Введение к работе
Актуальность проблемы
Гепатит С (ГС) является одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всем мире, включая Россию. Это связано с широким распространением инфекции и частыми ее неблагоприятными исходами с развитием хронического гепатита, цирроза печени и гепатокарциномы. При отсутствии эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС предотвращение распространения инфекции явялется основной задачей в борьбе с данным заболеванием.
Одной из особенностей вируса ГС (ВГС) является его высокая генетическая вариабельность. Современная классификация включает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Simmonds Р., 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет решать задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозирования исходов заболевания и выработки тактики противовирусной терапии.
Известно, что генотипы 1, 2 и 3 наиболее распространены, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах. О распространнености различных генотипов и субтипов ВГС в отделышх регионах Россини до сих пор имеется небольшое количество сообщений. В этих работах было отмечено доминирование субтипа 16, которое сохраняется до настоящего времени согласно недавно опубликованным данным (Вязов СО. и др., 1996; Львов Д.К. и др., 1996, 1997; Мукомолов С.Л. и др., 1996; Viazov S. et ah, 1997; Кузин С.Н. и др., 1999; Shustov A. et al., 1999). В отношении распространения других субтипов вируса ГС в доступной литературе имеются ограниченные и весьма противоречивые сведения.
Несмотря на то, что определение генотипов ВГС помогает в решении ряда задач эпидемиологии, информация о конкретном геноварианте изолята ВГС не является абсолютным доказательством общности источника инфекции, конкретных путей распространения возбудителя, поскольку не несет сведений о генетических взаимоотношениях между различными вариантами ВГС. Такие материалы можно получить лишь при изучешш молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса.
Международный генетический банк EMBL (GeneBank) постоянно пополняется данными о нуклеотидных последовательностях различных участков генома новых изолятов ВГС, выделяемых в разных географических зонах. Эта информация позволяет уточнять принадлежность каждого изолята к конкретному субтипу и определять новые субтипы ВГС с помощью филогенетического анализа. Сравнение результатов генотипирования, выполненных на различных участках генома изолятов ВГС, до сих пор не выявило генетических рекомбинаций (Simmonds Р, 1999). В то же время, в некоторых исследованиях методом ПЦР с использованием типоспецифических праймеров было обнаружено в образцах сыворотки крови одновременное присутствие нескольких изолятов ВГС, принадлежавших к разным генотипам (Jarvis L. et al., 1994; Gournay J. et al., 1995; Sheng L. et al., 1995; Nishizono A. et al., 1997; Львов Д. и др., 1997; Тарасов К., 1998). Однако эти данные не были подтверждены при анализе нуклеотидных последовательностей (Viazov S. et al., 2000). Таким образом, вопросы о существовании смешанной инфекции, обусловленной одновременно несколькими гено/субтипами ВГС, и формирования новых генетических вариантов вируса за счет рекомбинации между геномами разных субтипов остаются неясными.
Количество публикаций, посвященных анализу нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГС, весьма ограничено (Васильев В.Б. и
др., 1994; Viazov S. ct al., 1997; Тарасов K.B., 1998), и лишь в одной из них был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов ВГС субтипа 16, который показал отсутствие тесных генетических взаимоотношений между российскими изолятами (Viazov S. et al., 1997).
Цель исследования: охарактеризовать варианты ВГС, циркулирующие в Санкт-Петербурге, и установить особенности их распространения среди различных групп населения города с помощью молекулярно-генетических методов.
Задачи исследования
Оценить эффективность использования праймеров из различных областей генома ВГС при выявлении РНК ВГС в образцах сыворотки крови методом обратно-транскриптазной и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
Провести генотипирование вариантов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге, с помощью анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков генома ВГС, амплифицированных в полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP).
Определить нуклеотидные последовательности фрагмента NS5B области генома изолятов ВГС различных генотипов методом лимитированного секвенирования.
Изучить особенности распространения и генетические взаимоотношения между изолятами ВГС различных субтипов, циркулирующих среди больных ГС и анти-ВГС-позитивных пациентов отделений гемодиализа, на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома.
Установить возможность смешанной инфекции, обусловленной различными вариантами возбудителя, а также генетической рекомбинации между изолятами, принадлежащими к разным субтипам ВГС.
Показать преимущества использования молекулярно-генетических методов при решении задач эпидемиологического надзора за вирусным гепатитом С.
Научная новизна
Впервые на основании лимитированного секвенирования участков генома и анализа нуклеотидных последовательностей изолятов изучена генетическая структура популяции ВГС на территории Санкт-Петербурга.
Получены новые данные о распространении субтипов 1а, 16, За среди различных категорий инфицированных лиц, включая пациентов из групп риска. Впервые в Санкт-Петербурге выявлены субтипы 2а, 2с и 4а.
У больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города, показано доминирование ВГС субтипа За. Впервые на основе филогенетического анализа ігуклеотидньїх последовательностей участка NS5B области генома, установлено, что в Санкт-Петербурге сформировались варианты ВГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских вариантов данного субтипа. У анти-ВГС позитивных пациентов отделений гемодиализа показано преобладание вариантов ВГС субтипа 16 и установлены пути их распространения. В одном из отделений гемодиализа выявлен «внутрибольничный» вариант данного субтипа.
На основе анализа нуклеотидных последовательностей получены убедительные доказательства смешашюй инфекции, обусловленной разными вариантами возбудителя, и возможности генетической рекомбинации между изолятами ВГС различных генотипов.
Впервые в России выявлены изоляты ВГС субтипа 2к, который был зарегестрирован в качестве нового субтипа генотипа 2 в международном банке данных (2000 г.) и ранее выявлялся только в Молдавии.
Практическое значение
Результаты работы свидетельствуют о необходимости внедрения молекулярно-енетических методов в эпидемиологический надзор за вирусным гепатитом С. В ходе [сследования был апробирован модифицированный метод PCR-RFLP, который может іьггь рекомендован для слежения за циркуляцией субтипов/генотипов ВГС среди іазличшлх категорий населения. Внедрение метода лимитированного секвенирования юзволит быстро проводить филогенетический анализ нуклеотидных юследоватсльностей генома изолятов ВГС для выявления возможных источников інфекции и факторов передачи с целью предотвращения дальнейшего распространения іозбудителя. Результаты работы включены в аналитический обзор «Вирусные гепатиты і Российской Федерации, вып.З», а также используются в учебном процессе в СПб ШИЭМ им. Пастера (1-й и 2-й учебные семинары для врачей-эпидемиологов Эпидемиология вирусных гепатитов и эпидемиологический надзор за этими тфекпиями в современный период», СПб, 1999, 2000). Полученные результаты іспользуются в работе кафедр и клиник инфекционных болезней Военно-медицинской .кадемии и Санкт-Петербургского медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.
Положения, выносимые на защиту
. В настоящее время в Санкт-Петербурге циркулируют 7 субтипов вируса ГС: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а. При этом субтип За доминирует у больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города. В то же время ВГС субтипа 16 продолжает оставаться наиболее распространенным у пациентов отделений хронического гемодиализа.
!. Наряду с разнообразными вариантами вируса ГС субтипа 16, встречающимися у больных ГС и родственными европейским и азиатским вариантам ВГС, в Санкт-Петербурге сформировались собственные варианты ВГС субтипа За, отличные от большинства европейских и азиатских вариантов данного субтипа. В отделениях хронического гемодиализа возможно формирование «внутригоспитального» варианта ВГС субтипа 16, отличающегося от вариантов этого субтипа, выявляемых у больных инфекционных стационаров.
і. При гепатите С существует смешанная инфекция, обусловленная несколькими субтипами вируса, а также возможна рекомбинация между геномами изолятов, принадлежащих к различным генотипам ВГС.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме (Эпидемиология и здравоохранение» (Ханой, 1995), 9-й Международном конгрессе по шфекционным болезням (Буэнос-Айрес, 2000), 10-м Международном симпозиуме по мрусным гепатитам и болезням печени (Атланта, 2000), 5-й Российской гастро-иггерологической неделе (Москва, 1999), 3-й и 4-й Российских научно-практических юнференциях «Гепатиты В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» Москва, 1999), на научно-практической конференции «Гепатит С» (Москва, 2000), на іаседаниях Санкт-Петербургского научного общества эпидемиологов и микробиологов ) 1999-2000 гг. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 150 страницах, содержит 12 таблиц и 21 рисунок, іключает введение, 7 глав (обзор литературы, материалы и методы, 4 главы результатов «следования, обсуждение и выводы), приложение и список литературы. Список штературы включает 197 работ отечественных и зарубежных авторов.
