Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 9
2.1. Энтерит норок (историческая справка) 9
2.2. Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок 9
2.3. Культуральные свойства вируса энтерита норок 19
2.4. Некоторые аспекты стандартизации перевиваемых линий клеток 31
2.6. Стабилизация вирусов методом лиофильного высушивания 40
3. Собственные исследования 47
3. 1. Материалы и методы 47
4. Результаты исследований 66
4.1. Сравнительная оценка чувствительности первичной и перевиваемых культур клеток к вирусу энтерита норок 66
4.2. Стандартизация перевиваемых линий клеток - субстратов для производства вируса энтерита норок 68
4.2.1. Индикация микоплазм-контаминантов в перевиваемых лини ях клеток кошек 68
4.2.2. Деконтаминация линий клеток кошек при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно- активных веществ 70
4.2.3. Цитометрический анализ клеточного цикла линий клеток CRFHFS 75
4.2.4. Сравнительное изучение чувствительности линий клеток кошек, инфицированных и деконтаминированных от микоплазменной инфекции 84
4.3. Влияние некоторых факторов на уровень накопления гемагглютининов вируса энтерита норок в монослойных культурах клеток 85
4.3.1. Посевная концентрация клеток 85
4.3.2. Вид посевного вируса 87
4.3.3. Доза и способ заражения 88
4.3.4. Время адсорбции вируса 90
4.3.5. Состав питательных сред 92
4.3.6. Вид сыворотки крови животных 93
4.3.7. Способ культивирования вируса 95
4.3.8. Штаммы вируса энтерита норок 97
4.3.9. Вид антибактериального средства 98
4.4. Серийное пассирование вируса энтерита норок в клеточных культурах кошачьего происхождения 102
4.5. Опытно-промышленное производство вируса энтерита норок 112
4.6. Сравнительное изучение физико-химических свойств различных пассажей вируса энтерита норок 114
4.6.1. Очистка и концентрирование вируса 114
4.6.2. Электронная микроскопия ВЭН 116
4.6.3. Анализ структурных белков ВЭН методом электрофореза вДСН-ПААГе 117
4.6.4. Выделение, очистка ДНК и анализ генома вируса энтерита норок 118
4.7. Антигенные и иммуногенные свойства штамма «Береговой» вируса энтерита норок различного уровня пассажей в культуре клеток FS 120
4.8. Высушивание культурального вируса энтерита норок 123
Обсуждение результатов 129
Выводы 145
- Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок
- Стандартизация перевиваемых линий клеток - субстратов для производства вируса энтерита норок
- Влияние некоторых факторов на уровень накопления гемагглютининов вируса энтерита норок в монослойных культурах клеток
- Сравнительное изучение физико-химических свойств различных пассажей вируса энтерита норок
Введение к работе
Вирусный энтерит норок (ВЭН) - одно из наиболее распространенных острозаразных заболеваний пушных зверей. Экономический ущерб, наносимый звероводству ВЭН, складывается из гибели молодняка норок (до 90%), нарушения функции воспроизводства, а также значительных затрат на вете-ринарно-санитарные мероприятия. Существенное место в борьбе с ВЭН занимает специфическая профилактика (27,43,4, 83, 37,49, 140, 138).
За последние десятилетия ХХ-го века накоплен обширный материал по созданию противовирусных препаратов нового поколения: векторных, маркированных и синтетических. Однако, несмотря на значительные перспективы применения указанных видов вакцин, реальным на сегодняшний день остается профилактика ВЭН препаратами, изготовленными по традиционной технологии, с использованием первичных культур клеток почек котят (27, 32, 25, 44, 103, 102, 21, 177, 186, 199). Необходимо, однако, отметить, что применение данной культуральной модели не перспективно по экономическим показателям, из-за сезонности получения доноров ткани, необходимости убоя котят, трудоемкости и длительности процесса трипсинизации ткани почек, опасности эндогенной контаминации суспензии клеток различными микроорганизмами и низкой производительностью метода стационарных мо-нослойных культур, а также невозможностью длительного пассирования вируса in vitro (89, 20,178).
Известно, что за последние 10-15 лет во всем мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток, в качестве субстрата, для производства противовирусных препаратов. Необходимо отметить, что используемые в практике линии клеток собак, кошек и норок характеризуются различной чувствительностью и не обеспечивают длительного поддержания ВЭН в пассажах (91, 80, 44, 102).
Тем не менее, при общей тенденции более широкого применения МЛ К в биотехнологии, существует целый ряд нерешенных и малоизученных про блем, тормозящих процессы разработки и совершенствования противовирусных препаратов, и в частности, вакцин против ВЭН. Важное место в решении этих задач занимают вопросы: выбора, контроля и стабилизации свойств новых высокочувствительных к ВЭН культуральных моделей, совершенствования технологии и длительности культивирования ПЛК и штаммов ВЭН в больших объемах, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, стабилизации свойств и условий хранения штаммов вируса, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур и противовирусных препаратов от бактерий и микоплазм (21, 59, 17, 91, 92, 127, 190).
Поэтому исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенные в качестве субстрата для получения ВЭН с выраженными антигенными свойствами представляют для науки и практики бесспорную актуальность.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлась оптимизация условий культивирования вируса энтерита норок в культуре клеток и изучение его биологических свойств.
Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:
- провести сравнительное изучение чувствительности первичных и перевиваемых линий клеток к штаммам ВЭН и отобрать наиболее перспективные из них для серийного пассирования вируса;
- деконтаминировать отобранные линии клеток от микоплазм и оптимизировать культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и рол-лерного культивирования;
- изучить физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства куль-турального ВЭН различного уровня пассажей.
- определить условия стабилизации и хранения культу рал ьного ВЭН; Научная новизна. Определена и охарактеризована наиболее чувстви тельная к ВЭН линия клеток FS и доказана ее пригодность для получения активного гемагглютинирующего антигена в течение 25 пассажей.
Разработана рациональная схема деконтаминации ПЛК кошек от мико-нлазменной инфекции при помощи фторхинолонов.
Оптимизировано культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и роллерного культивирования.
Впервые показана возможность и перспективность использования меч-ода проточной цитометрии для изучения популяции линий клеток кошачьего происхождения, используемых в качестве субстрата для размножения вируса.
Определены физико-химические показатели белков и ДНК вирионов, антигенные и иммуногенные свойства культурального ВЭН различного уровня пассажей.
Практическая значимость. Предложена культуральная модель FS и оптимальные условия серийного пассирования ВЭН стационарным и роллер-ным методами.
Создан криобанк из линии клеток FS, очищенной от микоплазм.
Разработаны «Методические указания по поддержанию, хранению и контролю линии клеток FS», утвержденные дирекгором ФГУ «ВГНКИ» от 02. 03. 2004 г.
Предложены защитная среда оптимального состава, режимы лиофили-зации и хранения сухих форм культурального вируса энтерита норок.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2004 гг.; международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - г. Щелково, 2001 г.; методической научно-практической конференции «Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства», посвященной 70-летию ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева, п. Родники Московской обл., 2002 г.; международной научно-практической конференции «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства», посвященной 80-летию ВНИИОЗ. - г.Киров, 2002г.; международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. - г.Владимир, 2003 г.; международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». - г.Москва, 2003 г. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- теоретическое и практическое обоснование выбора ПЛК селезенки кошки (FS) и почки кошки (CRFK) для серийного пассирования ВЭН;
- практические предложения по очистке ПЛК кошек от микоплазменной контаминации при помощи фторхинолонов;
- способ и условия культивирования ВЭН в лабораторных и промышленных условиях;
- физико-химические свойства культурального ВЭН различных пассажей;
- перспективность применения ВЭН различного уровня пассажей для производства иммунобиологических и диагностических препаратов;
- условия стабилизации культурального ВЭН методом лиофильного высушивания.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 15 рисунков. Список литературы включает 199 источников, из них 93 иностранных авторов.
Особую благодарность выражаю научному руководителю профессору Груздеву К.Н., профессору Уласову В.И. и всем сотрудникам отдела вирусных препаратов ФГУ«ВГНКИ» за помощь работе, а также Б.В. Виолину, И.Л. Обухову, Ю.Г. Опарину, Т.А. Скотниковой, Н.Ю. Смысловой, А.П. Пономареву.
Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок
Вирусный энтерит (болезнь Форта Вилиам, инфекционный энтерит норок) - острая инфекционная болезнь норок, вызываемая ДНК-содержащим вирусом семейства Parvoviridae. Она проявляется воспалительно-некротическими поражениями слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, брыжеечных лимфатических узлов, селезенки, зобной железы и костного мозга (14, 4, 38, 119, 196). К вирусу восприимчивы норки всех возрастов, но чаще всего поражаются щенки в период отсадки от матерей и переходе на самостоятельное кормление (8, 168). Болезнь сопровождается высокой летальностью (до 90%) (90, 193, 133). Впервые, возбудитель болезни - вирус энтерита норок (ВЭН) был выделен и зарегистрирован в 1947 году в Канаде провинции Онтарио. В 1949 году болезнь наблюдал и описал F. Schofield (181). В последующие годы болезнь широко распространилась по северным штатам США, а с 1958 года уже регистрировалась на племенных фермах Европы (90, 196). В России первые случаи заболевания зверей с признаками вирусного энтерита были отмечены в 1965 году (78). В настоящее время болезнь регистрируется во всех регионах. 2.2. Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок. 2.2.1. Морфология, структура и химический состав вируса. По размеру и морфологии ВЭН относится к одному из самых мелких ДНК-содержащих вирусов животных (127, 134). Вирусные частицы имеют относительно простую структуру и состоят из 4-х белков и линейной одно-цепочечной молекулы ДНК (123, 129). Вирионы парвовирусов представляют К) собой мелкие безоболочечные изометрические частицы кубической симметрии в диаметре 18-26 нм. В очищенных препаратах найдены также частицы вируса размером от 6 до 12 нм, функции и значение которых изучены не достаточно полно (185, 123). Капсид парвовирусов состоит из капсомеров диаметром 2-4 нм (31, 149, 160, 174). Поверхность вирионов гладкая, без углублений и выростов. Липидов и углеводов в составе вирионов не обнаружено. Плавучая плотность вирионов в хлориде цезия составляет 1,38 - 1,45 г/см3. Плавучая плотность пустых и незрелых вирионов равна соответственно 1,31; 1,46 -1,48 г/см3 (123).. В состав вирионов парвовирусов входит односпиральная линейная плюс-ДНК (примерно 5000 нуклеотидов). В популяции вирионов парвовирусов могут присутствовать нити разной полярности - либо плюс-ДНК, либо минус-ДНК, способные гибридизироваться in vitro с образованием двуспи-ральных молекул (129, 139).
Геном парвовирусов имеет на 3 - конце вирионной цепи полиндром-ную последовательность длиной около 115 оснований (186). Этот участок ДНК может сворачиваться в шпилечную структуру (Y или Т) , которая поддерживается водородными связями между комплементарными последовательностями. Полиндромные 5 -концевые участки также могут образовывать шпильки, однако их последовательность совершенно не похожа на последовательность на З -конце вуирионной цепи (109, 129). Синтез и сборка ДНК ВЭН происходит в клеточном ядре. Локализация процесса репликации протекает в тесной зависимости с клеткой - хозяином, либо вирусами-помощниками (195). Репликация парвовирусов подавляє гея ингибиторами синтеза клеточной ДНК и происходит только в делящихся клетках. Максимальная скорость синтеза вирусной ДНК всегда совпадает с S-фазой клеточного цикла. Репликативная форма вирусной ДНК вначале, по-видимому, подвергается полуконсервативной репликации, а затем происходит синтез вирусных белков. Комплементарная нить репликативной формы II при этом сохраняется (193). Модели репликации нуклеиновой кислоты сводятся к включению исходной вирусной нити ДНК в линейную двунитчагую репликативную форму после внедрения вируса в клетку. Вирусная ДНК встраивается в клеточный геном только в двуспиральной форме (8 1, 129). Белки парвовирусов составляют 63-81 % массы вариона. Зрелые вирионы энтерита норок образованы четырьмя капсидными белками VP1, VP2, VP3 и VP4 с молекулярными массами 77,5; 63,5, 61,0 и 54,0 кД соответственно. Белковый капсид окружает геномную одноцепочечную ДНК отрицательной полярности длиной 5094 нуклеотидных остатка, содержащий две неиерекры-вающие открытые рамки считывания (123, 155). Первая находится в 5 -концевой половине генома и кодирует неструктурный белок NS1, вторая - в З -концевой половине генома кодирует структурные белки VP1, VP2, VP3 и VP4. Белок VP2 является основным структурным белком, ответственный за сборку ВЭН (приблизительно 60 копий) и занимает около 80% от суммарного количества белка (192). Белок VP3 формируется только в полных капсидах путем отщепления 15-20 аминокислот от белка VP2. Белки VP1 и VP3 важны для проявления инфекционной активности вируса (108). 2.2.2. Физико-химические свойства вируса. Парвовирусы являются наиболее стабильными среди всех известных в настоящее время вирусов млекопитающих. ВЭН хорошо переносит лиофили-зацию и в высушенном виде сохраняется при температуре от 4 до 20С в течение 12-13 месяцев (39). Кроме того, ВЭН весьма хорошо переносит и низкие температуры (-40С), где инфекционный титр сохраняется в течение 3-4 лет. Однократное замораживание (при минус 40С) и размораживание при комнатной температуре не влияло на гемаглютинирующие свойства вируса. В тоже время, двукратное замораживание и размораживание при указанных температурных режимах приводило к снижению гемаглютинирующей активности антигена в два раза (26). Термостабильность ВЭН в определенной степени зависит и от степени его адаптации к клеточной системе. Свежевыделенные штаммы более чувствительны к температурным воздействиям, адаптированные - более резистентны (19). Ультрафиолетовые лучи разрушают ВЭН. Время необходимое для полной инактивации вируса определяется расстоянием от источника облучения, интенсивностью потока лучей и характером вируссодержащего материала (149). Солнечные лучи также губительно действуют на вирус, однако процесс проходит довольно медленно. При нагревании до 37 С снижение титра вируса происходит в течение 2-х часов, а при 56 С - в течение 48 часов. Нагревание до 100С в течение 5 минут приводит к полной потере гемаглюти-нирующей активности ВЭН (57, 196).
Подобно другим парвовирусам, ВЭН устойчив к действию эфира, хлороформа, трипсина и стабилен при рН среды 3,0-9,0 (165, 168). При обработке вируссодержащего материала указанными веществами гемагглютинирующая активность антигена практически не снижалась (5). В тоже время ВЭН высоко чувствителен к воздействию растворов формальдегида и йодистого калия (165). Исследования R.H. Johnsona (148) показали, что ВЭН инактивируется в 0,2, 0,1 и 0,05%-ном растворах формальдегида в течение 24 часов, 2-х и 3-х суток соответственно. Устойчивость вирусов к химическим веществам различна и зависит от строения вириона и нуклеиновой кислоты. Безоболочечные вирусы более устойчивы к действию дезинфектантов, чем вирусы, обладающие оболочкой (70, 120). Исследования Н.Ф. Чертовича (101) по стабильности штамма «Родники» ВЭН к химическим веществам показали, что ВЭН устойчив к действию молочной, муравьиной и уксусной кислоты, а также к химическим веществам относящимся к группе фенолов - фенолу, лизолу, крезолу. Перекись водорода и кальцинированная сода оказывали слабое инактивирующее действие на возбудитель энтерита норок. Наиболее активными дезинфицирующими веществами в отношении ВЭН являются едкий натр, формальдегид, глутаро-вый альдегид и хлорсодержащие препараты. 2.2.3. Очистка вируса. Традиционно для очистки парвовирусов из культурального клеточного супернатанта используют следующие методы: СаСЬ - преципитацию (128), полиэтиленгликолевую преципитацию (170), центрифугирование в изопик-ническом градиенте CsCl (128, 170, 176) и гемадсорбционную элюцию (122). Часто их применяют в комплексе. Метод изопекнического центрифугирования в градиенте сахарозы- хлористого цезия ранее был успешно применен P.S. Carman, R.C. Povey (123) для очистки парвовирусов энтерита норок, собак, панлейкопении кошек. Этот метод используется для фракционирования зрелых вирионов. В модификации, с предварительным концентрированием ПЭГ-6000, метод изопик-нического центрифугирования в растворах хлористого цезия применялся P.R. Paradiso и др. (173) для фракционирования зрелых вирионов парвовируса собак. Выбор плотности раствора CsCl для градиента обосновывается литературными данными по плавучей плотности зрелых инфекционных вирионов ВЭН, в частности, 1,42-1,43 г/см3 (123).
Стандартизация перевиваемых линий клеток - субстратов для производства вируса энтерита норок
Проблема выбора и стандартизации клеточного субстрата во многом определяется возможностью серийного производства и стабильностью выпуска высокоэффективных противовирусных препаратов. Наиболее перспективными в этом плане считают перевиваемые линии клеток (ПЛК), охарактеризованные в соответствии с требованиями ВОЗ (1987, 1988). Они доступны и экономичны в применении, не требуют для своего воспроизводства дополнительных источников тканей, и имеется реальная возможность длительного хранения и стандартизации линий клеток по культуральным, морфологическим показателям, контаминации посторонними агентами и чувствительностью к вирусам. В работе испытывали 3 наиболее перспективных и чувствительных к ВЭН перевиваемых линий клеток кошек, поддерживаемых в ВГНКИ и других организациях, и первичную культуру клеток почек котят на микоплаз-менную инфекцию. Для индикации микоплазм в культурах клеток использовали параллельно микробиологический (ММ) и цитохимический (ЦХМ) методы и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Результаты контроля клеточных культур на контаминацию микоплазмами обобщены в таблице 3. Полученные данные свидетельствуют о том, что все тестируемые линии клеток в различной степени контаминированы микоплазмами. Из первичной культуры клеток почки котят контаминант выделить не удалось. оценка трех методов контроля микоплазменной инфекции ПЛК показала, что достаточно сложным, требующим дорогостоящего оборудования, но и наиболее чувствительным является молекулярно-биологический метод ПЦР. Совместно с д.б.н. И.Л.Обуховым с использованием ПЦР микоплазменная инфекция была установлена во всех трех перевиваемых линиях клеток. В тоже время с помощью ЦХМ микоплазменная инфекция была установлена в двух культурах клеток (СС-81, CRFK) и в одном случае (FS) получен отрицательный результат. Необходимо также отметить, что при окраске культур оливомицином в инфицированных клетках линий СС-81 и CRFK наблюдали как единичные, так и скопления микоплазм-контаминантов, оцениваемые в 1-2 креста. Микробиологический метод контроля оказался неэффективным, так как ни в одном случае контаминант из клеточных культур изолировать не удалось. По-видимому, это было обусловлено как низким уровнем инфициро-ванности культур, так неадекватностью использованных сред потребностям микоплазм-контаминантов.
При первичном высеве исследуемых материалов на микробиологические питательные среды в одном случае наблюдали не ха- рактерный рост инокулята на агаре и ПЖА, однако при дальнейшем 3-х кратном пассировании подтвердить микоплазменную инфекцию линии клеток СС-81 не удалось. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что микоплаз-менная инфекция линий клеток кошек установлена во всех 3-х клеточных линиях только при помощи ПЦР. Достаточно чувствительным оказался также ЦХМ индикации контаминанта который, по нашему мнению, пригоден для предварительного контроля и оценки уровня инфицированности клеточных культур микоплазмами. 4.2.2. Деконтяминяция линий клеток кошек при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно-активных веществ Оценивали эффективность применения моно препарата на основе энрофлона-К по методу Мовлеса (162) и двух комбинированных препаратов на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и этония (7 мкг/мл), энрофлона-К (35 мкг/мл) и твина-80 (7 мкг/мл) для деконтаминации линий клеток СС-81, FS и CRFK. Цитохимическим методом было предварительно установлено, что тест-культуры инфицированы микоплазмами на 1-3 креста. В опыте и контроле минимальные концентрации клеток линий СС-81, FS и CRFK не превышали 40 и 50 тыс/мл. Используемая в работе сыворотка крови была обработана с профилактической целью энрофлоном-К в дозе 20 мкг/мл в течение 72 часов при 37С. Линии клеток СС-81 и FS с минимальной посевной концентрацией клеток 40 и 50 тыс/мл, соответственно, обрабатывали в течение 10 пассажей при помощи энрофлона-К в дозе 10 мкг/мл. Уровень контаминации клеточных культур микоплазмами ЦХМ составлял 1-2-х креста (наличие единичных ми-коплазм). Затем тестируемые линии клеток выращивали дополнительно в течение 10 пассажей с использованием в качестве антибактериальных контрольных средств пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Схема деконтаминации линии CRFK предусматривала одновременное внесение в суспензию клеток норфлоксацина и энрофлона-К в субтоксической дозе (50 и 35 мкг/мл) и поверхностно-активных веществ этония и твина-80 в оптимальной концентрации 7 мкг/мл. Линию клеток выращивали в стационарных условиях с 2-3-х кратной сменой среды с комплексным препаратом, при этом монослой не формировался. Растущие клоны клеток отделяли от стекла диспергентом и проводили следующий пассаж по предложенной схеме с интервалом 8-12 суток. После 10 кратной обработки культуры дополнительно пассировали в течение 10 пассажей с добавлением контрольного антибактериального препарата. Условия поддержания линий клеток in vitro соответствовали требованиям паспорта. Отсутствие или наличие мико-плазменной инфекции в опытных и контрольных культурах оценивали в ПЦР на уровне исходном, 5, 10 и 20 пассажей, а также по культуральным и морфологическим показателям. В результате выполненных исследований показано (табл. 4), что энроф-лон-К в оптимальной дозе является достаточно активным в отношении мико-плазм-контаминантов и умеренно токсичным для линий клеток СС-81 и FS. Десятикратное применение препарата позволило полностью очистить культуры клеток от микоплазменной инфекции. Эффект элиминации микоплазм из клеток линии FS был достигнут в наших опытах даже после 5-ти кратной обработки культуры фторхинолоном. Эти результаты были получены благодаря оптимальному соотношению дозы ФХЛ, посевной концентрации клеток и уровню инфицированности микоплазмами клеток в культурах. Было также установлено, что при обработке клеточных культур энроф-лоном-К в дозе 10 мкг/мл наблюдалась общая закономерность в изменении культуральных и морфологических показателей линий клеток СС-81 и FS. В течение первых 5-ти пассажей ИП незначительно снижался, монослой формировался не полностью, и на 5-6 сутки в культуре отмечали появление зернистых и округлых клеток, часть которых дегенерировала с образованием «окон». Рисунок клеточных культур и границы клеток были слабо выражены.
В последующие 5 пассажей ИП линии клеток заметно повышался, зернистость исчезала, сроки образования монослоя сокращались на 1-2 суток, морфологическая характеристика соответствовала паспортным данным, а границы и рисунок клеток в культурах становились более выраженными. При дальнейшем пассировании (11-20 пассажи) с общепринятыми антибиотиками опытные образцы линий клеток СС-81 и FS формировали монослой (на 3-4 сутки наблюдения) без признаков дегенерации клеток в культуре и по результатам контроля в ПЦР и ЦХМ не содержали микоплазм-контаминантов. В контрольных образцах культур напротив, отмечали дегенеративные изменения в виде зернистости, образовании округлых клеток и «окон» и нечеткости границ клеток в культурах. Специфичность этих процессов подтверждена в ПЦР и ЦХМ. Было также установлено (табл. 4), что комбинации препаратов на основе фторхинолонов и ПАВ характеризовались выраженными антимикоплазмен-ными свойствами и обеспечили деконтаминадию линии клеток CRFK от кон-таминанта даже в течение 5 пассажей. Дальнейшая обработка образцов клеточной культуры CRFK комбинацией препаратов и последующее 10-ти кратное пассирование с использованием общепринятых антибиотиков не изменило достигнутого эффекта, что и было подтверждено в ПЦР. Кроме того, было отмечено, что испытуемые препараты обладали достаточно высокой, но различной, цитотоксичностью. Более выраженные дегенеративные изменения имели место при использовании комплексного препарата на основе энрофло-на-К (35 мкг/мл) и твина-80. На уровне первых 5 пассажей наблюдали ост-ровковый рост культуры, 2-4-х кратное снижение урожая, а также появление округлых, зернистых и полигональных клеток, часть из которых отделялась от субстрата с образованием «окон» и тяжей. К 10 пассажу линия CRFK восстанавливала ростовые свойства и морфологию клеток в культуре. Выросшие образцы монослойных культур были представлены прозрачными эпителио-подобными клетками с четко выраженными границами.
Влияние некоторых факторов на уровень накопления гемагглютининов вируса энтерита норок в монослойных культурах клеток
Увеличение выхода вирусов в монослойных культурах клеток представляет для практики несомненный интерес, особенно при крупномасштабном изготовлении диагностикумов и иммунобиологических препаратов. Из многочисленных публикаций (79, 68, 45, 142, 173, 193) известно, что уровень накопления вирусов в значительной степени зависит от чувствительности куль-туральной модели, внутриклеточных факторов, обусловленных структурой, метаболизмом и строением ДНК, а также факторов внешней среды, оказывающих влияние на уровень накопления вирусов. Задачей данного раздела работы является разработка оптимальных условии культивирования штаммов вируса энтерита норок (ВЭН) в стационарных п роллерных культурах клеток кошек в зависимости от факторов внешней среды. 4.3.1. Посевная концентрация клеток Исследовали размножение штамма «Береговой» вируса энтерита норок (ВЭН) в стационарных условиях в культуре FS в зависимости от посевной концентрации клеток. Клетки отделяли от субстрата при помощи дисиергеп-гп па основе химопсина в 0,02%-ном растворе версена. В суспензию с посевной концентрацией 100, 150 и 200 тыс. клеток в мл ростовой питательной среды Игла MEM вносили вирус из расчета 6,0 log2 в РГА на мл среды, выдерживали 1 час, добавляли 2-5% фетальной сыворотки и инкубировали в течение 8 суток. Полученные образцы вируса однократно замораживали (20 С), а оттаивали (37С) и исследовали на активность в РГА. Схема постановки опыта и результата накопления ВЭН в культуре FS с различной посевной концентрацией клеток приведена в таблице 8. Из представленных данных видно, что сроки формирования монослой-ных культур зависят от исходной концентрации клеток в суспензии. При посевной концентрации клеток 200, 150 и 100 тыс/мл монослой формируется через 3, 4 и 5 сутки наблюдения. Кроме того было отмечено, что в образцах культур с посевной концентрацией клеток 200 тыс/мл на 6 сутки наблюдения отмечается агглютинация и дегенерация клеток. При всех испытанных концентрациях клеток максимальное накопление штамма «Береговой» ВЭН отмечали на 6 сутки культивирования. Практически равноценные титры вируса были получены в образцах культур с посевной концентрацией клеток 100 (12,0 ± 0,01 log2 в РГА) и 150 тыс/мл (11,6 ± 0,33 Iog2 в РГА). Повышение концентрации клеток до 200 тыс/мл сопровождалось достоверным (р 0,05) снижением уровня накопления вируса (9,6 ± 0,01 log2BPrA). Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что для практических целей наиболее экономично и целесообразно применять линию клеток FS с исходной концентрацией клеток 100 тыс/мл. 4.3.2. Вид посевного вируса В сравнительном аспекте оценивали возможность замены посевного тканевого вируса на культуральный.
Это обусловлено тем, что получение тканевого антигена из слизистых трубок инфицированных норок трудоемко и экономически не оправдано. Для выращивания ВЭН использовали линию FS с посевной концентрацией 100 тыс. клеток в мл среды Игла MEM. В качестве посевного вируса были испытаны 10%-ная суспензия слизистых трубок норок, инфицированных штаммом «Береговой» и первый пассаж аналогичного штамма, репродуцированного в культуре клеток FS, с активностью 11,0 log2 в РГА. В матрасы с клеточной суспензией культуры FS вносили посевной вирус из расчета 6,0 log2 в РГА на мл среды, адсорбировали на клетках в течение 1 часа, добавляли 2-5% фетальной сыворотки крови и инкубировали в течение 6 суток. Полученные образцы вируса однократно замораживали (-20С) и оттаивали (+37С) и исследовали на активность в РГА. Схема постановки и результаты эксперимента представлены в таблице 9. Из представленных данных видно, что более высокое накопление штамма «Береговой» было отмечено при заражении культуры клеток FS культу-ральным вирусом (13,7 ± 0,57 log2 в РГА). В опыте с тканевым посевным вирусом титры гемагглютинирующего антигена не превышали 12,0 log2 в РГА и достигали в среднем 11,3±0,57 log2 в РГА. Применение в работе кул морального вируса более перспективно, так как он достаточно активен, стабилен в течение двух лет хранения при температуре (-40С), длительно пассируется и накапливается в ПЛК кошек в максимальных титрах. Известно, что доза заражения (Д) оказывает существенное влияние па размножение вирусов. При этом уровень накопления вирусов также зависит от чувствительности культуральной модели. Следует однако отметить, что в доступной интернатуре (24, 20) практически отсутствуют сведения об уровне накопления ВЭН в линии клеток FS в зависимости от дозы заражения. В наших опытах исследовали размножение штамма «Береговой» вируса энтерита норок в зависимости от дозы и способа заражения. В качестве культуры использовали перевиваемую линию FS с посевной концентрацией клеток 100 тыс/мл. В матрасы с клеточной суспензией вносили культуральный вирус первого пассажа из расчета 3,0-4,0, 4,0-5,0 и 6,0-7,0 log2 в РГА на мл среды. Время адсорбции вируса клетками FS составляло 60 мин при 37С. Затем в матрасы вносили 2-5% фетальной сыворотки и инкубировали при 37С в течение 8 суток. Уровень накопления вируса в монослойной культуре оценивали на 5-7 сутки культивирования после однократного замораживания (20С) и оттаивания (37С) инфицированных образцов культур. В результате выполненных исследований установлена (табл.10) общая закономерность в уровне и сроках накопления ВЭН в зависимости от дозы заражения. Максимальные титры ГА антигена (12,8 ± 0,57 log2 в РГА) наблюдали на б сутки культивирования при инфицирующей дозе вируса 6,0-7,0 log2 в РГА на мл среды. Уменьшение дозы заражения до 4,0-5,0 и 3,0-4,0 log2 в РГА на мл среды сопровождалось увеличением сроков накопления вируса до 7-8 суток. При этом титры ГА антигена были достоверно ниже и не превышали соответственно 10,3 ± 0,57 и 9,6 ± 0,33 log2 в РГА. Было также отмечено, что дальнейшее увеличение дозы заражения (8,0-9,0 log2 РГА не сопровождалось достоверным увеличением уровня накопления штамма «Береговой» ВЭН. На следующем этапе работы оценивали влияние способа заражения на уровень и сроки максимального накопления гемагглютинирующего антигена в линии FS с посевной концентрацией 100 тыс. клеток в мл среды. Инфицирующая доза ВЭН была оптимальной и составляла 6,0 log2 в РГА на мл среды.
Инокулят вносили на монослойную культуру (контроль) и в суспензию культуры клеток FS. Время адсорбции вируса клетками составляло 60 мин при 37С. Результаты испытаний (табл.11) свидетельствуют о том, что в инфицированной суспензии клеток FS вирус энтерита норок накапливается в максимальных титрах 12,8 ± 0,57 1о& в РГА на 6 сутки культивирования в период формирования монослойной культуры клеток. В тоже время при инфицировании вирусом монослойной культуры максимальное накопление ГА антигена было ниже и в аналогичные сроки культивирования не превышало 10,0 ± 0,33 log2 в РГА. Следует также отметить, что затраты рабочего времени на получение антигена в контроле возрастали на 48 часов, что было обусловлено необходимостью получения монослойной культуры клеток. Таким образом, результаты проведенных исследований убедительно доказывают важность выбора оптимальных дозы и способа заражения культуры клеток с целью получения в минимальные сроки максимальных титров вируса. Исходя из полученных данных, в дальнейших исследованиях при культивировании ВЭН использовали оптимальные дозы заражения (6,0-7,0 log2 в РГА на мл среды) и суспензионный метод заражения культуры клеток. 4.3.4. Время адсорбции вируса В вирусологической практике при получении антигенов широко и с положительным эффектом применяется метод предварительной адсорбции вируса клетками культур. Эффективность этого приема зависит от чувствительности культур, времени контакта с клетками-мишенями и температурным режимом. В эксперименте оценивали уровень накопления штамма «Береговой» ВЭН в зависимости от времени предварительной адсорбции инокулята клетками монослойной культуры FS при температуре 37С. При изготовлении культуры посевная концентрация клеток и время культивирования составляли соответственно 100 тыс/мл и 6 суток при 37С. В матрасы с клеточной суспензией вносили культуральный штамм «Береговой» 1-го пассажа из расчета 6,0 log2 в РГА на мл среды. Время предварительной адсорбции вируса клетками FS составляло 30, 60, 90 и 120 минут при 37С, в контроле - адсорбция вируса не проводилась. После проведения указанной процедуры в опытные и контрольные флаконы вносили 2-5% эмбриональной СК и инкубировали в течение 6 суток при температуре 37С. Результаты опытов (п = 3) оценивали по уровню накопления ГА антигена в сравнении с контролем (таблица 12). Анализ представленных материалов свидетельствует о том, что время предварительной адсорбции вируса клетками FS оказывает существенное влияние на уровень накопления ГА антигена ВЭН.
Сравнительное изучение физико-химических свойств различных пассажей вируса энтерита норок
Получение очищенных вируссодержащих материалов предполагает применение комбинированных методов очистки вирусов. С этой целью были использованы методы очистки, концентрирования ВЭН при помощи ПЭГ-6000, и дифференциальное градиентное центрифугирование. В качестве исходного вируссодержащего материала применяли культуральный штамм "Береговой" ВЭН 5 и 25 пассажей, репродуцированный в наиболее чувствительной линии клеток FS с активностью 12,0 log2 в РГА. Исходные материалы в объеме по 3 л концентрировали ПЭГ-6000 и очищали хлороформом. В результате указанных процедур было получено 60 мл концентрата, который фракционировали в линейном градиенте сахарозы-хлористого цезия с последующим сбором фракций. В результате фракционирования были выделены 2 фракции (рис.П) - нижняя (1,42-1,43 г/см3) и верхняя (1,30-1,34 г/см3). Нижнюю фракцию подвергали диализу против STE буфера в течение 12 часов и затем концентрировали высокоскоростным центрифугированием. В результате исходный вируссодержащий материал был сконцентрирован 103,8 раза. Эффективность использованных методов очистки и концентрирования культуральных антигенов были охарактеризованы по ГА активности и удельному содержанию общего белка по методу Бредфорда. Метод отличается простотой в исполнении , минимальными затратами труда и времени, высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов контроля. В таблице 21 обобщены общие показатели очистки и концентрирования ВЭН 5 и 25 пассажа в культуре клеток FS. При проведении очистки и концентрирования препаратов ВЭН комбинированным методом (осаждение ПЭГ - 6000, обработка хлороформом, градиентное центрифугирование) удалось достичь высокой степени очистки (99,8%) от балластных белков и высокой степени концентрирования (1,0x10 раз) как по общему белку, так и по ГА активности культуралыюго антигена 5 и 25 пассажей в культуре FS, что подтверждает эффективность использованных методов и равноценность испытанных образцов культу рал ьного вируса. 4.6.2. Электронная микроскопия препярятов ВЭН Для определения размеров и морфологии ВЭН применяли электронную микроскопию концентрированных и очищенных препаратов ВЭН. Эффективность применения электронной микроскопии в данном случае была обусловлена высокой степенью концентрации вируса в препаратах. Исследовались сконцентрированные препараты ВЭН 5 и 25 пассажей (рис.12). Отличий в удельной концентрации вирионов и их морфологии в данных препаратах не выявлено.
Количество частиц в сконцентрированных препаратах ВЭН 5 и 25 пассажей, зрительно установленная по плотности заполнения вирусом поля наблюдения, находилась в пределах 109-1010 частиц/мл. Вирусные капсиды по структуре стенки вириона однослойные, безоболочечные, состоят из 60 капсомеров и имеют икосаэдрическую структуру с характерными выступами длиной 3-5 нм. Диаметр частиц составлял 24-25 нм. В суспензии присутствовали преимущественно неповрежденные вирусные частицы (более 90%). Количество дефектных частиц и пустых капсидов было невелико. Анализ морфологической характеристики частиц свидетельствует о том, что по структуре они соответствуют парвовирусам плотоядных. 4.6.3. Анализ структурных белков ВЭН методом электрофореза в ДСН-ПААГе Исследование белкового состава концентрированного вируссодержащего материала методом электрофореза в ДСН-ПААГе является надежным общепринятым подходом для изучения структурных компонентов вирионов, их количества и величины отдельных молекул. Указанный метод дает дополнительную информацию о присутствии в вируссодержащем материале балластных белков и служит таким образом качественным критерием оценки белковой чистоты препарата. Метод является высоковоспроизводимым и удобным для работы с небольшим количеством антигена. Метод электрофореза в ДСН-ПААГе нами применен для оценки чистоты концентрированных препаратов ВЭН 5 и 25 пассажей и качественной характеристики структурных белков ВЭН в данных препаратах. Для определения белкового состава концентрированный культуральный антиген ВЭН анализировали электрофорезом в 7%-ом ДСН-ПААГе с длиной геля 8 см, при толщине спейсеров 0,75 мм. Продолжительность электрофореза составляла 2,5 часа при напряженности электрического поля 30 В/см. В результате выполненных исследований были получены фореграммы с достаточным разделением белковых фракций маркера и вируса энтерита норок (рис. 13). Были выявлены 4 протеина, характерные для зрелого вириона данного вируса - А, В, С и D. Определена молекулярная масса вирусных белков: протеин А (77,7 кДа), протеин В (63,5 кДа), протеин С (61,5кДа), протеин D (53,9 кДа). Большого протеина - предшественика (199,5 кДа) в треке вирусных протеинов не выявлено. С помощью метода электрофореза в ДСН-ПААГе достигнуто разделение всех описанных для ВЭН протеинов (123), что подтверждает эффективность выбранной методики и свидетельствует об отсутствии значимых отличий в количестве и электрофоретической подвижности белков ВЭН 5 и 25 пассажей. 4.6.4. Выделение, очистка ДНК и анализ генома ВЭН Геном парвовирусов плотоядных представлен одноцепочечной ДНК величиной около 5 тыс. нуклеотидов. Данный признак является характерным для группы парвовирусов (197). Методы выделения и электрофореза нуклеиновых кислот могут предоставить дополнительную информацию по электрофоретической подвижности геномной ДНК ВЭН, чистоты препарата и нативности генома ВЭН в очищенных и сконцентрированных препаратах. Поскольку вышеуказанные параметры имеют диагностическую ценность, нами был применен метод электрофореза ДНК для изучения генома ВЭН и получения доказательств принадлежности к парвовирусам плотоядных и установления стабильности генома при длительном пассировании ВЭН в культуре клеток FS. Нами был выбран «мягкий» метод выделения ДНК с помощью протеиназы - К с целью максимального сохранения нативности ДНК ВЭН. Электрофорез проводился в агарозном геле в денатурируЕощих условиях для элиминации вторичных структур геномной ДНК и корректной оценки величины генома ВЭН.
Этот метод электрофореза отличается высокой воспроизводимостью результатов и простотой постановки. В результате использования метода выделения ДНК с протеи назой-К была получена вирусная одноцепочечная ДНК. Препарат вирусной ДНК был анализирован методом электрофореза в 1,5%-ом агаровом геле, содержащем 20% формамида. Электрофорез продолжался 2 часа при напряженности электрического поля 8 В/см. На полученной фореграмме достигнуто достаточное разделение ДНК маркера и вируса (рис.14). Отмечена аномально высокая подвижность высокомолекулярной фракции маркера (21,2 п.н.), вероятно ввиду ограничения разрешающей способности геля для фракций такой величины. Данная фракция не учитывалась при расчете длин более легких фракций ДНК, в том числе и вирусной ДНК. В треках вирусной ДНК выявлена единственная фракция. Определенная длина ДНК, соответствующая этим фракциям, составила примерно 5,1 тысяч нуклеотидов. В данных треках наблюдался так же легкий шлейф низкомолекулярной ДНК возникший, вероятно, из-за частичной деградации образцов вирусного генома во время выделения и очистки нуклеиновой кислоты. Таким образом, в результате сравнительного изучения не было выявлено существенных различий в электрофоретической подвижности геномной ДНК ВЭН 5 и 25 пассажа. Этот факт подтверждает стабильность генома штамма «Береговой» ВЭН в процессе серийного пассирования в культуре клеток FS. 4.7. Антигенные и иммуногенные свойства штамма «Береговой» ВЭН различного уровня пассажей в культуре клеток FS Антигенную активность нативного и инактивированного штамма «Береговой» ВЭН оценивали в лабораторных условиях на кроликах по срокам и величине антительного ответа. С этой целью были сформированы 4 группы но 4 кролика массой 3,0-3,5 кг, которых иммунизировали в объеме 1 мл внутримышечно нативным и инактивированным антигеном 5 и 25 пассажа в линии клеток FS. В качестве контроля служили 2 группы кроликов которых иммунизировали внутримышечно нативным и инактивированным тканевым антигеном в аналогичной дозе. Активность культурального и тканевого антигенов была равной и составила 10,0 log2 в РГА. Антигенные свойства образцов препаратов изучали в динамике на 7, 14 и 21 сутки после иммунизации по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотках крови опытных и контрольных кроликов. Результаты испытаний представлены в таблице 22. Испытания показали, что титры антител в сыворотках крови интактных кроликов не превышали 1:2 - 1:4. Было также отмечено, что по антигенной активности нативные и инактивированные формалином образцы штамма «Береговой» ВЭН 5 и 25 пассажей в культуре FS с активностью 10,0 к РГА
