем транслокации, и интегральными мембранными белками SecD, SecE, SecF, SecG, SecY и YajC. Гомологичные всем перечисленным компонентам белки были найдены и у В. subtilis. В разработанной на настоящий момент модели транслокации пре-белков, основанной на результатах исследований, полученных главным образом на Е. coli, предполагается смена нескольких последовательных событий. Вначале SecA связывается с кислыми фосфолипидами и SecY и активируется для распознавания SecB и пре-белка (Hartley al, 1990). Ассоциация SecA с пре-белком сопровождается связыванием и гидролизом молекулы АТФ. Связывание АТФ вызывает значительные конформационные изменения SecA, приводящие к освобождению SecB и внедрению С-конца SecA в мембрану. Это проникновение в мембрану происходит через транслоказный комплекс и способствует транслокации небольшого фрагмента пре-белка. Далее SecA гидролизует еще молекулу АТФ, что приводит к освобождению пре-белка от SecA и высвобождению SecA из мембраны. Таким образом, транслокация пре-белка инициируется SecA и продвигается путем повторяющихся актов связывания с SecA АТФ и его гидролиза, а также с участием протон-движущей силы (Fekkes and Driessen, 1999).
Ген, кодирующий SecA у В. subtilis, первоначально был назван div, так как мутации в нем существенно влияли на деление клеток, процессы формирования и прорастания спор, секреции белков, автолиза и развития компетентности для связывания и поглощения ДНК клеткой (Sadaie and Kada, 1985). Клонирование и секвенирование гена div показало, что он кодирует белок SecA; ген secA у В. subtilis был клонирован также независимым путем, используя гибридизацию ДНК с зондом на основе гена secA Е. coli. SecA В. subtilis способен комплементировать мутации по гену этого белка у Е. coli (Tjalsma et. ah, 2000). Следует отметить, что дрожжи и архебактерии не имеют гомолога SecA, хотя и содержат проводящий канал для транспортируемых белков Sec-типа (будет рассмотрено ниже). У S. cerevisiae движущая сила для транслокации белков через мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭР) генерируется либо рибосомой (в случае котрансляционной транслокации), либо белком Каг2 (гомолог Hsp70), находящимся в полости ЭР (в случае посттрансляционной транслокации) (Schatz and Dobberstein, 1996). То, что SecA отсутствует у архебактерии (или как минимум у тех, геном которых полностью секвенирован), предполагает, что эти организмы используют другую цитоплазматическую АТФазу, систему SRP и/или синтез белка в качестве генератора энергии для транслокации белков.
В дополнение к своей роли в транслокации пре-белков SecA у В. subtilis может выполнять также и роль шаперона, участвующего в секреции. Такое предположение о функции SecA у В. subtilis хорошо согласуется с данными о его низкой аффинности к SecYEG (Swavinge/. ah, 1999). Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что хотя бы в случае В. subtilis уровень цитозольного SecA в клетке относительно высок, и это облегчает его ранние взаимодействия с экспортируемыми белками.
Гетеротримерный комплекс SecY, SecE и SecG образует основную составную часть транслокационного канала. Этот комплекс обнаружен не только у эубактерий, но и у эукариотических организмов (Sec61p комплекс), а также у архей (Pohlschroder et. ah, 1997). Гомологи SecY и SecG у эукариот называются Sec61a и Sec61y соответственно. SecG не является консервативным, однако этот белок может быть функциональным аналогом эукариотического Sec6ip. Основываясь на сходстве нуклеотидных последовательностей и на наблюдениях о том, что архебактерии, по-видимому, содержат гомологичный Sec6ip белок вместо SecG, было выдвинуто предположение, что транслоказа архей в структурном отношении ближе к эукариотическому комплексу Sec61p, чем транслоказе эубактерий.
SecY, SecE и SecG- мембранные белки у В. subtilis, содержащие 10, 1 и 2 трансмембранных домена, соответственно (Schatz and Dobberstein, 1996). Интересно, что SecE В. subtilis значительно меньше SecE Е. coli и имеет всего один трансмембранный сегмент в отличие от трех таких сегментов у белка Е. coli. Тем не менее, SecE В. subtilis оказался способным комплементировать Ts-мутации Е. coli по гену secE, приводившие к нарушению экспорта белков, что подтверждает структурное и функциональное сходство с SecE у В. subtilis и Е. coli. Основываясь на данных относительно посттрансляционного транспорта белков в ЭР у S. cerevisiae, было постулировано, что SecE и сигнальные пептиды связываются с одними и теми же либо перекрывающимися районами SecY, и что SecE функционирует в качестве суррогатного сигнального пептида в случае, когда канал SecY закрыт при отсутствии транслоцирующегося пре-белка. При приближении сигнального пептида он должен заместить SecE и таким образом открыть канал SecY для транспорта.
В противоположность SecY и SecE, SecG не является строго необходимым для транслокации пре-белков и жизнеспособности клетки. Тем не менее, его присутствие повышает эффективность транслокации. Возможно, SecG облегчает движение пре-белка через транслокационный канал в соответствии с циклами внедрения в мембрану и высвобождения Sec A (Matsumoto et. al, 1998). В отсутствие SecG у Е. coli наблюдается фенотип чувствительности роста клеток к пониженным температурам, как чаще всего происходит для штаммов Е. coli в случае, когда нарушается секреция белков через Sec-систему. Аналогичным образом, инсерционная инактивация гена secG (yvaL) у В. subtilis вызывает нарушение секреции белков, приводящее к появлению чувствительности роста клеток к низким температурам, что подтверждает предположение о чувствительности транслокации белков у В. subtilis к холоду, как это было показано для Е. coli. Более того, холодочувствительность мутантов В. subtilis по геяу secG усиливается при суперпродукции секреторных пре-белков. Интересно отметить, что дефекты в росте и секреции у мутантов В. subtilis по гену secG могут комплементироваться при экспрессии гена secG Е. coli даже в случае суперпродукции секреторных пре-белков. И, наконец, в соответствии с ролью SecG в Е. coli, SecG у В. subtilis стимулирует АТФ-зависимую транслокацию комплексом SecA-SecYE предшественника белка npe-PhoB в системе in vitro (Swavinger. al., 1999).
В дополнение к генам, кодирующим главный элемент транслоказы SecYEG, у В. subtilis также обнаружен дополнительный ген secDF (Bolhius et. al, 1998). В противоположность другим организмам, у В. subtilis гены secD и secF транслируются в виде единой полипептидной цепи. Следовательно, SecDF у В. subtilis можно назвать «молекулярными Сиамскими близнецами», несущими предположительно 12 трансмембранных доменов. Следует заметить, что SecDF обнаруживает сходство с другими растворимыми транспортными белками как по последовательности, так и по структуре. Было показано, что SecDF В. subtilis, не являющийся существенным для жизнеспособности клетки, необходим для обеспечения нормальной способности к секреции белков. В противоположность SecD-субъединице Е. coli белок SecDF В. subtilis, по-видимому, не играет роли в высвобождении зрелого секреторного белка с мембраны. Было предположено, что SecD и SecF Е. coli модулируют циклическое функционирование SecA (Tjalsma et. al, 2000). Однако было замечено, что архебактерии, которые имеют отдельные белки SecD и SecF, не содержат гомолога SecA (Pohlschroder et. al, 1997). Таким образом, возможно, SecD-SecF играет какую-то другую роль в транслокации белков, такую как сборка транслоказы либо удаление сигнальных пептидов или неправильно свернутых белков из транслокационного канала (Bolhuis et. al, 1998).
Экспрессия модифицированного гена cpt в клетках L-форм P. mirabilis
В отличие от СПаз типа I, В. subtilis имеет только один ген для СПазы II типа (ген lsp) (Tjalsmae/. al, 1999а), продукт которого Lsp необходим для специфического процессинга модифицированных липидами пре-белков. Известные СПазы этого типа являются интегральными мембранными белками с четырьмя (предположительно) трансмембранными сегментами, причем их N- и С-концевые области предположительно экспонированы в цитозоль (Tjalsmae/. al, 1999с). Потенциальный активный центр СПаз типаII, образованный двумя остатками аспарагиновой кислоты, располагается в непосредственной близости к внешней поверхности цитоплазматической мембраны, подобно остатку серина активного центра СПаз I типа.
Интересно, что клетки, не имеющие СПазы типа И, остаются жизнеспособными в стандартных лабораторных условиях. Поскольку активность как минимум одного из липопротеинов, PrsA, жизненно необходима, можно предположить, что процессинг пре-липопротеинов СПазой II типа у В. subtilis не всегда является необходимым условием для функционирования липопротеинов. Хотя определенные липопротеины нужны для развития генетической компетентности, споруляции и прорастания спор, эти морфогенетические процессы не подвергались видимым изменениям в отсутствие СПазы типа П. Клетки, не имеющие СПазы II типа, накапливали предшественники модифицированных липидами белков, а также псевдозрелую форму PrsA, способную, подобно зрелой форме липопротеина PrsA, обеспечивать фолдинг секретируемых белков. Эта форма PrsA, как оказалось, имела пониженную активность, так как секреция а-амилазы В. amyloliquefaciens AmyQ, фолдинг которой зависит от PrsA, существенно ухудшалась. До сих пор остается неясным, какие протеиназы отвечают за альтернативный процессинг PrsA в отсутствие СПазы типа П. Однако участие СПаз Ітипа в этом процессе кажется весьма маловероятным (Tjalsmae/. al, 1999а). Уровень в клетке другого липопротеина, CtaC, существенно снижается в отсутствие СПазы типа II, что указывает на важную роль процессинга для стабильности определенных липопротеинов.
Модификация диацилглицеролом остатка цистеина в положении +1 у зрелых липопротеинов в их предшественниках катализируется липопротеин-диацилглицерил-трансферазой (Lgt). Эта модификация является необходимым условием для процессинга предшественника липопротеина СПазой II типа. Подобно инсерционной инактивации гена lsp СПазы типа II, инактивация гена lgt приводит к накоплению непроцессированных (и немодифицированных) липопротеинов, что не оказывает влияния на рост и жизнеспособность клеток (Tjalsmaef. al, 1999а). Подобно СПазе IIтипа, Lgt необходим для стабильности некоторых липопротеинов и эффективности секреции AmyQ. Интересно, что скорость процессинга секреторных пре-белков, не являющихся липопротеинами, замедлялась в отсутствие СПазы II типа, что должно объясняться ненормальным функционированием липопротеинов, отличных от PrsA. Два белка, способные оказаться ответственными за подобный эффект, - это липопротеины (как предполагается) SpoIIIJ и YqjG (табл. 3), которые имеют значительное сходство последовательностей с митохондриальным белком Oxalp. Было показано, что Oxalp необходим для экспорта N- и С-концов закодированного в митохондриях предшественника II субъединицы цитохром-с-оксидазы (пре-СохІІ) из матрикса в межмембранное пространство митохондрии, протеолитического процессинга пре-СохІІ и сборки комплексов цитохром-с-оксидазы и олигомицинчувствительной АТФ-синтазы. Поскольку митохондрии не имеют Sec-системы транспорта белков, Oxalp является, по-видимому, компонентом специфической экспортной системы и/или системы сборки белковых комплексов. Эти системы могут оказаться консервативными в органеллах эукариот и эубактериях (Hell е?. al, 1998). В подтверждение этой гипотезы недавно было показано, что гомолог SpoIIIJ/YqjC и Oxalp из Е. coli, обозначаемый YidC, связан с Sec-транслоказой (Scotti et. al, 2000).
Процессированные липопротеины Е. coli далее модифицируются ацилированием аминогруппы диацилглицерил-цистеина. Однако этот процесс липидной модификации, по-видимому, не является консервативным для всех эубактерий, поскольку многие организмы, включая и В. subtilis, не имеют гена Int N-ацилтрансферазы липопротеинов (Tjalsma et. al, 1999а).
После отщепления от пре-белков сигнальные пептиды быстро деградируют. Было показано, что сигнальный пептид главного липопротеина Е. coli (Lpp, называемого также липопротеином Брауна) деградирует с участием связанной с мембраной протеиназы IV SppA (которую также называют пептидазой сигнального пептида, или ПСПазой; кодируется она геном sppA). Однако и в отсутствие протеиназы IV наблюдается деградация сигнальных пептидов, что говорит о способности других протеиназ заменять протеиназу IV в этом процессе. Было обнаружено, что в дополнение к протеиназе IV цитоплазматическая олигопептидаза A (OpdA) также участвует в деградации сигнального пептида Lpp. Существующая модель объяснения этого процесса предполагает, что протеиназаТУ расщепляет сигнальный пептид в мембране на два фрагмента (рис. 2), которые в дальнейшем деградируют в цитоплазме под действием OpdA (Novak and Dev, 1988).
ПротеиназаГУ оказалась высоко консервативной у эу- и архебактерий. Однако оказалось, что OpdA присутствует только у грам-отрицательных бактерий и архей. Подобно протеиназе IV Е. coli, ее гомолог у В. subtilis SppA (или Ytel) оказался мембранным белком с тремя потенциально трансмембранными сегментами. Инсерционная инактивация гена sppA у В. subtilis приводит к снижению скорости процессинга а-амилазы AmyQ, но не ее транслокации. Это позволяет предположить, что отсутствие SppA сказывается отрицательно на активности СПазы типа I, к примеру, из-за накопления определенных сигнальных пептидов (Bolhuis et. al, 1999). Интересно, что В. subtilis имеет и другой ген (tepA или ymfB) потенциальной протеиназы со сходством N-концевой последовательности с SppA. В отсутствие этого так называемого ТерА белка (белка, усиливающего транслокацию; translocation-enhancing protein) скорость транслокации целого ряда секреторных белков резко снижалась. Следует заметить, что белок ТерА, который предположительно имеет дитоплазматическую локализацию, имеет сходную последовательность с цитоплазматической протеиназой ClpP. Предполагается, что ТерА может играть три возможных роли в транслокации белков. Во-первых, ТерА может быть аналогом OpdA Е. coli, поскольку оказалось, что сигнальные пептиды могут ингибировать транслокацию белков. Во-вторых, ТерА может иметь регуляторную функцию подобно ClpP (будет описано далее). В-третьих, ТерА может оказаться шапероном, участвующим в секреции белков.
После того, как секреторные белки прошли через канал транслокации, они должны принять свою нативную конформацию на внешней {транс-) стороне мембраны. Правильный и быстрый фолдинг является необходимым условием их существования, так как частично и полностью денатурированные белки весьма чувствительны к действию протеиназ, которые, как правило, присутствуют в этом новом для них окружении. Это подтверждается такими наблюдениями, например, что а-амилаза В. licheniformis (AmyL) быстро деградировала при секретировании ее В. subtilis из-за своей относительно низкой скорости фолдинга. Однако, приняв свою естественную третичную конформацию, AmyL оказалась стабильна в среде культивирования бацилл (Stephenson and Harwood, 1998).
