Введение к работе
- .Актуальность проблема. Современный этап исследований в области сероэпидемиологиа гриппа характеризуется расширением сферы применения диагностических препаратов, включая изучение роли вирусов гриппа в структуре ОРЗ, определение уровня коллективного гуморального иммунитета к современным и реликтовым вирусам гриппа, оценку иммуногенности новых гриппозных вакцин и вакцинных ттзшов. Исследованиями последних лет доказано, что результаты серодиагностики гриппа в РТГА в значительной мера зависят от ряда биологических свойств избранного диагностического штамма. Поэтому всесторонний анализ современных -антигенно актуачьяых и реликтовых вирусов, выделенных от больных гриппом, имеет ваяюе научно-практическое значение применительно к первичному скринингу и последующей специальной подготовке диагностических штаммов. До настоящего времени для отих целей практически не использовались современные методы ?лолекулярной. биологии, позволяющие, например, анализировать полипептидннй состав вирусов. Установлено, что анализ отличий d скорости миграции полипептвдов и фрагментов РНК вирусов гриппа методом электрофореза (ЭФ) в полиакрилам"дном геле (ПААГ) даёт ценную информацию в исследованиях по генетике вирусов, а сам метод ЭФ является чувствительным тестом при скрининге ВВДелеННЫХ ВИРУСОВ И анализе реКОМбИНаЯТОВ ( HugentobLer, І98І; oxlord . Schlld , 1979; Oxford, 1985).
Известно, что диагностические штаммы должны отвечать оп-редалёшшм требованиям, предъявляемым в первую очередь к таким биологически свойствам как пшрота антигенного спектра (ШАС) и оепдность к антителам человеческих сывороток. Учитывая, что эти признаки, так же как и свойство резистентности к иеспеци-фэтёским ингибиторам сивороток, связаны скорее всего с особенностями структуры поверхностных гликопротеидов вируса, сопоставление указанных биологических свойств с электрофоретичес-кой подвітагостью полипептвдов в геле представляет теоретический и практический интерес. Кроме этого, метод ЭФ в ПААГ, необходимый а обязательный при этиологическом надзоре за гриппом, может предоставить дополнительную информацию по сравнительной характерпстнке антигенно актуальных вирусов и отобранных из их числа кандидатов в диагностические штаммы.
Весьма актуален и вопрос влияния системы хозяина на биологические свойства вирусов гриппа и их структурные особенное-
ти в связи с принципиальной возможностью использования клеточ-. них культур для производства гриппозных диагностикудав. При втом, важным свойством, определяющим рентабельность производства как вакцинных, так и диагностических штаммов, является высокая репродукционная активность вирусов в избранной система накопления. Такая активность может быть достигнута за счёт использования метода генетической рекомбинации или специальных приёмов выделения из популяции высокорепродуктивных клонов (Корчанова и др., 1982). Исследования по генетической детерминации этого признака ( Раїеье е.а. 1976; Ghendoa е.a. . 1979; Palese,Youn5 , 1982; Baez е.a., 1980; Фураева В.А., 1983) не дали однозначного ответа на поставленный вопрос. Сложность проблемы выяснения взаимосвязи биологических свойств со структурой вируса, обусловленная полигенным характером большинства "жизненно" важных для вируса гриппа признаков (веап, Webster , 1978; Oxford е.а. < 1978; Rott е.а. » 1978; Scholtissek е.a. t 1979; Florent , 1980; sug'aura, Ueda . 1980), требует изыскания новых подходов к решению этих задач. Важное значение при этом приобретает анализ экспрессии различных вирусных генов в инфицированных клетках и зависимости от неё уровня репродукционной активности вируса. Для этих целей может быть применён метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГЖ) с мечеными ДНК-зондами, содержащими различные вирусные гены.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение некоторых биологических параметров и ыолекулярно-биологи-ческих свойств ряда штаммов вирусов гриппа А и В при отборе и получении диагностических штаммов, а также при культивировании вирусов в различных системах хозяина, для чего предполагалось решить следующие основные задачи:
-
Сопоставить полипептидный состав и биологические свойства вирусов гриппа при первичном скрининге и отборо кандидатов в диагностические штаммы.
-
Изучить электрофоретическую подвижность полипептидов субпопуляпдй вирусов гриппа, полученных в лабораторных условиях и отличающихся по чувствительности к неспецифическиы сывороточным ингибиторам.
-
Оценить влияние системы хозяина на структуру и антигенные особенности вирусов гриппа А.
-
Изучить экспрессии генов, особенности структуры и антп-
генных свойств высокорепродуктивных субпопуляцнй вирусов гриппа, полученных разделеішем исходной популяции по скоростям репродукции.
Научная новизна. - I. Впервые выявлены корреляции между электрофоретической подвижностью тяжёлой цепи гемагглютиншіа (НАІ) вирусов гриппа В и такими биологическими свойствами как широта антигенного спектра и азидность к антителам.
-
Впервые показано, что ингибиторорезистентныв (ИР) варианты вирусов гриппа А, полученные в лабораторных условиях, могут отличаться по подвижности полипептида НАІ от исходного вируса, причём выраженность этих отличий, определяемых методом ЭФ в ПААГ, зависит от системы хозяина.
-
С помощью метода МГНК впервые изучена кинетика экспрессии отдельных генов у вариантов вируса гриппа А(НЗц 2), различающихся по уровню репродукционной активности в клеточных культурах.
Практическая значимость "работы. Приготовлечы новые диагностические штаммы А/Ленинград/289/83 и А/Киев/3304/84, которые отконтролированы в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и рекомендованы Комиссией по вакцинным штаммам Минздрава СССР для внедрения в производство.
Штамм А/Ленинград/289/83 внедрён в производство диагностических препаратов в Лен.НИИВС и на Одесском предприятии'по производству бакпрєпаратов с 1986 г. Диагностикумы из указанного штамма широко применяются в практике работы вирусологических лабораторий на Союзном уровне (более чем в 60 городах страны). Использование вируса А/Ленинград/289/83 по сравнению с вирусом А/Бангкок/1/79 (рекомендованным ВОЗ для целей диагностики) позволило повысить частоту диагностирования гриппа в среднем на 6%. Широкий антигенный спектр вируса А/Ленинград/289/83 позволил с успехом использовать его для диагностики гриппа в течение трёх последовательных эпидемий (1983, 1985 и 1987 гг.), а также применять для оценки пммуногенности живых и инактивиро-ванннх гриппозных вакцин.
Штамм А/Киев/3304/84 (H0NI) используется в производстве диагностикумов в отделе диагностических препаратов ВНИИ гриппа Минздрава СССР в течение последних 4-х лет и с 1990 г. - на Одесском предприятии по производству бакпрєпаратов. Диагноста-
кум из указанного штамма характеризуется высокой активностью и специфичностью, что позволяет контролировать коллективный иммунитет и следить, таким образом, за уровнем циркуляции вирусов указанной антигенной структуры в различных возрастных группах населения. Диагностикумы внедрены в практику работы вирусологических лабораторий - опорных баз Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ.
Разработанные диагностические штаммы защищены авторскими свидетельствами на изобретение (AC № 1277607 и AC JS 1463758) и экспонировались на международной выставке Восток-Запад-89 (г.Турку, Финляндия).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
На основании сравнения вирусов гриппа В одного периода циркуляции показано, что способность антигенно родственных штаммов реагировать со специфическими антителами зависит от структурных особенностей, полипептида НАІ. Установлены прямые корреляции между молекулярной массой тяжёлой цепи гемагглюти-нина и способностью штаммов к взаимодействию с антителами к дрейф-вариантам соответствующего периода циркуляции как в сыворотках людей, так и иммунизированных лабораторных животных.
-
Формирование in Yitro ингибиторорезистентннх, а также хозяин-зависимых вариантов вирусов гриппа А(НЗії 2) может приводить к изменению скорости миграции полипептида НАІ при электрофорезе в полиакриламидном геле.
-
Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот показано, что одним из механизмов становления высокорепродуктивных для клеточных культур вариантов вируса гриппа А(НЗК 2) может быть формирование субпопуляцпй, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии НА, NA, NP, М, РА п ks генов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых учёных во ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1979, 1989 гг.), в Институте микробиологии и эпидемиологии им.И.И. Мечникова г.Одессы (1979 г.), в Институте микробиологии им. А.Кирхенштейна АН Латв.ССР г.Риги (1980 г.), а также на заседании вирусологической секции Общества микробиологов п эпидемиологов (1989 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, получено 2 авторских свидетельства.
- Объём и структура работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов. Текст пллгострирован22 таблицами, 25 рисунками. Список литературы содержит 242 названия работ отечественных и зарубежных авторов.
