Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Общее строение и характеристика вириона вируса гриппа А . 15
1.2. Характеристика генома вируса гриппа. Функции вирусных белков вируса гриппа А 18
1.2.1. Сегменты РНК 1, 2, 3. Гены, кодирующие Р-полипептидьт . 19
1.2.2. 5-ый сегмент РНК кодирует нуклеокапсидный белок 20
1.2.3. 4-ый и 6-ой сегменты РНК кодируют соответственно белки гемагглютинин и нейраминшшу 21
1.2.4.7-ой сегмент РНК кодирует матриксный белок Ml и транс мембранный белок М2 26
1.2.5 8-й сегмент РНК кодирует неструктурный белок NS1 и белок ядерного экспорта NS2 (NEP) 28
1.3. Молекулярные основы антигенной изменчивости вируса гриппа А при эпидемическом процессе 30
1.4. Картирование антигенных участков (сайтов) в трехмерной структуре гемагглютинина вируса гриппа А разных подтипов 38
1.5. Влияние структурных изменений гемагглютинина вируса гриппа А на его функциональные свойства 43
1.6. Вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н9, как возможные агенты будущих пандемий 53
Глава 2. Материалы и методы исследования 61
2.1. Экспериментальные методы 61
2.1 1. Использованные в работе вирусы 6і
2.1.2 Адаптация вируса к репродукции в легких мышей 62
2.1.3. Панель моноклональных антител (МКАТ) 62
2.1.4. Селекция escape-мутантов 63
2.1.5. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) 65
2.1.6. Концентрация и очистка вируса 65
2.1.7. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА) 65
2.1.8. Определение сродства гемагглютинина к сиалосодержащим субстратам 66
2.1.9. Титрование инфекционное вирусов на куриных эмбрионах 67
2.1.10. Определение летального эффекта вирусов для мышей . 68
2.1 1 1. Реакция нейтрализации инфекционности 68
2.1.12. Метка белков 14С-гидролизатом хлореллы в зараженных клетках 68
2.1.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 69
2.1 1.4. Радиоиммунопреципитационный анализ 69
2.1.1 5. Выделение вирусной РНК 70
2.1.16. Получение вирусной кДНК 71
2.1.17. Полимеразная цепная реакция 72
2.1.18. Электрофорез в агарозном геле 72
2.1.19. Автоматическое секвенирование 73
2.2. Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей 74
2.3. Статистическая обработка результатов. Вычисление ошибки эксперимента 74
Глава 3. Результаты 75
3.1. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Ы5 75
3.1 1 Получение одиночных, двойных и тройных escape-мутантов подтипа Н5
3.1.2. Характеристика escape-мутантов подтипа Н5 в перекрестных иммунологических реакциях (РТГА и ТФИФА) с панелью моноклональных антител 76
3.1.3. Секвенирование генов гемагглютинина escape-мутантов подтипа Н5 82
3.1.4. Построение трехмерной структуры гемагглютинина подтипа Н5 85
3.1.5. Роль дополнительного сайта гликозилирования в блокировании связывания молекулы гемагглютинина с МКАТ . 88
3.2. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9 92
3.2.1. Адаптация вируса A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) к репродукции в легких мышей 92
3.2.2.Получение одиночных и двойных escape-мутантов подтипа Н9 94
3.2.3. Характеристика escape-мутантов подтипа Н9 в перекрестных иммунологических реакциях (РТГА и ТФИФА) с панелью моноклональных антител 97
3.2.4. Секвенирование генов гемагглютинина escape-мутантов подтипа Н9 104
3.2.5. Построение трехмерной структуры НА подтипа Н9 109
3.3. Фенотипическая характеристика escape-мутантов подтипов Н5иН9 112
3.3.1. Вирулентность escape-мутантов подтипов Н5 и Н9 112
3.3.2. Аффинность гемагглютинина escape-мутантов подтипов Ы5 и Н9 к сиалосодержащим субстратам 117
Глава 4. Обсуждение 126
Выводы 139
Список литературы 141
- Молекулярные основы антигенной изменчивости вируса гриппа А при эпидемическом процессе
- Влияние структурных изменений гемагглютинина вируса гриппа А на его функциональные свойства
- Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей
- Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9
Введение к работе
Вирус гриппа является одним из важнейших патогенных вирусов человека и животных, вызывающих широко распространенные заболевания и приводящих к высокой смертности. Вирус гриппа А способен вызывать пандемии. Поэтому он с момента выделения является объектом пристального изучения и к настоящему времени изучен более полно, чем вирусы типов В и С. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, поражает многие виды млекопитающих и птиц и отличается весьма значительной вариабельностью. Особенно вариабельными являются поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).
В настоящее время описаны 15 антигенных подтипов гемагглютинина (от HI до HI5) и 9 подтипов нейраминидазы (от N1 до N9) вируса гриппа А. За последние 17 лет удалось обнаружить только два новых подтипа НА вируса гриппа А (Н14 и Н15) [118; 192], несмотря на интенсивный скрининг вирусов среди птиц, низших млекопитающих и людей [23; 144; 145]. Возможно, что этим не ограничивается многообразие подтипов гемагглютинина вируса гриппа А, наблюдаемое в природе. Разные подтипы вируса гриппа поражают свиней (HI и НЗ), лошадей (НЗ и Н7), тюленей (Н4 и Н7), норок (НЮ), чаек(НІЗ). Все подтипы, кроме Н13, циркулируют в популяции уток, одни постоянно (НЗ, Н4, Н6), другие периодически.
В человеческой популяции в настоящее время циркулируют вирусы гриппа А, гемагглютинины которых относятся к 2-м подтипам - НІ и НЗ. Другие подтипы НА (Н2 и Н4-Н15) не представлены в человеческой популяции. Иммунитет, направленный против гемагглютинина, является наиболее важным фактором в защите от инфекции. Поэтому люди не имеют иммунной защиты против вирусов подтипов Н4-НІ5, а против вируса
подтипа Н2 иммунную защиту имеют только лица старше 35 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Вирус гриппа А любого подтипа, отсутствующего в человеческой популяции, может быть источником гена НА вирусов будущих пандемий [229].
В связи с этим следует отметить, что подтипы гемагглютинина Н5 и Н9 пахо,дятся в центре внимания исследователей после осени 1997 г., когда вирус гриппа А подтипа H5N1 (штамм A/Hong Kong/156/97) вызвал в Гонконге эпизоотию у кур и ограниченную вспышку заболевания у людей с высокой летальностью (гибель каждого третьего из 18 заболевших), обусловленную передачей вируса гриппа от кур к человеку [213]. В марте 1999 г. в Гонконге от 2 детей с респираторными симптомами были выделены вирусы подтипа H9N2 [170]. Таким образом, вирусы H5N1 и H9N2 могут обладать высокой для вирусов гриппа птиц способностью заражать человека. В связи с отсутствием у людей антител к НА Н5 и Н9, вирусы этих подтипов обладают потенциалом пандемических агентов.
Для всех подтипов гемагглютинина известна аминокислотная последовательность, по в остальном разные подтипы исследованы в разной степени. В связи с актуальностью проблемы гриппа человека для медицины наиболее детально исследованы подтипы HI и НЗ, в несколько меньшей степени - Н2, а также вызывающий эпизоотии у кур и индеек Н7. В отношении распределения антигенных участков (сайтов) в трехмерной структуре молекулы гемагглютинина надежные данные до недавнего времени имелись только для подтипа НЗ. По данным рентгеноструктурного анализа для этого подтипа в 1981 г. была получена трехмерная структура молекулы НА штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) [241], с помощью которой было проведено операционное картирование антигенных сайтов на основе анализа
аминокислотной последовательности НА дрейфовых вариантов НЗ и escape-мутантов, устойчивых к моноклональньтм антителам (МКАТ) [129; 240]. В дальнейшем подробно была исследована локализация сайтов в структуре НА подтипа HI [43] и ориентировочно в структуре НАН5 [174]. В 2001г. подобное исследование было осуществлено в отношении антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н2 [218]. Поскольку во всех случаях использовали только трехмерную структуру НЗ, все полученные при этом антигенные карты, кроме карты НЗ, являются предварительными и дают лишь приближенное представление об антигенных эпитопах.
Выявленный у подтипов Н5 и Н9 потенциал инфекционное и вирулентности для человека делает весьма актуальным детальное исследование их антигенной структуры в связи с возможностью в будущем антигенного дрейфа в случае заноса Н5 или Н9 в человеческую популяцию с последующей постоянной циркуляцией. Недавно опубликованные работы, в которых на основе рентгеноструктурного анализа были построены модели трехмерной структуры НА подтипов Н5 и Н9 [90] и проведено их сравнение с трехмерной структурой НЗ [89], дают возможность адекватного антигенного картирования с использованием трехмерной структуры НА соответствующего подтипа.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было выявление тонкой антигенной структуры гемагглютинина подтипов Н5 и Ы9, наиболее актуальных в качестве компонентов возможного пандемического варианта вируса гриппа А.
Для достижения этой цели предстояло решить ряд задач:
Получить мутанты вирусов подтипов Н5 и Н9, резистентные к моноклональным антителам (escape-мутанты), и определить их перекрестную реактивность с МКАТ.
Провести секвенирование генов гемагглютинина всех escape-мутантов для определения докализации мутаций, определяющих их устойчивость к моноклональным антителам.
На основании этих данных картировать антигенные сайты в трехмерной структуре гсмагглютинина с использованием опубликованных трехмерных моделей гемагглютинина Н5 и Н9.
Провести исследование влияния аминокислотных замен escape-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5 и Н9 на их фенотипические свойства, включая вирулентность и сродство к сиалосодержащи м субстратам.
Научная новизна и практическая ценность работы
Построены антигенные карты гемагглютинина вируса гриппа А подтипов Н5 и Н9 на основании данных иммунологической характеристики 17 escape-мутантов подтипа Н5 и 20 escape-мутантов подтипа Н9 в перекрестных реакциях с моноклональным и антителами и секвенирования мутантных генов НА. Впервые продемонстрирована четкая корреляция между различиями в трехмерной структуре молекулы гемагглютинина и распределением в ней антигенных сайтов у разных подтипов.
Установлено соответствие между появлением дополнительного сайта гликозилирования в структуре НА подтипов Н5 и Н9 и изменением фелотипических свойств вируса гриппа, в том числе вирулентности.
Выявлены изменения рецепторной специфичности escape-мутантов подтипа Н5, связанные с распознаванием рецетор-связывающим сайтом
гемагглютинина вируса гриппа не только сиалил-(2,3)-галактозной связи, но и более дистальных участков рецепторнои молекулы. При этом различия сиаловых субстратов, распознаваемые гемагглютинином escape-мутантов, соответствуют различиям в составе рецепторов на хозяйских клетках.
Представленные результаты указывают на корреляцию между сниженной вирулентностью и низким сродством к сиалосодержащим субстратам у escape-мутантов подтипа Н9. Данные по аффинности НА Н9 к сиаловым субстратам демонстрируют сдвиг в рецепторнои специфичности escape-мутантов с заменой L226Q к рецепторам "птичьего" типа.
Изучение антигенной структуры НА Н5 и Н9, проведенное в настоящей работе, вносит существенный вклад в развитие представлений об соотношении антигенной специфичности и структурной вариабельности данных вирусов.
Поскольку вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н9 могут рассматриваться в качестве вероятного источника гена гемагглютинина для возможного высоковирулентного пандемического штамма, исследования вирусов этих подтипов актуальны в медицинском аспекте. Ценность полученных данных обусловлена тем вкладом, который она вносит в понимание молекулярных основ патогенного и эпидемического потенциала вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н9, как вероятных агентов будущей пандемии.
Положения, выносимые на защиту:
Существуют особенности в расположении антигенных сайтов гемагглютинина у вирусов разных подтипов, выявляемые при антигенном картировании с использованием соответствующих трехмерных структур молекул гемагглютинина.
В соответствии с различиями в трехмерной структуре распределение аминокислотных позиций в антигенных сайтах гемагглютинина вируса гриппа
разных подтипов может резко отличаться от распределения антигенно значимых позиций у других подтипов, исследованных к настоящему времени. Аминокислотные позиции, принадлежащие к одному и тому же сайту в гемагглготининах одних подтипов, могут соответствовать разным антигенным сайгам у других подтипов НА.
Совпадение позиций аминокислотных замен у ряда escape-мутантов подтипа Н5 с заменами дрейфовых вариантов подтипа Н2 указывает на вероятную роль антигенных сайтов, выявленных в диссертационной работе, при дрейфе в случае заноса вирусов подтипов Н5 или Н9 в человеческую популяцию.
Аминокислотные замены у ряда escape-мутантов подтипов Н5 и Н9 способны оказывать плейотропный эффект на их фенотипические свойства, такие как аффинность гем агглютинина к сиалосодержащим аналогам рецепторов хозяйских клеток и/или вирулентность. При этом у одних и тех же escape-мутантов может наблюдаться четкая корреляция между изменениями разных фенотипических свойств.
С помощью детального картирования антигенных сайтов гемагглютинина подтипов Н5 и Н9, впервые проведенного в диссертационной работе с использованием трехмерной структуры гемагглюти пимов соответствующих подтипов, создана основа для структурного анализа эволюционных изменений вирусов этих подтипов, являющихся вероятными агентами будущих пандемий.
Считаю своим приятным долгом выразить глубокую и искреннюю благодарность моему научному руководителю, заведующему лабораторией физиологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, член-корреспонденту РАМН, профессору Каверину Н.В. за предоставленную тему
диссертационной работы и за постоянную и всестороннюю помощь, оказанную в процессе моих исследований. Сердечно благодарю кандидата биологических наук Рудневу И.А. за ценные обсуждения, сотрудничество и неоценимую помощь в работе. Искренне благодарю кандидата биологических наук Гамбарян А.С. за помощь и ценные замечания при проведении экспериментов, связанных с определением сродства гемагглютинина к сиалосодержащим субстратам. Выражаю признательность доктору биологических наук Варич Н.Л., а также остальным сотрудникам лаборатории физиологии вирусов за дружеское отношение и поддержку в ходе научной работы.
Молекулярные основы антигенной изменчивости вируса гриппа А при эпидемическом процессе
В основе эволюции вирусов гриппа лежат разные механизмы изменения генома. Мутации, включая замены, делении и вставки, и реассортация РНК-сегментов генома являются наиболее важными факторами, обеспечивающими вариабельность вирусов гриппа. Менее ясна роль других механизмов, таких, как образование дефектных частиц [211] и истинная (межмолекулярная) рекомбинация. Несмотря на то, что у негативно- нитевых вирусов межмолекулярные взаимодействия являются достаточно редким событием, недавние исследования продемонстрировали пример включения в ген гемагглютинина последовательностей клеточной мРНК, что привело к появлению вирулентности [120]. Не исключено, что такие явления также могут быть фактором быстрых эволюционных изменений.
В XX веке произошли 3 пандемии, вызванные вирусом гриппа человека (в 1918, 1957 и 1968 гг.), и 1 глобальная эпидемия, близкая к пандемии (в 1977 г.) [12]. Ряд генетических и серологических данных свидетельствует в пользу представления о том, что пандемии гриппа человека могут быть результатом реассортации генов между вирусами человека и птиц [114; 199]. Поскольку РНК вируса гриппа сегментирована, генетическая реассортация может происходить при смешанной инфекции различными штаммами [230]. Это означает, что когда 2 вируса инфицируют одни и те же клетки, вирусное потомство может унаследовать наборы геномных РНК-сегментов, представляющие собой комбинации РНК-сегментов обоих родительских вирусов. Теоретически возможное число таких комбинаций, которые могут сформировать полный РНК-геном при смешанной инфекции, составляет 256. Однако лишь немногие вирусы-реассортанты обладают правильным сочетанием генов, необходимым для эффективной репродукции в природных условиях [230; 234]. Такое "удачное" сочетание генов наблюдалось для пандемических вирусов, впервые появившихся в Юго-ВосточноЙ Азии и ответственных за "азиатский грипп" 1957 года и "гонконгский грипп" 1968 года [38; 176]. По антигенной специфичности НА или НА и NA они отличались от вирусов гриппа А, циркулировавших у людей до пандемии. Вирус 1957 г. подтипа H2N2 получил гены НА, NA и РВ1 от вируса гриппа птиц, а остальные 5 генов - от предшествующего человеческого штамма H1N1 [114; 199]. Гонконгский вариант подтипа H3N2 1968 г. содержал гены НА и РВ1, полученные от "птичьего" донора, а ген NA с другими пятьто генами - от циркулировавшего до 1968 г. штамма H2N2 [62; 114]. Филогенетические исследования показали, что "птичьи" вирусные гены этих пандемических штаммов произошли от вируса гриппа птиц евразийской линии [234]. Несмотря на то, что пандемии 1957 и 1968 гг. привели к большой общей смертности, вызвавшие их вирусы не обладали необычно высокой вирулентностью, и в этом отношении они не были похожи на штамм 1918 г. подтипа H1N1.
Дополнительная информация, существенная для развития представлений о механизме возникновения пандемических вариантов вируса гриппа А, была получена в результате анализа генома вируса "испанского гриппа" или "испанки", вызвавшего пандемию в 1918г. Изоляты вируса не могли быть исследованы в то время, поскольку вирусы гриппа человека были впервые выделены значительно позднее. Тем не менее, недавно удалось получить и охарактеризовать генетический материал этого агента, применив амплификацию генных сегментов посредством полимеразной цепной реакции. В качестве исходного материала были использованы замороженные в вечной мерзлоте или фиксированные формалином и заключенные в парафин ткани людей, погибших от пневмонии 1918 г. [183]. Гены НА, NA и "NS были секвенированы, и первичная структура генных сегментов и кодируемых ими белков была сопоставлена с соответствующими генами других вирусов гриппа А. Данные секвенирования выявили прежде всего близость генов и белков вируса 1918 г. к генам и белкам вируса гриппа свиней A/Swine/Iowa/30 (H1N1) [80; 234]. Этот результат был ожидаемым, поскольку близость "классического" вируса гриппа свиней к пандемическому вирусу 1918 г., имеющему в своем составе НА подтипа HI и NA подтипа N1, уже была известна по серологическим данным. В филогенетическом дереве гены НА и NS находятся в ветви вирусов млекопитающих, группируясь либо с вирусами гриппа человека (например, гены НА и NS1), либо с вирусами гриппа свиней (ген NS2) [28]. При этом, однако, они расположены в филогенетическом дереве очень близко от точки расхождения вирусов гриппа птиц и млекопитающих и имеют некоторые ярко выраженные черты генов вируса гриппа птиц. Ген NA по нуклеотидной последовательности попадает в ветвь вирусов млекопитающих, а по аминокислотной последовательности белка - в "птичью" ветвь филогенетического дерева [63]. Эти данные трактуются [28] как указание на занос вируса,, или, по меньшей мере, генов НА, NA, NS и М в человеческую популяцию от птиц непосредственно перед пандемией. Однако для строгого доказательства отсутствия роли свиней как промежуточного хозяина необходима информация о нуклеотидных последовательностях вирусов гриппа свиней, циркулировавших до 1918 года.
Особенности белков, кодируемых генами вируса 1918 г., пока не позволяют установить причину его высокой вирулентности для людей [183]. В гене НА не обнаруживается цепочки основных аминокислот в сайте нарезания, присутствующей в НА высоковирулентных вирусов гриппа птиц [125], У белка NA отсутствуют структурные особенности, ведущие к повышенному связыванию плазминогена, обеспечивающему высокую вирулентность некоторых вариантов вируса подтипа H1N1 для мышей [81], а у белка NS1 -особенности, ведущие к повышенной резистентности к цитокинам [183]. Интересно, что раздельный филогенетический анализ участков гена НА вируса 1918 г. [75] выявил наибольшее сходство с вирусами гриппа свиней у субъединицы НА2 и у стволовой части НА1, тогда как участок, кодирующих глобулярную часть НА1, был ближе к вирусам гриппа человека. Не исключено, что перед пандемией имела место внутригенная истинная рекомбинация в гене НА, важная для приобретения вирусом свойств пандемического агента [75].
Агент эпидемии "русского гриппа" в 1977 г. был в основном идентичен вирусам подтипа H1N1, циркулировавшим среди людей в 1950 г. [161]. В высшей степени сомнительно, что этот вирус сохранялся в природе более 20 лет без каких-либо изменений. Поэтому логично сделать заключение о том, что вирус был сохранен в замороженном виде до момента внедрения каким-то образом в человеческую популяцию.
Влияние структурных изменений гемагглютинина вируса гриппа А на его функциональные свойства
Инфекция, вызванная вирусом гриппа, начинается со связывания вирусных частиц с поверхностными рецепторами клетки хозяина и последующей интернализации вирусной частицы. Известно, что необходимым условием связывания вируса гриппа с клеткой является присутствие в клеточном рецепторе сиаловой кислоты [169; 235], Некоторые вирусные штаммы преимущественно связывают концевые сиаловые кислоты, прикрепленные к олигосахариду клеточного рецептора а-(2,6)-гликозидной связью, тогда как другие штаммы связывают а-(2,3)-сиалилолигосахариды клеточных рецепторов [190; 216]. Высокое сродство к субстрату, содержащему а-(2,3)-гликозидную связь, проявляют вирусы гриппа птиц, в то время как вирусы гриппа человека, не прошедшие большого количества пассажей на куриных эмбрионах, взаимодействуют с субстратом, содержащим а-(2,6)-гликозидную связь [70]. Изучение возможности репродукции вируса гриппа A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) на клетках MDCK, обработанных нейраминидазой и сиалил-трансферазами, образующими 01-(2,3)- или а-(2,6)-связи, показало, что вирус избирательно репродуцируется в тех клетках, к рецепторам которых он имеет специфическое сродство [189]. Это обстоятельство предполагает, что хозяйские виды рецепторов могут играть роль селективного пресса, разрешая преобладающее размножение в данном хозяине тех вирусов гриппа, которые содержат в рецептор-связывающем кармане НА последовательность аминокислот необходимую для связывания с данным рецептором [4]. При пассировании вирусов гриппа человека на куриных эмбрионах может происходить изменение рецепторной специфичности гемагглютинина, вследствие чего данные вирусы могут приобретать способность связываться с а-(2,3)-содержащим субстратом [70; 147]. Как показывает сравнение аминокислотных последовательностей гемагглютинина, вирусы гриппа птиц имеют консервативные аминокислоты на границах рецептор-связывающего кармана (138, 190, 194, 225, 226, 228) [150].
Этот факт согласуется с представлениями о том, что вирусы гриппа птиц хорошо адаптированы к своему природному хозяину и близки к состоянию эволюционного равновесия [230]. Сайт связывания с клеточным рецептором у НА вирусов гриппа птиц, по-видимому, сформировался до расхождения индивидуальных вирусных подтипов и мало изменяется в процессе эволюции. В отличие от вирусов гриппа птиц, вирусы гриппа человека проявляют генотипические и фенотипические различия в тех же самых участках рецептор-связывающего кармана молекулы НА. Так, гемагглготииины подтипов HI и НЗ вирусов гриппа человека отличаются друг от друга по перечисленным выше шести аминокислотным позициям, консервативным для вирусов гриппа птиц. Так как гемагглютинины вирусов гриппа человека происходят от гемагтлютининов вирусов гриппа птиц в результате межвидовой передачи гена от вирусов гриппа птиц вирусам гриппа человека [230], то, очевидно, что в каждом отдельном случае имеет место независимое изменение специфичности рецептор-связывающего кармана, связанное с утратой распознавания а-(2,3)-содержащих детерминант ("птичий" фенотип) и возникновением распознавания а-(2,6)-содержащих детерминант ("человеческий" фенотип) [150]. Такая особенность вирусов гриппа человека, то есть потеря связывания с а-(2,3)-содержащими субстратами, коррелирует с более интенсивным гликозилированием глобуляриой головки гем агглютинин а [150].
Рецепторная специфичность гемагглютинина прямо зависит от наличия определенных аминокислот в позициях 226, 227 и 228 [153; 190]. Вирусы гриппа А человека подтипов НЗ и НІ имеют Leu в позиции 226, Ser в позиции 228 и преимущественно связывают олигосахаридьт с а-(2,6)-гликозидной связью, а вирусы гриппа птиц - Gln226 и Gly228, связывая олигосахариды с (ь(2,3)-гликозидиой связью [51; 68]. Остаток серина в положении 227 (Ser) характерен для НА вирусов уток всех подтипов, а также для вирусов человека и свиней подтипа НЗ. Для некоторых вирусов млекопитающих в этой позиции определяется аланин (Ala) или глицин (Gly). Замена Leu226-Ser227-Gly228 у НА подтипа НЗ вирусов человека ыа Gln226-Ser227-Gly228 разрешает их репликацию в утках, тогда как при замене Gln226-Ser227-Ser228 этого не происходит [159]. После того как была определена трехмерная структура комплекса гемагглютинина с пентасахаридами, содержащими а-(2,3)- или а-(2,6)-гликозидные связи, стало понятно, что а-(2,3)-сиалилолигосахарид образует более обширный контакт с Gin в позиции 226 молекулы НА, компенсируя потерю контакта аминокислоты с водой и формируя, таким образом, более стабильную структуру [52].
Разница в способах связывания а-(2,3)- и а-(2,6)-с.иалилолигосахаридов с гемагглютининами вирусов гриппа создает структурную основу рецепторной специфичности, наблюдаемой среди различных вирусных штаммов [60]. Вирусы гриппа птиц, как правило, не размножаются в организме человека [230], а вирусы гриппа человека в организме птиц [96]. Замены в позициях 226 и 228 связаны с ограничением выбора хозяина вирусами гриппа. Так, реассортанты с геном гемагглютинина от человеческого вируса A/Udorn/307/72 (H3N2) и остальными генами от птичьего вируса A/Mallard/New York/6750/78 (H2N2) теряют способность размножаться в кишечном тракте уток [96]. Замены же Leu226Gln и Ser228Gly в гемагглютинине восстанавливают эту способность [225].
Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей
Файлы с фрагментами нуклеотидной последовательности, каждый из которых соответствовал определенному праймеру, обрабатывались программным продуктом Lasergene sequence analysis (DNASTAR), который содержит отдельные программы для выравнивания и анализа фрагментов нуклеотидной последовательности ("MegAlign"), а также сборки полной нуклеотидной последовательности гена из фрагментов ("SeqMan"). Для получения аминокислотных последовательностей собранные нуклеотидные последовательности транслировали, используя соответствующую программу "EditSeq" из данного пакета. Для получения escape-мутантов подтипа Н5 использовали адаптированный к мышам вирус гриппа A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) (далее адаптированный к мышам вирус A/Mallard/ Pennsylvania/10218/84 обозначен везде как A/Mld/PA-MA). Вирус прошел 3-х кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений с целью получения однородной вирусной популяции. Использованные в работе моноклональные антитела ср46, ср55 и ср58 против штамма A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), 24В9 против штамма A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) и 176/26 против штамма A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2) нейтрализовали вирус A/Mld/PA-MA в титрах с 1:12800 до 1:102400. При получении escape-мутантов применяли трехступенчатую схему, на каждом из этапов которой проводили 4-х кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений (гл. 2., сх. 10). Полученные escape-мутанты были обозначены теми номерами моноклональных антител, к которым они устойчивы.
На I этапе из вируса дикого типа было селекционировано 8 escape-мутантов. Из 4 мутантов I поколения - (пт46(7), т55(2), ш58(1) и т24В9) - были селекционированы 6 мутантов ТТ поколения. Два мутанта II поколения - т46(7)-55 и т58(1)-24В9 - были использованы для получения 3 мутантов III поколения. Далее все escape-мутанты I поколения названы одиночными, escape-мутанты II поколения - двойными, escape-мутанты III поколения - тройными, независимо от количества мутаций в каждом из них. Последовательность получения мутантов суммирована в таблице 1. Вес escape-мутанты подтипа Н5 были охарактеризованы в прямой и перекрестной реакциях РТГА и ТФИФА с панелью МКАТ. Данные приведены в таблицах 2, 3 и 4. По данным перекрестных иммунологических реакций используемые моноклональные антитела разбиваются на 4 группы по распознаваемым ими антигенным эпигонам, три из которых частично перекрываются, т.е. соответствуют трем субэпитопам одного эпитопа, а МКАТ 24В9 соответствует 2-му неперекрывающемуся эпитопу (группа II, табл. 4).
В свою очередь, полученные escape-мутанты также разделяются на 4 группы в соответствии с антигенными эпитопами: к первой группе принадлежат escape-мутанты, устойчивые к антителам ср58 и 176/26; ко второй группе принадлежат escape-мутанты, устойчивые к антителу ср46, к третьей группе -устойчивые к антителу ср55, 364/1 и к четвертой группе - устойчивые к антителу 24В9 (табл. 4). По данным перекрестной реакции РТГА одиночные escape-мутанты, селекционированные МКАТ ср55 и ср46, не реагируют только с тем МКАТ, которое было использовано для их получения. Escape-мутанты, отобранные селекцией антителами ср58 и 176/26, перестают связываться не только с МКАТ ср58, но и с МКАТ других групп (ср46, ср55, 24В9 и 364/1, похожим на ср55) (табл. 2). Это подтверждает тот факт, что эпитопы к МКАТ ср58 (и 176/26), к ср55 (и 364/1) и к ср46 частично перекрываются. В таблице 4 указанные эпитопы обозначены Та, lab и lac, соответственно. В РТГА с антителом 77В1 был получен парадоксальный результат. Его титр с esc аре-мутантами, отобранными ср58, выше, чем в реакции с диким типом. Это может объясняться тем, что данная escape-мутация приближает антигенную специфичность вируса к антигенной специфичности штамма A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9), имеющего в положении 131 сайт гликозилирования [174], против которого было получено МКАТ 77В1. Если учесть тот факт, что escape-мутанты, отобранные антителом ср55, не реагрируют с 77В1, то, по-видимому, данное МКАТ можно отнести к группе lab (табл.4).
В работе PhilpottM. и др. [174] оно было отнесено к соответствующему сайту В в структуре НА подтипа НЗ. Иммунологическая характеристика МКАТ в перекрестных реакциях с escape-мутантами подтипа Н5, помимо группировки МКАТ по эпитопам и субэпитопам, позволяет выявить различия иного характера. Данные ТФИФА в целом подтверждают результаты, полученные в перекрестной реакции РТГА, но при их сопоставлении выявляются некоторые существенные расхождения. В то время как МКАТ ср46, ср58, 24В 9 и 77В1 ведут себя сходным образом в обеих реакциях с одиночными, двойными и тройными escape-мутантами, МКАТ 176/26 и в меньшей степени МКАТ ср55 и 364/1 реагируют в РТГА и ТФИФА по-разгюму. МКАТ 176/26 сохраняет связывание со всеми escape-мутантами, полученными к антителам 176/26 и ср58, за исключением тройного мутанта т46(7)-55-176/26 (табл. 2, 3), тогда как МКАТ ср58, реагирующее с тем же эпитопом, что и МКАТ 176/26, утрачивает способность к связыванию с указанными мутантами. В отличие от остальных escape-мутантов, полученных к антителу 176/26, тройной escape-мутант т46(7)-55-176/26 не реагирует в ТФИФА с данным МКАТ (табл. 3) и не имеет остаточного титра в РТГА. МКАТ ср55 и похожее на него антитело 364/1, не использованное для получения escape-мутантов, также сохраняют способность связываться в ТФИФА с отобранными ср55 мутантами, хотя и в меньшей степени, чем МКАТ 176/26 с мутантами, селекционированными 176/26 и ср58 (табл. 3). При этом escape-мутанты, сохранившие способность к связыванию МКАТ ср55 и 176/26, являются полностью устойчивыми к нейтрализующему действию соответствующих МКАТ в реакции нейтрализации инфекционности (табл. 5), хотя МКАТ 176/26 реагирует в РТГА в небольшом титре с мутантом т58(1)-24В9 (табл. 2). Остальные двойные и тройные escape-мутанты одинаково реагируют в РТГА и ТФИФА с соответствующими двумя или тремя моноклональными антителами.
Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9
Для антигенного картирования гемагглютинина подтипа Н9 выбран тог же штамм вируса гриппа, который использовался для получения структуры НА Н9 методом рентгеноструктурного анализа [90].
Вирус гриппа A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) (далее вирус A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) обозначен везде как A/Sw/HK) был адаптирован к репродукции в легких мышей, поскольку целью данной диссертационной работы было не только выявление тонкой антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9, но также изучение фенотипических свойств антигенных вариантов, таких как вирулентность и сродство гемагглютинина к сиалосодержащим субстратам. Известно, что в процессе адаптации в молекуле НА обычно накапливается незначительное количество аминокислотных замен [76; 210], поэтому для картирования антигенных сайтов использовали трехмерную структуру НА Н9 исходного неадаптированного вируса, опубликованную в работе На Y. и др. [90].
Изначально штамм A/Sw/HK (H9N2) вызывал гибель мышей только при высокой дозе заражения (1 х 10б,5ЭИД5о и более). Адаптацию данного вируса проводили в двух параллелях по 10 пассажей на мышах с последующим 3-х кратным клонированием вируса в куриных эмбрионах методом предельных разведений для получения однородной вирусной популяции. Данные по вирулентности исходного и двух пассированных на мышах вирусов (A/Sw/HK-MA и A/Sw/HK-MP) продемонстрировали, что в процессе адаптации вирус A/Sw/HK-MA приобрел вирулентность для мышей, в то время как вариант A/Sw/HK-MP сохранил низкую вирулентность, лишь немного превышающую вирулентность исходного вируса (табл. 7). Данные РТГА с панелью МКАТ показали, что антигенная специфичность вируса A/Sw/HK-MA не изменилась по отношению к исходному неадаптированному штамму. Второй, пассированный на мышах вариант A/Sw/HK-MP, хотя и не приобрел повышенной вирулентности для мышей, утратил способность реагировать с некоторыми МКАТ в РТГА (табл. 8). В этом отношении он оказался сходным с группой escape-мутантов (см. ниже), что было подтверждено данными по секвенированию генов НА (табл. 13). Для дальнейших опытов по получению и характеристике escape-мутантов подтипа Н9 был использован адаптированный к мышам вирус A/Sw/HK-MA. В ходе работы были получены одиночные и двойные escape-мутанты адаптированного к мышам вируса A/Sw/HK-MA (H9N2), устойчивые к моноклональньтм антителам G9-27, Gl-29, 7В10, 8С4, 15F1, 18G4, 3D11, 19АЮ, 18В10и 18В1.
Для получения escape-мутантов был использован адаптированный к мышам вирус гриппа A/Sw/HK-MA, прошедший 3-х кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений с целью получения однородной вирусной популяции. Использованные в работе моноклональные антитела G1-29 против штамма A/Quial/Hong Kong/Gl/97 (H9N2), G9-27 против штамма A/Chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2) и 7В10, 8С4, 15F1, 18G4, 3D11, 19А10, 18В10, 18В1 против штамма A/Duck/Hong Kong/Y280/97 (H9N2) нейтрализовали вирус A/Sw/HK-MA в титрах с 1:3200 до 1:204800.
При получении escape-мутантов применяли двухступенчатую схему, на каждом из этапов которой проводили 4-х кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений (гл. 3., сх. 10). Полученные escape-мутанты были обозначены теми номерами моноклональных антител, к которым они устойчивы. На I этапе из вируса дикого типа было селекционировано 10 escape-мутантов. Из 5 мутантов I поколения - (mGl-29, m7B10, ml5Fl, ml8G4 и m3Dll) - были селекционированы 10 мутантов її поколения. Далее, также как в главе 3.1, все escape-мутанты 1 поколения названы одиночными, escape-мутанты II поколения - двойными, независимо от количества мутаций в каждом из них. Последовательность получения мутантов суммирована в таблице 9.
