Введение к работе
Актуальность проблемы: Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов и составляют до 1% их генома. Бактериальные СРМ обычно состоят из двух ферментов, конкурирующих за одну и ту же ДНК-мишень: эндонуклеазы рестрикции (ЭР), узнающей и расщепляющей специфические последовательности ДНК, и ДНК-метилтрансферазы (МТ), метилирующей по определенным положениям ту же последовательность. Тем самым МТ защищает хозяйскую ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. СРМ служат защитным механизмом от проникновения в клетку чужеродной ДНК, ограничивая горизонтальный перенос генов и, таким образом, обеспечивают поддержание целостности генома микроорганизмов и способствуют увеличению разнообразия их видов.
Обнаружение эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз открыло новую эру в молекулярной биологии благодаря развитию технологии рекомбинантных ДНК. Большинство описанных к настоящему времени СРМ относится к типу П. Это связано, главным образом, с преимущественным распространением их в природе по сравнению с системами других типов, а также обусловлено целенаправленностью поиска в связи с их практическим применением в генной инженерии и молекулярной медицине. ЭР и МТ служат идеальными модельными объектами для изучения взаимодействий белок - ДНК и эволюционных взаимосвязей среди различных групп ферментов. Белки СРМ являются объектами исследования структурной биологии. К настоящему времени с помощью рентгеноструктурного анализа охарактеризованы пространственные структуры 37 эндонуклеаз и 8 ДНК-метилтрансфераз типа П.
Ферментативный перенос метальной группы на определенные нуклеотиды в молекуле ДНК является самой распространенной формой биологической модификации ДНК. Эта реакция катализируется МТ путем переноса метальных групп с кофактора S-аденозил-Ь-метионина (AdoMet) на ДНК с образованием продуктов реакции, метилированной ДНК и 3-аденозил-1,-гомоцистеина (AdoHcy). Метилирование ДНК является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. В микроорганизмах метилирование ДНК играет важную роль в контроле репликации ДНК, репарации, транскрипции, контроле клеточного цикла, а также бактериальной вирулентности. Распознавание своей и чужеродной ДНК ассоциировано с СРМ, функционирующими в качестве механизмов защиты от бактериофаговой инфекции.
У эукариот метилирование ДНК связано с такими биологическими процессами, как регуляция экспрессии генов, контроль эмбрионального развития, геномный импринтииг,
инактивация Х-хромосомы и стабильность генома. Уровень эпигенетического метилирования ДНК является важным фактором в патогенезе различных заболеваний человека. Учитывая высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей прокариотических и эукариотических МТ, использование бактериальных ферментов в качестве модельных объектов представляется важным для изучения механизмов и роли метилирования у млекопитающих.
Объектом исследований данной работы является СРМ типа II Eco29kI. Ферменты этой системы специфически узнают палиндромную последовательность 5'-CCGCGG-3'. Изучение биохимических свойств, механизмов действия ферментов СРМ и возможности образования на ее основе слитого бифункционального белка важно для понимания эволюции СРМ, функционирования клетки или отдельно взятой генетической системы.
Цели и задачи исследования: Целью данной работы является характеристика ферментов СРМ Eco29kI, конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и сравнительный анализ гибридного белка с его нативными предшественниками. Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
-
Сконструировать штаммы с увеличенным синтезом ЭР и МТ Eco29kI;
-
Получить высокоактивные гомогенные препараты белков и определить оптимальные условия каталитических реакций;
-
Локализовать метилируемый цитозин в сайте узнавания Есо29Ы;
-
Определить кинетический механизм МТ Eco29kI;
-
Сконструировать бифункциональный гибридный белок RM.Eco29kI, несущий нуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и определить его функциональные активности.
Научная новизна и практическая ценность работы: В данной работе разработаны методы очистки и определены оптимальные условия каталитических реакций ферментов СРМ Eco29kI, что делает возможным их применение в генной инженерии и биотехнологии. Локализован метилируемый цитозин в сайте узнавания Eco29kI: CCmeGCGG. Сайт метилирования охарактеризован впервые как для фермента M.Eco29kI, так и для его изошизомеров. Определен кинетический механизм действия МТ M.Eco29kI и установлены ее основные биохимические константы. Упорядоченный би-би механизм с использованием AdoMet в первую очередь, обнаруженный в случае М.Есо29Ы, более
характерен доя экзоциклических ДНК-метилтрансфераз и является новым для семейства m5C МТ.
Впервые сконструирован бифункциональный гибридный белок, обладающий эпдонуклеазнои и метилтрансферазной активностями СРМ Есо29И. Проведен сравнительный анализ функциональных активностей очищенного препарата гибридного белка с его нативными предшественниками. Показано, что слитый белок сохранил специфичность узнавания исходных ЭР и МТ. Выявлено, что удельная мегилтрансферазная активность почти не изменилась, составляя 80% активности исходного фермента M.Eco29kI, а удельная эндонуклеазная активность понизилась в три раза, что может быть связано с пространственными ограничениями для взаимодействия этой части нового белка с субстратами. Установлено, что оптимумы эпдонуклеазнои реакции гибридного белка RM.Eco29kI изменились по сравнению с исходной эндонуклеазой R.Eco29kI: оптимумы концентраций солей NaCl, KCI и рН среды сдвинулся в область более низких значений, а температурный оптимум остался прежним.
Полученные данные служат моделью образования бифункциональных ЭР типа НС и изменения функций существующих белков. Впервые предложено использование искусственного слияния генов, подобного описанному в данной работе, для конструирования бифункциональных белков, которые затем могут быть использованы для создания ферментов с новыми сайтами узнавания. Полученные в настоящей работе данные о свойствах ЭР и МТ Eco29kI расширяют знания о бактериальных СРМ.
Публикации и апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification (Bristol, 2004), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002) и ежегодной сессии Ученого совета ИБФМ РАН, посвященной подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 2010).
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает^!: источника. Работа содержит/*"рисунков и X таблицы.
