Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Терминация трансляции 10
1.1.1. Факторы терминации 1 -го класса 10
1.1.2. Факторы терминации 2-го класса 26
1.2. Вариантные генетические коды 33
1.2.1. Митохондрии 33
1.2.2. Прокариоты 34
1.2.3. Эукариоты 35
1.2.4. Кодирование селеноцистеина и пирролизина 41
1.3. Гипотезы о причинах возникновения вариантных генетических кодов 43
1.3.1. Гипотеза исчезновения кодона 43
1.3.2. Гипотеза минимизации генома 44
1.3.3. Гипотеза «неопределенного интермедиата» 44
1.3.4. Гипотеза точечного мутагенеза eRF 1 45
1.4. Эволюция генетического кода 46
Глава 2.Материалы и методы исследований 50
2.1. Материалы 50
2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды 50
2.1.2. Среды 51
2.1.3. Реактивы 51
2.1.4. Ферменты 52
2.1.5. Олигонуклеотиды 52
2.2. Методы исследований 54
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 54
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 54
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК 55
2.2.4. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК 55
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56
2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера" 56
2.2.7. Метод мегапраймерной ПЦР со сменой матрицы 57
2.2.8. Амплификация N-концевых частей гена eRFl
Euplotes aediculatus и Stylonychia mytilus 58
2.2.9. Конструирование генов химерных eRFl 58
2.2.10. Синтез и выделение белков 60
2.2.11. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ 61
2.2.12. Определение активности eRFl 61
2.2.13. Культура клеток и трансфекция 62
2.2.14. Измерение активности люциферазы и Р-галактозидазы 62
2.2.15. Определение уровня "сквозного прочтения" (readthrough) 63
Глава 3. Результаты исследований 65
3.1. Измерение in vitro RF-активности химерных eRFl стилонихия/человек 65
3.2. Определение влияния химерных eRFl стилонихия/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека 69
3.3. Измерение in vitro RF-активности мутантных eRFl парамеция/человек 72
3.4. Определение влияния химерных eRFl эуплота/человек
на уровень сквозного прочтения в клетках человека 74
Глава 4. Обсуждение результатов 79
4.1. Методы определения специфичности декодирования eRF 1 79
4.2. Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-концевым доменом eRF 1 80
4.3. В ресничных Stylonychia и Paramecium UGA-специфичность достигается за счет различных аминокислотных остатков N-концевого домена eRF 1 82
4.4. Два участка последовательности eRFl эуплоты,
препятствующие декодированию кодона UGA 84
4.5. Аминокислотные остатки eRFl, определяющие специфичность узнавания стоп-кодонов различны в ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes 87
4.6. Возникновение вариантного генетического кода в ресничных: гипотеза мутагенеза eRF 1 89
4.7. Заключение 90
Выводы 92
Благодарности 93
Список литературы 94
- Факторы терминации 2-го класса
- Выделение плазмидной ДНК из Е. coli
- Определение влияния химерных eRFl стилонихия/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека
- Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-концевым доменом eRF 1
Введение к работе
Генетический код состоит из 64 кодонов. В организмах, использующих универсальный генетический код, для кодирования 20 природных аминокислот используется 61 смысловой или значащий кодон, а три кодона - UAA, UAG и UGA, названные стоп, нонсенс или терминирующими, служат для остановки белкового синтеза. В организмах, использующих вариантные, неуниверсальные или альтернативные генетические коды, изменены значения некоторых кодонов. Отклонения от универсального кода приводят к изменению смысла кодирования значащих (sense) кодонов или к использованию стоп-кодонов для кодирования определенных аминокислотных остатков.
На ранних этапах изучения проблемы передачи информации полагали, что генетический код универсален для всех царств живой природы и, возникнув один раз на заре эволюции, код уже не изменялся до настоящего времени. Считали, что изменения в генетическом коде невозможны, так как любые из них будут летальными. Но затем были найдены нестандартные (неканонические, альтернативные) версии кода в митохондриях. После этого открытия вариантные коды обнаружили в простейших ресничных (Ciliophora), относящихся к эукариотам, в микоплазме (прокариоты), в некоторых дипломонадах {Diplomonadida), в одном из родов дрожжей Candida и в зеленых водорослях Acetabularia (Soil and RajBhandary, 2006). Во всех вариантах нестандартных кодов (кроме дрожжей Candida) использовались стоп-кодоны для кодирования аминокислот. Более того, стоп-кодоны UGA и UAG могут кодировать селеноцистеин (21-я аминокислота) и пирролизин (22-я аминокислота) соответственно в организмах как с универсальным, так и с вариантным генетическим кодом (Нао et al., 2002).
В универсальном коде стоп-кодоны UAA, UAG и UGA используются для терминации трансляции и узнаются факторами терминации 1-го класса, которые затем индуцируют гидролиз пептидил-тРНК в рибосоме. В прокариотах два фактора терминации 1-го класса, RF1 и RF2, узнают
UAG/UAA и UGA/UAA соответственно, а в эукариотах фактор eRFl узнает все три стоп-кодона (Kisselev et al., 2003). Функционально eRFl сходны с тРНК, т.к. декодируют стоп-кодон в малой субъединице рибосомы и активируют пептидилтрасферазный центр в большой субъединице (Kisselev and Buckingham, 2000). За узнавание стоп-кодонов ответствен N-концевой домен eRFl (Bertram et al., 2000; Chavatte et al., 2002; Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005). Факторы терминации 2-го класса, RF3 и eRF3, представляют собой eRFl-зависимые (для eRF3) и рибосомо-зависимые GTP-азы, которые стимулируют активность факторов 1-го класса (Frolova et al., 1996; Zavialov et al., 2001; Alkalaeva et al., 2006) и выход RF1/RF2 из рибосом.
Во многих вариантах альтернативного кода происходит изменение смысла стоп-кодонов. "Переосмысленные" стоп-кодоны больше не используются для терминации трансляции, а кодируют аминокислотный остаток. Для этого необходимо присутствие тРНК, которая может узнавать стоп-кодон, что возможно, если антикодон тРНК мутирует. В свою очередь, фактор терминации 1-го класса должен потерять способность узнавать такой "переосмысленный" стоп-кодон или иметь к нему низкое сродство, позволяя соответствующей тРНК декодировать этот стоп-кодон. Общепринято, что ресничные произошли от организмов с универсальным кодом, поэтому в первичной структуре eRFl ресничных должны существовать аминокислотные остатки, ответственные за изменение специфичности декодирования стоп-кодонов.
Одной из наиболее широко представленных групп организмов с вариантным генетическим кодом у эукариот являются ресничные инфузории. В этой группе организмов встречаются различные виды вариантных кодов. Например, в ресничных Euplotes кодон UGA кодирует цистеин (Meyer et al., 1991), а в ресничном Blepharisma - триптофан (Lozupone et al., 2001). В ресничных Stylonychia и Paramecium кодоны UAA и UAG используются для кодирования глутамина и только UGA служит для терминации биосинтеза белка (Caron and Meyer, 1985; Helftenbein, 1985).
Молекулярные механизмы декодирования стоп-кодонов у организмов с универсальным генетическим кодом изучены недостаточно, а у организмов с вариантным генетическим кодом - вообще не изучены. В организмах с вариантным генетическим кодоном об узнавании стоп-кодонов известно очень мало. Почти ничего неизвестно об аминокислотных остатках фактора eRFl ресничных, ответственных за специфичность узнавания стоп-кодонов. Неизвестны также пути возникновения вариантных кодов у ресничных: что возникло раньше - переосмысление стоп-кодона (ов) в значащий (значащие) или изменение специфичности декодирования eRFl? Изучение декодирующих свойств eRFl ресничных инфузорий является не только актуальным, но и позволит приблизиться к пониманию возможных путей возникновения вариантных генетических кодов у ресничных.
Основная цель работы состояла в идентификации участков N-концевого домена eRFl ресничных, относящихся к разным вариантным кодам, которые определяют декодирующие свойства этих белков. В рамках поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1) экспериментально показать, что N-концевые домены eRFl ресничных, подобно N-концевым доменам eRFl со стандартным кодом, целиком определяют декодирующие свойства исследуемых факторов; 2) получить химерные конструкции, сочетающие различные участки N-домена eRFl ресничных и человека; 3) выделить, очистить и охарактеризовать функциональную активность полученных химерных форм eRFl;"4) получить генно-инженерные конструкции химерных eRFl для экспрессии in vivo в клетках человека; 5) охарактеризовать влияние химерных eRFl на уровень сквозного прочтения (readthrough) в отношении 3-х стоп-кодонов в клетках человека.
В этой работе исследовали декодирующие свойства eRFl трех ресничных инфузорий: Euplotes aediculatus, Stylonychia mytilus и Paramecium tetraurelia. Ha эволюционном древе ресничные и млекопитающие находятся далеко друг от друга, поэтому существует большая вероятность неэффективного связывания eRFl ресничных с рибосомой млекопитающих. Для преодоления этой
трудности мы сконструировали химерные белки, состоящие из N-домена eRFl Euplotes или Stylonychia и МС-домена eRFl человека. Рибосомы млекопитающих способны связывать МС-домен eRFl человека в отсутствие N-домена (Дубовая и др., 2006). Ранее, с использованием "химерного" подхода показано, что узнавание стоп-кодонов определяется N-доменом eRFl эуплоты (Chavatte et al., 2003b; Salas-Marco et al., 2006). В случае с Paramecium, в eRFl человека вводили мутации в соответствии с аминокислотной последовательностью eRFl парамеции. Для определения специфичности химерных и мутантных eRFl использовали две тест-системы: in vitro и in vivo. In vitro измеряли RF-активность (Release Factor activity) eRFl в отношении трех стоп-кодонов (Frolova et al., 1994). In vivo в культуре клеток человека характеризовали влияние исследуемых eRFl на сквозное прочтение стоп-кодона (readthrough) с использованием двойной репортерной системы (Bidou et al., 2000). Обе системы подходят для сравнения ответа исследуемых eRFl на разные стоп-кодоны.
В работе впервые создан набор генно-инженерных конструкций eRFl для двух родов ресничных инфузорий, в которых N-домен eRFl ресничных соединен с МС-доменом человека, что позволило тестировать функциональную активность полученных химер на рибосомах млекопитающих. Благодаря разработанному методологическому подходу, впервые установлены участки N-концевого домена eRFl стилонихии и эуплоты, ответственные за их вариантные декодирующие свойства. Методом точечного мутагенеза впервые установлены два участка в N-концевом домене eRFl парамеции, определяющие UGA-специфичность. Практическая ценность полученных результатов состоит в том, что найдено несколько способов изменения декодирующих свойств eRFl (например, превращение омнипотентного eRFl человека в eRFl, узнающий только стоп-кодон UGA), что открывает новые перспективы исправления наследственных дефектов геномов путем считывания нонсенс мутаций как смысловых, используя in vivo eRFl с направленно измененными декодирующими свойствами ("трансляционная терапия").
Факторы терминации 2-го класса
Факторы терминации 2-го класса (RF3 у прокариот и eRF3 у эукариот) представляют собой рибосомозависимые и eRFl-зависимые (в случае eRF3) GTP-азы, стимулирующие активность факторов 1-го класса. eRF3 кодируется жизненно необходимым геном, тогда как делеция гена RF3 в прокариотах не приводит к смерти клеток (Mikuni et al., 1994). eRF3 способен связывать GTP, однако его GTP-азная активность активируется только в присутствии eRFl и рибосомы (Frolova et al., 1996; Frolova et al., 1998). В отличие от eRF3, RF3 не нуждается в присутствии факторов RF1/RF2 для гидролиза GTP. eRF3, связанный с GTP, взаимодействует с eRFl и рибосомой, в результате чего формируется активный терминирующий комплекс in vitro и in vivo (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al., 1995; Frolova et al., 1998). Показано, что гидролиз GTP способствует декодированию стоп-кодона фактором eRFl (Salas-Marco and Bedwell, 2004). В дрожжах S. cerevisiae факторы eRFl и eRF3 кодируются генами SUP45 и SUP35 соответственно, мутации в которых приводят к омнипотентному супрессорному фенотипу (см. обзор Inge-Vechtomov et al., 2003).
С-концевой участок eRF3 является высококонсервативным, имеет значительное сходство с фактором элонгации EF1A и содержит четыре канонических GTP-связывающих мотива (Samsonova et al., 1991). С-концевая часть eRF3 необходима для жизнеспособности клеток и взаимодействия с eRFl (Ter-Avanesyan et al., 1993). В отличие от С-концевого участка, N-участок негомологичен и отличается по длине и аминокислотной последовательности у разных организмов (Kushnirov et al., 1990). N- и М-домены не являются жизненно необходимыми и не участвуют в терминации трансляции, но ответственны за взаимодействие с ро1у(А)-связывающим белком (РАВР). Взаимодействие N-концевой части eRF3 с РАВР является связующим звеном между терминацией и инициацией биосинтеза белка (Hoshino et al., 1999).
В дрожжах S. cerevisiae N-домен eRF3 ответствен за образование прионной формы [PSf]. В клетках с генотипом [PSt] фактор eRF3 образует агрегаты, которые связывают eRFl, что приводит к ухудшению эффективности терминации трансляции и повышению уровня сквозного прочтения на стоп-кодонах (Paushkin et al., 1996; Bidou et al., 2000). Показано, что М-домен eRF3 также играет важную роль в образовании прионов (Liu et al., 2002). В настоящее время неизвестно, возможно ли образование прионов у высших эукариот.
В геномах человека, мыши и крысы найдены две копии гена eRF3, обозначенные eRF3a (ген GSPT1) и eRF3b (ген GSPT2) (Hoshino et al., 1999; Якобсен и др., 2001). Аминокислотные последовательности eRF3a и eRF3b гомологичны на 87% и большинство различий локализовано в протяженных негомологичных N-концевых областях. Оба фактора связываются с eRFl и стимулируют его активность in vitro (Якобсен и др., 2001). Ген eRF3a экспрессируется в клетках всех типов тканей и уровень его экспрессии сравним с таковым для eRFl, тогда как экспрессия eRF3b значительно ниже. Показано, что запрет экспрессии гена eRF3a с помощью коротких интерфирирующих РНК приводит к значительному увеличению сквозного прочтения стоп-кодонов, тогда как при выключении гена eRF3b каких-либо изменений в уровне сквозного прочтения не наблюдали. С другой стороны, при увеличении экспрессии гена eRF3b в фибробластах человека, eRF3b может полностью заменять eRF3a в терминации трансляции. Исходя из этих наблюдений сделан вывод, что eRF3a играет основную роль в терминации трансляции в клетках млекопитающих. Кроме того, уменьшение уровня экспрессии eRF3a в клетках приводит также к уменьшению уровня eRFl. Высказано предположение, что eRFl возможно подвергается протеолитическому расщеплению, когда не связан с eRF3, что позволяет более тонко регулировать терминацию трансляции (Chauvin et al., 2005). С-концевую часть eRF3 можно разделить на GTP-связывающий домен, который напоминает соответствующие домены в RF3, EF-G, EFu и EF1A, и С-домен, необходимый для взаимодействия с eRFl (см. обзоры Kisselev and Buckingham, 2000; Kisselev et al., 2003). Кроме взаимодействия с eRFl, eRF3 также взаимодействует с белками Upflp, Upf2p и UpGp, входящими в состав РНК-белкового комплекса, участвующего в деградации мРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон (NMD). Эти взаимодействия, по-видимому, также оказывают влияние на эффективность терминации трансляции (Wang et al., 2001).
Определена кристаллическая структура С-концевой части eRF3 S.pombe (Kong et al., 2004), которая, как оказалось, в общих чертах напоминает структуру EFu. Однако в отличие от EFu, связывание eRF3 с GTP/GDP не приводит к большим конформационным изменениям eRF3. Ионы Mg не влияют на связывание GTP с дрожжевым eRF3, а при высокой концентрации увеличивают высвобождение GTP из комплекса eRF3-GTP, поэтому высказано предположение, что eRF3 обладает иным механизмом нуклеотидного обмена по сравнению с другими ОТРазами (Kong et al., 2004).
На основании недавних исследований, связанных с взаимодействием eRF3 с GTP, сделаны следующие выводы. Свободный eRF3 имеет более высокое сродство к GDP, чем к GTP, и вероятно, в клетке eRF3 находится в связанной с GDP форме (eRF3-GDP), как и RF3 у прокариот. Однако, eRFl оказывает сильный эффект на связывание GTP с eRF3 при образовании комплекса eRFl-eRF3. Такой комплекс уже имеет большее сродство к GTP, чем к GDP. Таким образом, скорее всего факторы терминации eRFl и eRF3 связываются с рибосомой в форме комплекса eRFl-eRF3-GTP, аналогично связыванию комплекса EFlA-GTP-аминоацил-тРНК с рибосомой (Hauryliuk et al., 2006; Mitkevich et al., 2006; Pisareva et al., 2006; Kononenko et al., 2007).
Выделение плазмидной ДНК из Е. coli
Трансформацию бактерий Е. coli проводили по методу Манделя и Хига (Mandel and Higa, 1970) с модификациями. Для получения компетентных клеток в пробирку с 5 мл среды LB вносили 100 мкл ночной культуры. Клетки выращивали при 37С с аэрацией до достижения оптической плотности OD60o=0.6. Культуру охлаждали во льду в течение 5 мин. После чего бактерии осаждали центрифугированием при 4С. Клетки суспендировали в 1 мл охлажденного во льду стерильного раствора, содержащего 50 мМ СаС12, 10 мМ трис-НС1, рН 8.0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 30 мин, осаждали центрифугированием при 4С и суспендировали в 200 мкл охлажденного во льду стерильного раствора 50 мМ СаС12, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. К полученным компетентным клеткам добавляли ДНК в лигазном буфере или в воде. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 30 мин и затем подвергали тепловому шоку при 42С (2 мин.). К клеткам добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37С. Трансформирующую смесь высевали на соответствующие селективные среды и выращивали при 37С.
ПЦР проводили на приборе MyCycler фирмы "Bio-Rad" (США) в 50 мкл смеси, содержащей однократный буфер для соответствующей ДНК-полимеразы, рекомендованный фирмой-поставщиком, 240 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 0.4 мкМ 5 - и З -концевых праймеров, 10-100 нг матричной ДНК, 2.5 ед. акт. ДНК-полимеразы. После предварительной денатурации при 95С в течение 3 мин следовали 25 циклов: денатурация -95С, 30 сек.; отжиг - 30 сек. при температуре, соответствующей среднему значению Тт (температура плавления), рассчитанной для каждого из пары используемых в данной реакции 5 - и З -концевых праймеров с помощью компьютерной программы "Omiga 2.0" (Oxford Molecular Ltd.); синтез - 72C, от 30 сек. до 2 мин. в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента ДНК.
Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраимера" (Sarkar and Sommer, 1990) проводили в две стадии. На первой стадии проводили ПЦР с помощью праймера, комлементарного 5 -концу гена, и З -концевого "мутагенного" праймера, несущего требуемую замену нуклеотидов. При этом уникальный сайт для рестриктазы имел только один праймер -комплементраный 5 -концу гена. ПЦР-фрагмент ДНК очищали и использовали в следующей стадии в качестве "мегапраимера". На второй стадии проводили ПЦР с использованием праймера, комплементраного 3 -концу гена и имеющего уникальный сайт для рестриктазы, и полученного "мегапраимера" в качестве комплементраного 5 -концу гена. После проведения ПЦР полученный фрагмент ДНК очищали, последовательно обрабатывали соответствующими рестриктазами и лигировали с заранее подготовленным вектором, обработанным теми же рестриктазами. После трансформации клеток Е. coli лигированной смесью отбирали отдельные клоны, выделяли плазмидную ДНК и подтверждали присутствие требуемой замены секвенированием.
На первом этапе амплифицировали интересующую часть нуклеотидной последовательности гена А с помощью праймера 1, комлементарного 5 -концу гена, и З -концевого праймера 2, несущего последовательность гена А на 3 -конце, и последовательность гена В на 5 -конце. На втором этапе полученный ПЦР-продукт очищали и использовали как мегапраймер в ПЦР, но с последовательностью гена В в качестве матрицы (рис. 2.1). После проведения ПЦР полученный фрагмент ДНК очищали, последовательно обрабатывали соответствующими рестриктазами и лигировали с заранее подготовленным вектором, обработанным теми же рестриктазами. После трансформации клеток Е. coli лигированной смесью отбирали отдельные клоны, выделяли плазмидную ДНК и подтверждали присутствие требуемой замены секвенированием.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие N-концевые домены eRFlb Е. aediculatus и eRFl S. mytilus амплифицированы в клетках Е. aediculatus и S. mytilus соответственно. Культуры клеток инфузорий любезно предоставлены М.С. Раутиан (Санкт-Петербургский государственный университет). Несколько клеток культуры ресничной инфузории собирали центрифугированием при 11000 g. Осадок ресуспендировали в 50 мкл ПЦР-смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCl, рН 8.6, 16 мМ (NH4)2S04, 2.5 мМ MgCl2, 0.1% Тритон Х-100, 0.2 мМ каждого dNTP, 2 мкМ олигонуклеотидных праймеров (праймеры содержат Ndel и Xhol сайты рестрикции на 5 -конце) и 2.5 ед. акт. HiFi ДНК полимеразы (Sileks). ПЦР-продукты гидролизовали Ndel и Xhol рестриктазами и лигировали с плазмидой pET23b (Novagen), обработанной теми же рестриктазами. Плазмиды с клонированным геном N-домена eRFl Е. aediculatus и S. mytilus названы рЕТ23ЬЕи и pET23bSt соответственно.
Определение влияния химерных eRFl стилонихия/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека
Для экспрессии генов факторов терминации трансляции эукариот использовали конструкцию на основе вектора рЕТ23Ь(+) и штамм Е. coli BL21(DE3)pUBS520. Для препаративного выделения белков к 100-200 мл культуры Е. coli, выращенной до OD6oo=0.5 при 37С с аэрацией на среде LB, содержащей соответствующие антибиотики, добавляли IPTG до конечной концетрации 0.1-1мМ, и растили культуру еще 4-16 часов с аэрацией при температуре от 18 до 25С. Клетки собирали центрифугированием при 4500 g, осадок ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7.5,100 мМ КС1, 1% Triton Х-100,10% глицерин, 1 мг лизоцима, 0.1 мМ PMSF. Лизат выдерживали во льду 30 мин, после чего клетки разрушали ультразвуком на приборе Sonifier 250 фирмы "Branson" в течение 2 мин при 50% мощности импульсов. Лизат центрифугировали при 8000g 30 мин при 4С. К супернатанту добавляли 300 мкл 50% суспензии смолы Ni-NTA Superflow, уравновешенной буфером "А" (50 мМ трис-НС1, рН 7.5, 100 мМ КС1, 10% глицерин, 5 мМ меркаптоэтанол,10 мМ имидазол). Раствор со смолой перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и переносили в колонку со стеклянным фильтром. Смолу с адсорбированным белком промывали 3 раза 10 мл буфера "А". Элюцию белка проводили 3 раза по 0.5 мл буфера "А", содержащим 100 мМ имидазола. Присутствие белка во фракциях определяли на спектрофотометре по поглощению при 280 нм. Фракции, содержащие белок, диализовали против буфера, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН7.5, 100 мМ КС1, 0.1 мМ ЭДТА и 5% глицерин, 12 час при 4С. Чистоту белка определяли электрофорезом в денатурирующем 12% ПААГ с 0.1% SDS. Диализованный белок хранили замороженым при -70С. Концентрацию белка определяли по поглощению в УФ.
Чистоту выделенных белков анализировали в 12% ПААГ, содержащим 0.1% SDS. В качестве электрофоретического буфера использовали трис-глициновый буфер с SDS (25 мМ трис, 250 мМ глицин и 0.1% SDS, рН 8.3). Образцы наносили на гель в буфере, содержащим 50 мМ трис-HCl, рН 6.8, 100 мМ Р-меркаптоэтанола, 1% SDS, 0.01% бромфеноловый синий и 20% глицерина, предварительно выдержав на водяной бане 5 мин при 100С. После электрофоретического разделения белков гель окрашивали раствором 0.25% Кумаси синего R250 и визуализировали в белом свете.
Активность eRFl определяли при насыщающей концентрации (50 мкМ) одного из тетрарибонуклеотидов, содержащих стоп-код он (Caskey et al., 1974; Frolova et al., 1994). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5; 15 мМ MgCl2; 8мМ NH4C1; 1.5 пмоль комплекса fpSJMetPHK -AUG-рибосома и 4 пмоль eRFl. Реакцию проводили при 25С в течение 20 мин. Для остановки реакции к смеси добавляли 0.1 мл 0.1N НС1 и 0.5 мл этилацетата. Раствор перемешивали 30 сек на Vortex e, после чего центрифугировали 10 мин при 11000g. К 0.375 мл отобранной органической фазы добавляли 2 мл жидкого сцинтиллятора и определяли количество высвободившегося f[ S]Met (имп/мин) на счетчике "SL30" фирмы "Intertechnique". 2.2.13. Культура клеток и трансфекция
Фибробласты человека С293 культивировали на чашках диаметром 10 см в среде DMEM с добавлением эмбриональной сыворотки теленка (FCS) до 10% при 37С в атмосфере с 5.5% СО2. Для трансфекции использовали метод ДНК/фосфат-копреципетации (Cassan et al., 1994). На чашках с количеством клеток примерно один миллион заменяли среду на свежую за 2-3 часа до трансфекции. Из расчета на одну чашку: к 62.5 мкл 2 М раствора СаСЬ добавляли по 10 мкг вектора pcDNA3, несущего химерный ген eRPl, и 10 мкг репортерного вектора pACstop, несущего гены Р-галактозидазы и люциферазы, общий объем доводили водой до 500 мкл. Полученный раствор по каплям, при постоянном перемешивании, добавляли к 500 мкл раствора HeBS (280 мМ NaCl, 10 мМ КС1, 1.5 мМ Na2HP04, 12 мМ глюкоза, 50 мМ HEPES), затем инкубировали 30 мин при комнатной температуре, в результате чего образовывался коллоидный осадок. Полученную суспензию добавляли к клеткам. На второй день старую среду заменяли на свежую. Клетки собирали на третий день после трансфекции. Для этого промывали клетки фосфатным буфером (20 мМ, рН 6.8) и отделяли от субстрата с помощью 0.05% р-ра трипсина.
Собранные после трансфекции клетки осаждали центрифугированием при 4С и ресуспендировали на шейкере 5 мин при 4С в 100 мкл буфера "Luc", содержащего 25 мМ трис-фосфата, рН 7.8, 8 мМ MgCb, 1мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритона XI00, 0.1% БСА и 15% глицерина. Клеточный осадок осаждали центрифугированием при 4С. Измерения активности люциферазы проводили в буфере "Luc" с добавлением 2 мМ АТР и 0.2 мМ люциферина с использованием 20 мкл супернатанта. Измерения проводили на приборе Lumat LB9501 фирмы "Berthold" (Германия) при комнатной температуре.
Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-концевым доменом eRF 1
В организмах с универсальным генетическим кодом специфичность узнавания стоп-кодонов определяется исключительно N-концевым доменом eRFl (Bertram et al., 2000; Frolova et al., 2002; Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005). Для организмов с вариантным кодом это менее очевидно, т.к. в настоящее время существуют противоречивые данные о "достаточности" N-концевого домена eRFl для запрещения узнавания некоторых стоп-кодонов в инфузории Tetrahymena (Ito et al., 2002; Salas-Marco et al., 2006). Для решения этой проблемы в случае ресничных эуплота и стилонихия нами сконструированы химерные белки, состоящие из N-домена eRFlb Е. aediculatus или eRFl S. mytilus и МС-домена eRFl человека. Функциональный анализ этих химерных eRFl показал, что специфичность узнавания стоп-кодонов фактором eRFl в ресничных эуплота и стилонихия определяется исключительно N-доменом eRFl этих организмов. Химерный белок St-І, состоящий из N-концевого домена eRFl стилонихии и МС-домена eRFl человека узнает стоп-кодон UGA со 100% эффективностью, но не узнает кодоны UAA и UAG in vitro (рис. 3.1). При экспрессии конструкции St-І в клетках человека значительно повышается уровень сквозного прочтения на стоп-кодонах UAA (6.0%, увеличение в 18.9 раза) и UAG (11.3%, увеличение в 5.5 раза), в то время как уровень сквозного прочтения на UGA практически не изменяется (рис. 3.3). Данные, полученные in vitro, согласуются с данными in vivo: химерный белок St-І, потерявший способность узнавать UAA и UAG, не конкурирует с тРНК за связывание с этими стоп-кодонами, в результате чего уровень сквозного прочтения на UAA и UAG значительно возрастает. Эти данные согласуются с тем, что у стилонихии кодоны UAA и UAG используются для кодирования глутамина, а кодон UGA служит для терминации белкового синтеза. В ресничном Euplotes кодон UGA используется для кодирования цистеина, а UAA и UAG выполняют роль стоп-кодонов. Экспрессия в клетках человека Еи-1, состоящего из N-концевого домена eRFl эуплоты и МС-домена eRFl человека, приводит к значительному возрастанию уровня сквозного прочтения на кодоне UGA (1.61%, увеличение в 107 раз), в тоже время уровень сквозного прочтения на кодонах UAA (0.019%, увеличение в 2 раза) и UAG (0.032%, увеличение в 3 раза) меняется незначительно (рис. 3.5). Более того, химерный белок Еи-1 узнает кодоны UAA и UAG, но не узнает UGA in vitro. Специфичность узнавания стоп-кодонов eRFl парамеции также определятся N-доменом. Этот вывод сделан на основании того, что одновременная замена участка 61-64 (NIKS) и 122-131 в eRFl человека на соответствующую аминокислотную последовательность eRFl парамеции приводит к полной потери способности химерного белка Ра-2 узнавать стоп-кодоны UAA и UAG in vitro, однако узнавание UGA сохраняется (рис. 3.4).
Таким образом, в ресничных инфузориях Stylonychia, Euplotes и Paramecium специфичность декодирования стоп-кодонов полностью определяется N-концевым доменом eRFl, как и в организмах с универсальным генетическим кодоном.
В ресничных инфузориях парамеция и стилонихия кодоны UAA и UAG используются для кодирования аминокислотных остатков, тогда как UGA выполняет функцию стоп-кодона (Lozupone et al., 2001). Сравнение декодирующих свойств N-доменов eRFl ресничных позволит выяснить, одинаковые ли способы достижения одной и той же специфичности узнавания стоп-кодонов используются в разных ресничных инфузориях.
Замена положений 122-126 в eRFl человека на пентапептид QFMYF, соответствующий последовательности eRFl стилонихии, приводит к неспособности химерного St-13 узнавать стоп-кодоны UAA и UAG (рис. 3.3). В том случае, если аминокислотный остаток F126 заменить на остаток лейцина, соответствующий последовательности eRFl человека, наблюдается узнавание UAA и UAG, однако с небольшой эффективностью (St-14). С другой стороны, замена F126L в конструкте St-б, обладающем UGA-специфичностью, не приводит к нарушению узнавания стоп-кодона UGA (St-7) (рис. 3.1). Из анализа конструкций St-4, St-5 и St-6 очевидно, что в QFMYF основную роль в определении UGA-специфичности играет дипептид QF, тогда как аминокислотные остатки М124 и F126 способствуют UGA-специфичности. Учитывая, что аминокислотный мотив YxCxxxF eRFl человека (положения 125-131) играет основную роль в узнавании пуриновых нуклеотидов во 2-ом и 3-ем положениях стоп-кодона (Seit-Nebi et al., 2002; Kolosov et al., 2005), мы предполагаем, что декапептид в положениях 122-131 является основным узнающим участком в eRFl человека и стилонихии.
