Введение к работе
Актуальность темы
Бактериальные системы рестрикции-модификации (РМ системы) являются одними из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии. Данные системы состоят из ферментов двух типов: первые, эндоиуклеазы рестрикции, (ЭР) проявляют рестрикционную (гидролитическую) активность, вторые, ДНК-метил грансферазы (МТазы), -модифицирующую. ЭР узнают определенные короткие последовательности и расщепляют по ним ДНК, в то время как М Газы метилируют одно из оснований того же сайта, защищая таким образом хозяйскую ДНК от гидролиза собственной ЭР. Изучение все большего числа ферментов РМ систем приводит к выводу, что роль данных белков в прокариотических клетках не ограничивается лишь защитной функцией, и биологическое значение этих систем не выяснено до конца.
В связи с небольшим молекулярным весом, относительной простотой организации, высокой субстратной специфичностью, а также огромным разнообразием узнаваемых последовательностей, ферменты РМ систем являются привлекательными модельными объектами для изучения фундаментальной проблемы ДНК-белковых взаимодействий. С другой стороны, ЭР представляют собой незаменимые инструменты для различных манипуляций с ДНК во всех областях молекулярной биологии.
Среди существующих РМ систем большой интерес представляют те из них, ферменты которых узнают непалиндромные последовательности ДНК. В этих системах содержится две или более МТаз, каждая из которых модифицирует свою цепь ДНК, а ЭР функционируют либо как мономеры, либо как гетеродимеры. Структурная организация таких РМ систем по сравнению с РМ системами, узнающими симметричные сайты, является заведомо более сложной. При этом, как генетическая организация «несимметричных» РМ систем, гак и свойства составляющих их ферментов исследованы явно недостаточно. Вследствие этого актуальным представляется изучение, как структуры, так и свойств отдельных компонентов РМ систем с непалиндромными сайтами узнавания.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы явилось изучение системы рестрикции-модификации И типа BspACl из бактериального штамма Bacillus psychrodurans АС. В задачи настоящего исследования входило:
установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой ЭР BspACl;
исследование чувствительности ЭР BspACl к mSC-метилированию сайта узнавания на различных ДНК-субстратах;
получение рекомбинантной плазмиды, несущей ген(ы) МТазы(аз) BspACI; клонирование гена(ов) МТазы(аз) в составе экспрессируюшего(их) вектора(ов);
выделение гомогенного(ых) препарата(ов) рекомбинантной(ых) МТазы(аз) BspACI и определение оптимальных условий функционирования фермента(ов);
определение осиования(ий), метилируемого МТазой(ами) BspACI;
проведение сравнительного анализа кинетических параметров реакции(й) метилирования, катализируемой(ых) МТазой(азами) BspACI;
определение организации оперона РМ системы BspACI.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате выполнения данной работы найден бактериальный штамм Bacillus psychrodurans АС, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции II типа BspACI. Фермент узнаёт последовательность ДНК S'-CICGC-S'/S'-GGCTG-S' и расщепляет ее как указано стрелками. Детальное изучение чувствительности ЭР BspACI к т5С-метилированию сайта узнавания позволяет использовать данный фермент в молекулярно-биологических и генно-инженерных экспериментах с ДНК млекопитающих.
Путем клонирования получена рекомбинаитная плазмида pBspACI, несущая гены двух т5С-ДНК-метшпрансфераз BspACI. Показано, что данная плазмида может быть использована для поиска новых метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз. Гены обеих МТаз субклонированы в составе экспрессируюших векторов и выделены гомогенные препараты рекомбинантных балков. Каталитические параметры, измеренные для данных ферментов, использовались в сравнительном анализе, который показал, что константы Михаэлиса в целом для ДНК-метилтрансфераз с папиндромными сайгами узнавания более чем на порядок выше таковых для МТаз с непалиндомиыми сайтами узнавания.
Установлено, что ген второй ДНК-метилтраисферазы BspACI имеет на N-конце домен, гомологичный Хге-регуляторам транскрипции, в том числе нескольким контрольным белкам РМ систем, из чего можно сделать вывод об участии данной МТазы в регуляции іранскригшии своего гена. Анализ первичных структур т5С-ДНК-мстилтрансфераз НА и 11S типа показал, что M2.BspACI является единственным ферментом, имеющим предполагаемый регуляторний домен.
Установлена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Bacillus psychrodurans АС, следующего за генами МТаз, содержащая третью открытую рамку трансляции (ОРТ 3). Методом масс-спектрометрии было показано соответствие данной ОРТ эндонуклеазе рестрикции BspACI. Таким образом, установлен порядок расположения всех генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации BspACI, и определены предполагаемые цис-регуляторные элементы их экспрессии.
ДНК-метилтрансферазы, охарактеризованные в данной работе, были использованы при создании специальных мегилированных субстратных ДНК для осуществления поиска новых метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, способных расщеплять CG-метилированную ДНК человека в рамках проекта Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-гехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Разработка способов получения высокоэффективных продуцентов метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, способных расщеплять CG-мстилированную ДНК человека, для нужд эпигенетической диагностики онкозаболеваний» (государственный контракт на выполнение научно-исследовательских работ № 16.512.11.2167).
Апробация работы и публикации
Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих российских и международных конференциях: «XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых» (Москва, 2009); «XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых» (Москва, 2010); «Конференция лауреатов Всероссийского конкурса «Студенты, аспиранты и молодые ученые - малому наукоемкому бизнесу - «Ползуновские гранты» (Барнаул, 2009), "Nucleic Acid Enzymes & Enzymes in Human Disease" (Тяпьцзинь, Китай, 2011). По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 129 станицах машинописного текста и включает 38 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение. Список цитируемой литературы содержит 220 ссылок.
