Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп - одна из значимых причин заболеваемости и смертности у людей. Несмотря на наличие разнообразных противогриппозных вакцин, проблема предотвращения ежегодных эпидемий и пандемий гриппа остается нерешенной.
Эффективность вакцинации во многом определяется формированием полноценного иммунного ответа, обеспечивающего защиту от широкого спектра дрейф-вариантов вируса. Живые гриппозные вакцины (ЖГВ), вводимые интраназально, обладают более высокой профилактической эффективностью по сравнению с инактивированными вакцинами, так как наряду с выработкой сывороточных антител, обеспечивают формирование специфического клеточно-опосредованного ответа и стимуляцию продукции перекрестно-реагирующих секреторных иммуноглобулинов A (Gustin К.М. et al., 2011; Belshe R.B. et al., 2007). Однако используемые в настоящее время ЖГВ имеют ограничения в применении, связанные со способностью вакцинных штаммов к репликации в клетках носового эпителия (Mallory R.M., 2011).
Новым направлением в создании живых противогриппозных вакцин является разработка вакцинных препаратов на основе дефектных по репликации штаммов вируса гриппа с удаленной генетической последовательностью, кодирующей NS1 белок (ANSI). Многофункциональный NS1 белок - основной антагонист системы интерферонов I и III типов (ИФН-а/р,Х) - подавляет синтез мРНК клетки хозяина, блокирует активацию факторов транскрипции цитокинов, противодействует апоптозу зараженных клеток хозяина, способствуя полноценной вирусной репликации в ходе гриппозной инфекции (Hale B.G. et al, 2008).
Удаление гена NS1 приводит к неспособности вируса реплицироваться в ИФН-компетентных клетках и организмах (Egorov A. et al.,1998). В то же время, несмотря на отсутствие репликации, вакцинные ANS1 штаммы вирусов гриппа достаточно иммуногенны и не требуют дополнительного использования адъювантов для достижения протективного иммунного ответа. ANSI вирусы гриппа активно распознаются рецепторами системы врожденного иммунитета (TLR, RLR, NLR) и вызывают повышенную продукцию цитокинов в месте аппликации вакцины («самоадъювантный эффект»). Кроме того, вирусы с удаленным NS1 геном, стимулируя продукцию биологически активного ИЛ-1 через активацию каспазы 1, могут способствовать образованию перекрестно-реагирующих иммуноглобулинов класса A (Stasakova J. et al. 2005; Ichinohe Т., et al. 2009).
Данные, полученные в ходе доклинических исследований, показали, что при интраназальном введении ANSI вирусы гриппа А подтипа H1N1 вызывают локальную выработку широкого спектра провоспалительных цитокинов, хемокинов и интерферонов I типа и приводят к развитию выраженного гуморального и клеточного иммунного ответа (Ferko В. et. al., 2004). Безопасность и высокая иммуногенная активность дефектной по репликации вакцины на основе ANSI штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99
(H1N1) были продемонстрированы при проведении первой фазы клинических исследований (Wacheck V. et al., 2010).
Настоящая работа направлена на получение экспериментальных и клинических данных, подтверждающих цитокиногенное действие и высокий иммуногенный потенциал ANS1 вакцин на основе штаммов вирусов гриппа А и В. Проведена оценка иммуноадъювантных свойств ANSI штаммов вируса гриппа А при их сочетанном использовании с рекомбинантными белками стрептококков группы В.
Цель исследования состояла в изучении иммуногенных и иммуноадъювантных свойств штаммов вирусов гриппа А и В с удаленным NS1 геном. Задачи исследования
-
Охарактеризовать способность штаммов вирусов гриппа A (H5N1) и В с удаленным и интактным геном NS1 стимулировать продукцию цитокинов in vitro (в первичных культурах клеток носового эпителия и макрофагов человека).
-
Охарактеризовать репликативную активность и локальный цитокиновый ответ на вакцинацию штаммом вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном на модели макак-резус.
-
Оценить способность иммуннокомпетентных клеток (мононуклеаров периферической крови) людей различных возрастных групп вырабатывать провоспалительные цитокины в ответ на стимуляцию вирусом гриппа АУВьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном.
-
Изучить иммунный ответ у здоровых добровольцев в возрасте 18-50 лет после двукратной интраназальной иммунизации кандидатом в вакцинные штаммы ANS1-H5N1 (А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном).
-
Изучить иммуноадъювантные свойства вирусов гриппа А с удаленным NS1 геном при сочетанной интраназальной вакцинации с рекомбинантными белками стрептококков группы В на модели мышей.
Научная новизна работы. Впервые дана оценка влияния удаления NS1 гена на
способность штаммов вирусов гриппа А подтипа H5N1 и вирусов гриппа В
вызывать продукцию провоспалительных цитокинов иммунокомпетентыми
клетками и клетками носового эпителия человека. Охарактеризован местный
ответ цитокинов на вакцинацию препаратом на основе штамма
А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) на модели резус макак. Впервые проведен анализ
способности мутантных вирусов гриппа с удаленным NS1 геном на примере
штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) индуцировать выработку
провоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками
новорожденных и пожилых людей. В рамках клинического исследования фазы I вакцинного препарата на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) с удаленным NS1 геном, показано, что данный препарат индуцировал формирование противовирусного ответа, за счет активации факторов, как врожденного, так и адаптивного иммунитета при интраназальной вакцинации без применения адъювантов. Показана возможность применения штаммов вирусов гриппа с удаленным NS1 геном в качестве иммуноадъюванта при
интраназальной вакцинации рекомбинантными белками стрептококков группы В (СГВ).
Практическая значимость работы. Дана характеристика влияния делеций С-терминального домена NS1 гена вируса гриппа В на способность вируса ингибировать выработку провоспалительных цитокинов. Показана возможность комбинированной интраназальной вакцинации рекомбинантными белками стрептококков группы В (СГВ) и штаммами вирусов гриппа с удаленным NS1 геном для профилактики гриппа и заболеваний, вызываемых СГВ. Результаты, полученные в ходе проведенных доклинических исследований, использованы для проведения клинического исследования I фазы вакцинного препарата VN1203ANS1 на основе штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Рекомбинантные штаммы вируса гриппа A(H5N1) с удаленным NS1 геном и вирусы гриппа В с различным уровнем делеций С-терминального домена белка NS1 не способны к репликации, но стимулируют выработку широкого спектра провоспалительных цитокинов в ИФН-компетентных системах in vitro, что подтверждает аттенуированный фенотип таких штаммов и определяет их «самоадъювантные» свойства.
-
Реализация «самоадъювантных» свойств вирусов гриппа с удаленным NS1 геном осуществляется за счет неспособности таких вирусов ингибировать локальную выработку провоспалительных цитокинов в месте аппликации. В ответ на однократное интраназальное введение макакам-резус вакцинного штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/04 (H5N1) ANSI наблюдалось достоверное повышение уровней ИЛ-ір, ИФН-у, ФНО-а и ГМКСФ в носовых смывах животных.
-
Продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови (МПК), индуцированная вирусом гриппа с удаленным NS1 геном, имеет возрастные различия. МПК, выделенные из пуповинной крови, в ответ на стимуляцию ANS1 вирусом вырабатывали ИФН-а и другие провоспалительные цитокины на уровне с МПК взрослых здоровых доноров, в то время как продукция цитокинов клетками пожилых людей была снижена.
-
При интраназальном введении здоровым взрослым добровольцам пандемическая вакцина ANS1-H5N1 способствует формированию, как местного, так и системного (гуморального и клеточно-опосредованного) иммунного ответа без применения адъювантов. Наибольший уровень иммунологической эффективности достигался при двукратном введении вакцины.
-
Вирусы гриппа с удаленным NS1 геном обладали иммуноадъювантными свойствами и способствовали развитию более выраженного и продолжительного иммунного ответа к белкам стрептококка группы В при сочетанной интраназальной иммунизации у мышей.
Личный вклад автора состоит в активном участии в планировании и самостоятельном проведении лабораторных исследований, статистической обработки и анализе полученных результатов. Клиническое исследование I
фазы проведено на базе ФГБУ «НИИ Гриппа» Минздравсоцразвития России совместно с AVIR Green Hills Biotechnology (Вена, Австрия) на основании Разрешения на проведение клинических исследований № 546 от 19 ноября 2008 г. Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Ряд исследований выполнен при участии сотрудников ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России и сотрудников лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Исследование на приматах проведено на базе Biotest Ltd (Чехия).
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на Ежегодной отчетной конференции по международному европейскому проекту «Fluvacc» (Вена, 2008 г.), на Международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009 г), на VI Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 24 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 245 источников на русском и английском языках.
