Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с широким распространением цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) и связанной с ней патологией в акушерстве, неонатологии, педиатрии, клинической вирусологии, трансфузиологии и трансплантологии, проблема ЦМВИ приобретает большое значение в медицине.
Список заболеваний, связанных с цитомегаловирусом (ЦМВ) постоянно расширяется и включает в себя, в числе прочих, иммунодефицитные и онкологические заболевания.
ЦМВ таксономически относится к семейству Herpesviridae подсемейству Betaherpesvirinae роду Cytomegalovirus и широко распространен в человеческой популяции, передаваясь через кровь, слюну, мочу, фекалии, семенную жидкость, секрет шейки матки и через молоко кормящих женщин.
Инфицирование ЦМВ в большинстве случаев (80%) протекает
бессимптомно. Особенностью ЦМВИ является длительный период
инкубации и широкий клеточный тропизм. Активная продуктивная
форма ЦМВИ в лимфоцитах, фибробластах, клетках тканей слюнной
железы вызывает деструкцию клеток, морфологически определяемую
как цитомегалия. Деструкция иммунокомпетентных клеток (ИКК),
вызванная ЦМВ, может привести к вторичному иммунодефициту по Т-
клеточному типу. Снижение уровня интерферона, наблюдаемое при
ЦМВИ, ведет к повышению восприимчивости организма к вирусным,
бактериальным и грибковым инфекциям. В отличие от острой инфекции,
латентная форма обычно не проявляется четкими клиническими
симптомами и лишь иногда вызывает легкие гриппоподобные
заболевания.
Инфицирование беременных женщин ЦМВ может привести к тяжелым уродствам плода и мертворождению (1%). Врожденная ЦМВИ в большинстве случаев проявляется острой формой с поражением печени, головного мозга, костного мозга, развитием геморрагического синдрома, анемии, эритробластоза. При внутриутробном заражении ЦМВ генерализованная ЦМВИ может привести к развитию у ребёнка микроцефалии, двигательных расстройств, замедлению умственного развития и может заканчивается гибелью.
У взрослых людей ЦМВ может активироваться при иммуносупрессии, в том числе и у ВИЧ инфицированных пациентов (90%), вызывая у них генерализованную ЦМВИ. В последнее время было показано, что ЦМВ является причиной развития сиалоаденита (40%), мононуклеоза (20%) и, в единичных случаях, шока, вызванного
деструкцией надпочечников. Предполагается, что ЦМВ принимает участие в индукции некоторых онкологических заболеваний - в частности рака толстой и прямой кишки, а также аденокарциномы простаты.
Таким образом, молекулярно- биологические особенности вируса, его способность трансформировать клетки человека, тератогенность, способность к реактивации при иммуносупрессии и иммунодефицитных состояниях с последующим развитием генерализованной ЦМВИ, позволяют отнести ЦМВИ, в определенных условиях, к опасной для здоровья человека и ставят изучение ЦМВ, в разряд актуальных задач современной медицины и здравоохранения.
Изучение ЦМВИ обезьян, разновидности патологии вызываемой этим вирусом, его эпидемиология, филогенез ЦМВ позволяют предложить эту инфекцию обезьян как адекватную модель аналогичной патологии человека и в дальнейшем подойти к решению вопросов профилактики и, возможно, специфического лечения.
Целью настоящей работы являлось: мониторинг ЦМВИ обезьян и сотрудников НИИ Медицинской Приматологии; проведение сравнительного филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов; определение возможности межвидовой трансмиссии вируса.
Задачи исследования.
-
На основе выбранных консервативных участков нуклеотидных последовательностей подсемейства Betaherpesvirinae, разработать универсальную ПЦР тест-систему для качественного обнаружения ЦМВ приматов - обезьян разных видов и человека.
-
Провести ИФА и ПЦР для обнаружения антител и самого вируса в сыворотках крови и других биологических материалах (соскобы из глотки, ткани слюнных желез, урогенитальные соскобы и т.д.) собранных у обезьян разных видов и сотрудников ФГБУ НИИ МП РАМН для сравнительного определения распространения ЦМВ.
-
Провести амплификацию и секвенирование участков ДНК ЦМВ, выделенных от людей и разных видов обезьян, с целью проведения филогенетического анализа ЦМВ в отряде приматов.
-
Определить влияет ли наличие у обезьян других инфекций (на примере урогенитальных заболеваний) на частоту вирусоносительства ЦМВ.
-
Проверить возможность межвидовой передачи ЦМВ.
Научная новизна.
-
Впервые разработана универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae у приматов, включая человека.
-
Впервые проведена ПЦР детекция ЦМВ в разных биологических материалах у обезьян разных видов в сравнительном аспекте.
-
Впервые проведено секвенирование фрагментов последовательности гена UL56 ЦМВ у Масаса fascicularis, Papio hamadryas, Papio anubis, Macaca nemestrina.
-
Впервые проведен филогенетический анализ гена UL56 ЦМВ приматов.
-
Впервые проведён анализ взаимосвязи частоты выявления ЦМВ с наличием урогенитальных бактериальных инфекций у макаков резусов.
-
Впервые обнаружены последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки у людей и макаков резусов.
Теоретическая значимость работы
Филогенетический анализ ЦМВ в отряде приматов имеет большое теоретическое значение в понимании принципов эволюционной дивергенции генов цитомегаловирусов разных видов приматов.
Выявленные, в ходе диссертационной работы, последовательности вируса подобного ЦМВ зелёной мартышки у людей и макаков резусов позволяют сделать теоретически значимый вывод в возможной межвидовой передачи ЦМВ.
Практическая значимость работы
Разработанная универсальная тест система для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae приматов может быть использована для диагностики ЦМВ людей и обезьян разных видов. Примененный в работе подход разработки диагностической системы может быть использован для создания родоспецифических ПЦР тест-систем для других вирусных агентов.
Проведённый скрининг ЦМВИ у обезьян разных видов Адлерского
питомника методом ПЦР позволил установить степень
распространенности вируса у разных видов приматов. Филогенетический анализ ЦМВ с использованием данных секвенирования фрагментов консервативных участков рої и UL56 генов ЦМВ, позволил определить степень родства между цитомегаловирусами разных видов приматов.
Полученные результаты могут быть использованы при постановке модельных экспериментов, связанных с изучением ЦМВ.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработанная ПЦР тест-система является универсальной для определения ЦМВ у разных видов приматов включая человека.
-
Частота обнаружения ЦМВ методом ПЦР зависит от вида исследуемого биологического материала (кровь, соскобы из глотки, ткани слюнных желёз и т.д.)
-
Филогенез участка гена UL56 ЦМВ приматов даёт полную информацию о степени родства вирусов разных видов обезьян.
-
При наличии урогенитальных инфекций у обезьян, частота вирусоносительства ЦМВ возрастает.
6. Последовательности вируса подобного ЦМВ зеленной мартышки обнаруживаются у людей и макаков резусов.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования диссертационной работы внедрены в практику лаборатории молекулярной биологии ФГБУ НИИ МП РАМН. Разработанная тест-система для ПЦР детекции betaherpesvirinae приматов используется для мониторинга ЦМВИ обезьян адлерского питомника.
Апробация работы.
Апробация диссертационной работы проведена на заседании учёного совета ФБГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН 2 декабря 2011 г.
Результаты исследования доложены на всероссийской научной
конференции «Перспективные направления использования
лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи-Адлер, 8-Ю августа 2006г.)
Личный вклад автора
Автор участвовал в наборе биологического материала у людей и обезьян разных видов Адлерского Питомника. Автором разработаны праймеры к консервативному участку Betaherpesvirinae, а так же проведён филогенетический анализ сиквенсов полученных в ПЦР с помощью молекулярно-билогических компьютерных программ. Вклад автора в разработку ПЦР тест-системы для качественного определения подсемейства Betaherpesvirinae приматов является определяющим. Автором проанализированы результаты исследований и проведена статистическая обработка полученных данных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 4 статьи в журналах, включённых в перечень ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 104 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 161 источник.
