Содержание к диссертации
Введение
1. Глава 1. Терминация трансляции (обзор литературы)
1.1..Терминация трансляция опосредована белковыми факторами 1-го и 2-го классов. 10 стр.
1.2. Особенности структуры факторов терминации 2-го класса. 11 стр.
1.2.1. Структурные особенности G домена ГТФаз. 12 стр.
1.2.2. Первичная и третичная структуры RF3 и eRF3 13 стр.
1.3. ГТФазньїй цикл в рибосоме. 21 стр.
1.4. Функциональные свойства eRF3
1.4.1. Роль eRF3 в терминации трансляции у эукариот 24 стр.
1.4.2. Нетерминационные функции eRF3 29 стр.
1.4.3. Взаимодействие eRF3 и eRFl 36 стр.
1.5.eRF3 не является функциональным аналогом RF3 37 стр.
1.6.Структурно-функциональные свойства eRFl. 39 стр.
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1.Штаммы бактерий, плазмиды, среды и реактивы 43 стр.
2.2.Методы исследований
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 45 стр.
2.2.2. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК 46 стр.
2.2.3. Синтез и выделение белков
2.2.3.1. Получение eRFl человека для исследования методом малоуглового рассеяния. 47 стр.
2.2.3.2. Получение eRFl и мутантов eRFl человека для исследования калориметрическими методами. 48 стр.
2.2.3.3. Получение eRF3 человека. 49 стр.
2.2.3.4. Получение доменов eRFl человека.
2.2.3.4.1. Получение N, М и NM доменов. 50 стр.
2.2.3.4.2. Получение С и МС доменов. 51 стр.
2.2.4. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ. 51 стр.
2.2.5. Измерение флуоресценции растворов белков. 52 стр.
2.2.6. Измерения малоуглового рассеяния . 52 стр.
2.2.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). 53 стр.
2.2.8. Круговой дихроизм (КД). 53 стр.
2.2.9. Изотермическая титрационная калориметрия 54 стр.
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1.Связь между термостабильностью eRFl и изменениями функциональной активности его мутантов 56 стр.
3.1.1. Тепловая денатурация eRF 1 человека и его мутантов. 57 стр.
3.1.2. Термостабильность мутантов eRF 1 и его RF-активность . 61 стр
3.2.Молекулярная морфология eRFl в растворе 68 стр.
3.3.Образование четверного комплекса eRFbeRFS'ITO^Mg2"1" в растворе. 72 стр
3.3.1. Взаимодействие eRF3 с гуаниловыми нуклеотидами. 73 стр.
3.3.2. Термодинамические параметры образование комплекса между eRF 1 и eRF3 73 стр.
3.3.3. Связывание ГТФ комплексом eRF 1 »eRF3 76 стр.
3.3.4. Обмен нуклеотидов в комплексе eRFl»eRF3»ry]cD/rTO 77 стр.
3.3.5. eRF 1 как эффектор связывания гуаниловых нуклеотидов. 78 стр.
3.3.6. Схема взаимодействия между eRF3 и его лигандами 78 стр.
3.3.7. Роль eRFl по отношению к eRF3 81 стр.
3.3.8. Роль магния в связывании гуаниловых нуклеотидов 84 стр.
3.3.9. Сравнение полученных результатов с данными литературы. 85 стр. ЗАРоль индивидуальных доменов eRFl в связывании ГТФ с eRF3.
Взаимодействия между доменами eRFl. 90 стр.
3.4.1. Связывание eRF3 с индивидуальными доменами eRFl. 91 стр.
3.4.2. Взаимодействия между индивидуальными доменами eRFl 93 стр.
3.4.3. Связывание ГТФ с eRF3 в присутствии М и С доменов eRFl. 93 стр.
3.4.4. Роль доменов eRFl в формировании ГТФ-связывающего центра eRF3. 94 стр.
3.5.Заключение. 99 стр.
Выводы 104 стр.
Благодарности 105 стр.
Список литературы 106 стр.
- Особенности структуры факторов терминации 2-го класса.
- Выделение плазмидной ДНК из Е. coli
- Измерения малоуглового рассеяния
- Термостабильность мутантов eRF 1 и его RF-активность
Введение к работе
Заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи - терминация трансляции - происходит в тот момент, когда в А-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК - UAA, UAG или UGA, который декодируется фактором терминации трансляции 1-го класса. Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции, которые подразделяют на два класса. Факторы первого класса или кодон-специфичные факторы принимают участие в узнавании стоп-кодона мРНК в рибосоме с последующей передачей сигнала от малой к большой субчастице рибосомы, что вызывает гидролиз пептидил-тРНК. Факторы второго класса - это G-белки, которые обладают способностью связывать гуаниловые нуклеотиды и осуществлять гидролиз ГТФ в присутствии фактора 1-го класса и рибосомы. Существует тесная взаимосвязь между факторами 1-го и 2-го класса, взаимодействующих друг с другом.
В эукариотах ключевую роль в терминации трансляции играют белковые факторы eRFl и eRF3. Хотя общая схема терминации трансляции известна, молекулярные механизмы этого процесса, структурные особенности и физические свойства факторов терминации остаются недостаточно изученными. Ранее eRFl и eRF3 исследовали главным образом с помощью генетических, биохимических и молекулярно-биологических методов. В этой работе использованы некоторые физические методы исследования, позволяющие изучать in vitro взаимосвязи структуры и функции eRFl и eRF3.
Ранее в лаборатории для выявления функционально важных аминокислотных остатков в eRFl, участвующих в узнавании стоп кодонов, использовали точечный мутагенез с последующим определением функциональной активности полученных мутантов (Seit-Nebi et al., 2001; 2002; Frolova et al., 2002;
Kolosov et al., 2005). Для интерпретации RF-активности мутантов и определения функционально важных аминокислот необходимо различить изменения RF-активности связанные с нарушением стереохимической комплементарности стоп-кодона и боковых групп аминокислот в участке узнавания eRFl,от изменений активности, вызванных конформационными перестройками молекулы белка. В противном случае, это может привести к ошибкам в идентификации декодирующих аминокислотных остатков eRFl. Неизвестно, как организован eRFl в растворе и отличаются ли его конформации в кристалле и в растворе. Немногочисленные и противоречивые данные о взаимодействии in vitro между N, М и С доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами недостаточны для понимания механизма ГТФазного цикла eRF3 в терминации трансляции. Применение различных физических методов позволяет существенно прояснить многие из перечисленных вопросов.
Цель работы состояла в использовании физических методов для: 1) оценок стабильности белка eRFl человека после внесения в молекулу точечных мутаций, 2) установление сходства и различий в конформации eRFl в кристалле и в растворе, 3) изучения взаимодействия между N, М и С доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами. В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования: экспрессировать гены полноразмерного eRFl и eRF3 (лишённого с N конца 138 аминокислот) человека, мутантов eRFl, а также N, М, С, N-M и М-С доменов eRFl в клетках Е. coli и получить высокоочищенные препараты белка; методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) оценить изменения стабильности белковой глобулы в растворе в результате мутаций. Кроме того, мы исследовали методом малоуглового рассеяния (МУР) рентгеновских лучей структуру eRFl в растворе и сравнили её с кристаллической структурой, а также методом изотермической
титрационной калориметрии (ITC) взаимодействия между N, М и С доменами eRFl, между eRFl и eRF3, между eRF3 и гуаниловыми нуклеотидами.
Установлено, что плавление молекулы eRFl человека, состоящей из трёх доменов, носит кооперативный характер, это свидетельствует о взаимодействии между доменами внутри молекулы в растворе. Ряд замен в N-домене не изменяет термостабильность белка, а в некоторых случаях даже приводит к ее некоторому увеличению. У этих мутантов избирательность утраты функции стимуляции гидролиза пептидил-тРНК в Р-участке рибосомы в присутствии стоп-кодонов не связана с дестабилизацией их трёхмерной структуры, а обусловлена, скорее всего, локальными изменением стереохимии боковых групп этих аминокислотных остатков в функционально-важных участках N-домена. Обнаружены аминокислотные остатки в N-домене, существенные для поддержания стабильности структуры eRFl и влияющие на избирательное узнавание стоп-кодонов мРНК в рибосоме. Определены интегральные структурные параметры и форма молекул eRFl человека по данным МУР в растворе, конформация eRFl в растворе близка к конформации в кристалле. С помощью изотермической калориметрии определены термодинамические параметры и предложена возможная схема взаимодействия между eRF3, eRFl и гуаниловыми нуклеотидами. Обнаружены взаимодействия между изолированными доменами eRFl в растворе. Показано, что М-домен eRFl также взаимодействует с eRF3, определены домены eRFl необходимые для связывания ГТФ с eRF3. .
Особенности структуры факторов терминации 2-го класса.
Первичная структура RF3 и eRF3 значительно отличаются и, вероятно, происходят от разных предшественников. По данным филогенетического анализа RF3 имеет общий предок с EF-G, a eRF3 - с eEFIA (эукариотический гомолог бактериального EFu) и Hbsl (гипотетический трансляционный фактор, достоверно его функция не известна) (Nakamura & Ito, 1998; Inagaki & Ford, 2000; Moreira et al., 2002; Carr-Schmid et al., 2002). Возможно, что eRF3 возник на ранней стадии эволюции эукариот, поскольку ни бактериальный, ни архейный геномы не содержат гомологов eRF3. Рис. 3. Первичная структура RF3 D.nodosus и остаток во многих ГТФ-связывающих белках, распологающийся в G2 петле, в RF3 заменён на треонин (Kawazu et al., 1995), эта особенность отличает RF3 от других ГТФаз. Второй консервативный участок (положения 250-470) включает петлю G5 и часть белка, гомологичную EF-G. Авторы трёхмерной структуры EF-G Thermus thermophilus varsson et al. (1994) предположили, что существует высокая структурно-функциональная гомология между доменами G, G и II элонгационного фактора EF-G и соответствующими участками RF3 (рис. 4). В этих белках G домен более консервативен, чем домен G (рис. 4). Предполагают, что домен G регулирует связывание и обмен гуаниловых нуклеотидов в EF-G (Kawazu et al., 1995). Домен II консервативен среди трансляционных факторов и вместе с G доменом составляет структурную единицу, возможно ответственную за связывание с рибосомой (рис. 4). Домен III EF-G, вероятно, вовлечён в связывание РНК и, по-видимому, является консервативным среди EF-G и RF3 (Kawazu et al., 1995). Хотя петля G5 обнаружена в некоторых ГТФазах, например, p21ras (Bourne et al., 1991), UEF-G stRF-3
Вертикальными линиями обозначены консервативные аминокислоты. Распределение доменов EF-G по первичной структуре указано сверху и снизу. ttEF-G - EF-G Thermus thermophilus, G, G , II, III, IV, V, VI - домены EF-G, разрешённые на кристаллической структуре OEvarsson et al. 1994), остальные обозначения такие же как в рис. 3. этот участок не консервативен среди семейства ГТФаз. Петля G5 расположена на 110 аминокислот ближе к С-концу, чем петля G4. Особенность петли G5 RF3 заключается в том, что консервативный Thr 257 заменён на серии.
На основе анализа первичной структуры и функциональных свойств, аминокислотную последовательность eRF3 можно разделить по крайней мере на два района: N-концевую и консервативную С-концевую части. С-концевая часть отвечает за активность в терминации трансляции и необходима для жизнеспособности (Ter-Avanesyan et al., 1993), тогда как N-концевая часть необязательна для терминации, но необходима для взаимодействия с такими белками как РАВР (поли (А) связывающие белки) и др. (рис. 5А) (Hoshino et al., 1999; Uchida et al., 2002; Inge-Vechtomov et al., 2003). Взаимодействие N-концевой части eRF3 с РАВР эволюционно консервативно и, возможно, такие взаимодействия связывают терминацию с инициацией (Hoshino et al., 1999; Cosson et al., 2002). Три функциональных домена eRP3 (Sup35p) S. cerevisiae обозначают как N, M и С-концевой (гомологичный eEFla) домен (рис. 5A). N домен дрожжей содержит большой процент глутаминовых остатков и с ним связана их способность к образованию прионоподобных агрегатов ([PSI+] фенотип) (см. обзор Serio & Lindquist, 2000; Chernoff et al., 2002). У млекопитающих, описано два варианта eRF3: eRF3a (GSPT1) и eRF3b (GSPT2), которые содержат длинные негомологичные N концевые области (Hoshino et al., 1989, 1998). Их различия в первичной структуре связаны, главным образом, с N-концевым участком, роль которого остаётся неясной. В отличие от eRF3a, eRF3b стимулирует активность эндогенного eRFl in vivo, что может указывать на его более высокую стимулирующую активность по отношению к eRFl или большую стабильность in vivo (Якобсен и соавт., 2001). Однако, результаты, полученные in vivo с использованием культуры клеток млекопитающих показывают, что уменьшение количества eRF3a приводит к увеличению уровня сквозного прочитывания стоп кодонов - readthrough, в то время как в eRF3b -нет (Chauvin et al., 2005). Это предпологает, что eRF3a играет ключевую роль в эффективности терминации трансляции в клеточной линии, которая использовалась в экспериментах, но это не исключает возможность, что eRF3b может играть доминирующую роль в других типах клеток. Кроме того, в мышах экспрессия eRF3b ограничена головным мозгом и меняется в процессе онтогенеза, тогда как экспрессия eRF3a происходит во всех тканях на постоянном уровне (Chauvin et al., 2005). Эти результаты предполагают, что в млекопитающих eRF3a является основным фактором, действующим в терминации трансляции, но eRF3b может заменять eRF3a (Chauvin et al., 2005). Интересно, в дрожжах мышиный eRF3b, но eRF3a может заменять sup35 (Le Goff et al., 2002). В настоящий момент биологический смысл присутствия двух форм eRF3b и eRF3a в высших эукариотах остаётся неясным.
Выделение плазмидной ДНК из Е. coli
Плазмидную ДНК выделяли по методу Бирнбойма (Birnboim, 1983) с модификациями. Бактериальные клетки из 6 мл культуры Е. coli, выращенной до ранней стационарной фазы роста в среде с соответствующим антибиотиком, собирали центрифугированием. Осадок суспендировали в 300 мкл раствора, содержащего 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл РНКазы А. К суспензии добавляли равный объем раствора, содержащего 0,2 М NaOH, 1% SDS, осторожно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 300 мкл 3,0 М ацетата калия, рН 5,2, тщательно перемешивали и выдерживали во льду 5 мин. Осветленный лизат, полученный после центрифугирования смеси, переносили в другие пробирки и депротеинизировали фенолом, насыщенным трис-HCl, рН 8,0, и смесью фенол: хлороформ (1:1 по объёму). ДНК осаждали добавлением 0,6 объема изопропилового спирта. После отмывки 70% и 96% этанолом препарат ДНК растворяли в 20 мкл воды MQ.
Трансформацию бактерий Е. coli проводили по методу Манделя и Хига (Mandel & Higa, 1970) с модификациями. Для получения компетентных клеток в пробирку с 5 мл среды LB вносили 100 мкл ночной культуры. Клетки выращивали при 37С с аэрацией до достижения оптической плотности OD6oo=0,6. Культуру охлаждали во льду 5 мин, после чего бактерии осаждали центрифугированием при 4С. Клетки суспендировали в 1 мл охлажденного во льду стерильного раствора, содержащего 50 мМ СаС12 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 30 мин, осаждали центрифугированием при 4С и суспендировали в 200 мкл охлажденного во льду стерильного раствора 50 мМ СаСЬ, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. К полученным компетентным клеткам добавляли плазмидную ДНК. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 30 мин и затем подвергали тепловому шоку при 42С (2 мин.). К клеткам добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37С. Трансформирующую смесь высевали на соответствующие селективные среды и выращивали при 37С.
Фактор терминации трансляции eRFl человека, несущий 6 гистидиновых остатков на С-конце, экспрессировали в Е. coli (Frolova et al., 1994). Штамм BL21(DE3) pUBS520, трансформированный рекомбинантной плазмидой pET23b-eRFl-6His, выращивали в 3,4 л среды LB при 37 С до оптической плотности СЮбоо= 0,4-0.6. После добавления IPTG до конечной концентрации 0.6 мМ клетки инкубировали 12 часов при 21 С, после чего осаждали центрифугированием. Полученную биомассу хранили при -20 С.
Все этапы выделения белка проводили при +4 С. Биомассу лизировали ультразвуком 150 мл лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 0.2 М КС1, 15 мМ имидазол, 1% тритон Х-100, 10% глицерин, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 0.5 мг/мл лизоцима, 1 мМ PMSF). Режим озвучивания: 30 мл лизирующего буфера, 2 мин, мощность 4, режим работы 50%, диаметр колебательной насадки 5 мм. Лизат центрифугировали 30 мин при 14000 g. Супернатант инкубировали с Ni-NTA агарозой объёмом 1.3 мл 1 час. После инкубации супернатант наносили на колонку, интенсивно промывали 20 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 0.2 М КС1, 10% глицерин, 20 мМ имидазола и элюировали буфером 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 0.4 М КС1, 3 мМ DTT, 0.035% Твин 20,150 мМ имидазол, 10% глицерин), после чего белок наносили на колонку MonoQ HR5/5 в 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 50 мМ КС1, 0.1 мМ ЭДТА. Смену буфера осуществляли с помощью гель-фильтрационной колонки PD-10. MonoQ HR5/5 колонку промывали 10 объёмами 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 50 мМ КС1, 0.1 мМ ЭДТА, белок элюировали линейным градиентом объёмом 40 мл от 50 мМ до 0,8 М КС1 буфера В. Белок сходил с колонки одним пиком при концентрации 0.4 М КС1.
Измерения малоуглового рассеяния
Термодинамические параметры взаимодействия eRP3 и eRFl с лигандами измеряли с помощью изотермического калориметра MicroCal VP-ITC (MicroCal, Northampton, MA) в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа ИМБ РАН. Опыты проводили в фосфатном и трисовом буферах в присутствии от 0 до 10 мМ концентраций Mg2+ при 25С. Все растворы дегазировали под ваккумом непосредственно перед измерениями. Чтобы получить результирующую кривую титрования, 10 мкл - аликвоту лиганда, инжектировали из шприца объёмом 296 мкл в ячейку, содержащую раствор белка объёмом 1.42 мл. Концентрация белка в ячейке и шприце варьировала от 6 до 15 и от 50 до 300 мкМ, соответственно. Теплоту разбавления измеряли путём инжекции лиганда в буфер или с помощью дополнительных инъекций лиганда после выхода кривой титрования на насыщение; полученные значения вычитали из суммарного теплового эффекта реакции чтобы получить эффективную теплоту связывания. Полученные кривые обрабатывали с помощью программы MicroCal Origin чтобы получить значения констант аффинности (Ка) и энтальпии (АН), предпологая один сайта связывания лиганда. Энергия Гиббса (AG) и энтропия (AS) посчитана исходя из уравнения: AG=-RTlnKa=AHAS.
Стехиометрия связывания, рассчитанная на основе данных ITC, eRF3 с eRFl и гуаниловыми нуклеотидами была ниже единицы, в физиологической концентрации Mg (2.0 мМ) это значение составляло 0.47±0.15. Как известно, eRF3 имеет один участок связывания с гуаниловыми нуклеотидами (Kong et al., 2004) и взаимодействует только с одной молекулой eRFl (Frolova et al., 1998), следовательно, эффективная концентрация молекул белков eRF3 и/или eRFl была ниже 100% (Ladbury J. Е., Doyle М. L., 2004). Это может быть связано с частичной инактивацией белков или олигомеризацией в процессе получения препарата белка или измерений.
При низком уровне сигнала, недостаточном для прямых измерений, использовали косвенный метод (Sigurskjold B.W. 2000), который состоял в измерении видимой константы связывания (Карр), соответствующей вытеснению одного лиганда другим. В таком случае, eRF3 насыщали лигандом L1 (ГТФ или ГДФ), затем титровали лигандом L2 (ГДФ или ГТФ) и определяли видимую константу связывания, соответствующую вытеснению лигандом L2 лиганда L1. Зная константу связывания К1 лиганда L1 определяли значение константы связывания К2 лиганда L2 для eRF3 исходя из уравнения К2=Карр(1+К1[Ы]). Все эксперименты проводили 2-4 раза.
Механизм декодирования стоп кодонов мРНК с участием белка eRFl до сих пор остаётся неясным. Для выявления функционально важных аминокислотных остатков в eRFl, участвующих в узнавании стоп кодонов, использовали точечный мутагенез, заменяя аминокислотные остатки в N-домене в участках предполагаемого взаимодействия eRFl со стоп кодонами мРНК находящейся в рибосоме, и определяли функциональную активность полученных мутантов. Данные по изменению функциональной активности этих мутантов in vitro позволили определить остатки, предположительно вовлеченные во взаимодействия со стоп кодонами мРНК в рибосоме (Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005).
Возможны разные причины изменений функциональной активности у мутантов eRFl: а) нарушение стереохимической комплементарности стоп-кодона и боковых групп аминокислот в участке узнавания eRFl, что ведёт к блокированию передачи сигнала от малой к большой субчастице рибосомы; б) опосредованное влияние на функцию декодирования через изменение общей или локальной конформации молекулы eRFl, вызванное изменением стабильности белковой глобулы; в) совместный вклад стереохимического и конформационного эффектов. Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) используется для идентификации возможных изменений в структуре белка, котрые могут возникнуть при мутагенезе (Hansen et al., 2005). Этот метод позволяет оценить изменения стабильности белковой глобулы в результате мутаций (Privalov & Potekhin, 1986; Любарев и Курганов, 2000; Ladbury & Doyle, 2004). Это даёт возможность в определённой степени различить функциональные последствия, вызванные дестабилизацией структуры в eRFl, от локальных стереохимических изменений, вызванных мутациями участка узнавания eRFl. Поэтому мы исследовали тепловую денатурацию eRFl и его мутантов и провели сравнительный анализ изменения их термостабильности. Функциональные свойства этих мутантов изучены ранее (Frolova et ah, 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005).
Термостабильность мутантов eRF 1 и его RF-активность
Расположение доменов в кристаллической структуре молекулы eRFl напоминает букву Y (рис. 14) (Song et al., 2000). Три домена белка смотрят в разные стороны, а контакты между доменами расположены в центральной части молекул eRFl (Song et al., 2000). Можно ожидать, что домены в молекуле eRFl под действием температуры будут плавиться независимо друг от друга, однако, как мы показали, плавление молекулы eRFl носит кооперативный характер. Это говорит о взаимодействии между доменами в растворе, которое может иметь место в центральной части молекулы eRFl, где все три домена могут контактировать между собой (рис. 14). В этом случае плавление доменов eRFl, вероятно, начинается одновременно с участка взаимодействия доменов. Возможно, кооперативное поведение доменов при термоденатурации каким-то образом связано с функцией передачи сигнала от стоп кодона мРНК, находящегося в малой субчастице рибосомы, в пептидил трансферазный центр большой субчастицы через N и М домены молекулы eRFl. Можно также предположить, что в кристалле при образовании димеров, образующих основу структуры в кристаллической ячейке, из-за невысокого разрешения (Song et al., 2000) не все междоменные контакты видны или не все сохраняются по сравнению с раствором.
В структуре N-домена eRFl человека можно выделить два минидомена: первый содержит NIKS - мотив, инвариантный в эукариотах с универсальным генетическим кодом (Киселев и др., 2000; Bertram et al., 2000; Song et al., 2000;) и второй мотив YxCxxxF (Seit-Nebi et al., 2002), имеющий в Y125-C127-F13 N129 своём составе как инвариантные Тугі25, Cysl27 и Phe 131, так и полуконсервативные аминокислотные остатки (рис. 17). С помощью сайт специфического мутагенеза удалось показать важную роль минидоменов NIKS и YxCxxxF для функции декодирования стоп сигнала (Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al, 2005). Однако, оставалось неясным, связано ли изменение RF-активности мутантов с нарушением функции декодирования стоп кодонов или с изменением пространственной структуры белка. Для выявления возможного вклада дестабилизации белковой глобулы в изменения RF-активности у мутантов использовали метод ДСК. Для анализа выбирали мутанты, содержащие замены функционально важных аминокислотных остатков, предположительно участвующие во взаимодействии со стоп кодонами или участвующие в поддержании структуры (Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005). Так, например, замена четырёх аминокислот в мутанте Asn61Ser+Ser64Asp+Asnl29Pro+Lysl30Gln приводит к полной потере активности по двум стоп кодоном (табл. 3), предполагая непосредственное участие упомянутых остатков в декодировании аденина во 2-м положении стоп кодона. Для установления причины изменения RF-активности необходимо провести сравнительный анализ между входящими в его состав точечными мутациям и близкородственными заменами (№10, 11, 13, 14, 15, 16, 17). В таблице 3 приведены температуры денатурации и изменения функциональной активности мутантов eRFl. Данные по изменению термостабильности позволяют разделить исследованные мутанты на четыре группы.
К первой группе отнесены мутации, влияющие на термостабильность eRFl или вызывающие несущественные её изменения, не превышающие 0.5С. Это мутанты Glu55Asp, Tyrl25Phe и Asn61Ser (табл. 3 №3, б и 16, соответственно). Учитывая данные рентгеноструктурного анализа кристаллов eRFl (Song et al., 2000) и изменения RF-активности мутантов по остатку Glu55 (табл. 3, №2, 3 и 4.), предполагается участие карбоксильной группы Glu55 в образовании водородной связи с ОН-группой Тугі25 (рис. 17) (Kolosov et al., 2005). Вероятно, сохранение водородной связи между остатками Glu55 и Туг125 необходимо для сохранения способности eRFl узнавать стоп кодон UAG, но необязательно для поддержания стабильности структуры как следует из данных калориметрии (табл. 3). В кристалле остатки Asn61 и Ser64 eRFl (рис. 17) располагаются на петле, соединяющей ос2 и осЗ а-спирали, и не участвуют во внутримолекулярных контактах (Song et al., 2000), следовательно, они не вовлечены в поддержание структуры белка. Учитывая все эти данные, уменьшение RF-активности этих мутантов можно отнести за счёт изменения стереохимических взаимодействий между мутантной формой eRFl и стоп кодоном мРНК в рибосоме.
Ко второй группе отнесены мутанты Glu55Arg, Glu55Ala, Asn61Ser+Ser64Asp, Cysl27Ala, Asnl29Ala и Ser64Asp (табл. З №1, 4, 17, 7, 10 и 15, соответственно). Замены аминокислот в этих мутантах приводят к слабым (в пределах 0.5 -2 С) эффектам на термостабильность белковой глобулы. Вероятно, функциональные эффекты при этих мутациях связаны не с дестабилизацией структуры, а с изменением локальных стереохимических взаимодействий. Влияние такой дестабилизации на функцию eRFl маловероятно, если учесть, что более глубокое падение термостабильности не влияет на RF-активность некоторых мутантов (табл. 3, №7 и 8). В качестве примера рассмотрим мутант Cysl27Ala. Поскольку более сильное падение термостабильности у мутанта Cysl27Ser не приводит к падению его RF-активности по сравнению с мутантом Cysl27Ala, можно предположить, что изменение в RF-активности этих мутантов не связано с уменьшением их термостабильности. Поверхностное расположение Cysl27 в кристалле eRFl (Song et al., 2000) не предполагает его участия во внутримолекулярных контактах. Эта интерпретация подкрепляется тем, что RF - активность этого мутанта по UGA-кодону почти не снижается, что говорит о достаточной стабильности мутантного белка.
