Введение к работе
Актуальность проблемы
Эпидемиологическая и социальная значимость краснухи обусловлена повсеместным распространением инфекции и тератогенным действием вируса -способностью формировать врожденные дефекты развития, приводящие к инвалидности или смертельному исходу у новорожденных (Зверев В.В., 2004; Frey et al., 2009). Согласно стратегическому плану Европейского региона ВОЗ, по ликвидации кори и предупреждению врожденной краснушной инфекции в регионе, к 2010 году Россия должна была войти в число стран с уровнем заболеваемости краснухой <1 на 1 000000 населения и уровнем заболеваемости СВК <1 на 100 000 живых новорожденных детей. К январю 2009 года >95% детей в среднем по каждой стране должны быть вакцинированы минимум одной дозой краснушной вакцины. К концу 2010 года почти 1 миллион детей, проживающих в странах Европейского региона, не был иммунизирован в соответствии с данной программой, в связи с этим ВОЗ пересмотрела сроки ликвидации кори, краснухи и малярии в регионе и определила для этой цели 2015 год (WHO, 2010).
В России до конца 90-х годов краснуха оставалась неуправляемой инфекцией и за исключением гриппа и ОРВИ занимала 1-2 место среди инфекций, передающихся воздушно-капельным путем (Зуева Л.П., Яфаев Р.Х, 2005).
Широкомасштабная вакцинация, проводимая в России с 2001 года в рамках национального плана по борьбе с краснухой, привела к значительному снижению уровня заболеваемости (Лаврентьева И.Н., Семериков В.В.и др., 2008). Однако среди заболевших краснухой наметилась опасная тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста (Онищенко Г.Г., 2010). Ситуация осложняется за счет увеличения числа мигрантов, иммунизация которых представляет определенные трудности. Ежегодно регистрируемые вспышки заболевания по-прежнему определяют высокую вероятность развития синдрома врожденной краснухи (СВК) у новорожденных.
Эффективный эпидемиологический надзор и контроль над краснушной инфекцией определяется несколькими важными факторами, в том числе своевременной и качественной диагностикой краснухи, анализом популяционного иммунитета к краснухе, молекулярно-эпидемиологическими исследованиями возбудителя.
Современные диагностические методы, основанные на выявлении генетического материала вируса, позволяют решать задачи ранней диагностики краснушной инфекции, особенно в случаях, требующих дифференциально-диагностического поиска (Haas at al., 2005; Sanz at al., 2010). Анализ состояния популяционного иммунитета к вирусу краснухи, проводимый по результатам серологических исследований, позволяет оценивать эффективность вакцинопрофилактики и выявлять лиц с минимальным уровнем защиты от инфекции, что особенно важно для беременных женщин и детей (Sanz at al., 2010).
Важным аспектом эпидемиологического надзора и контроля над краснухой является изучение молекулярно-генетических свойств вирусов, циркулирующих в различных регионах и их филогенетический анализ. В рамках программ надзора и ликвидации краснухи с 2004 года, получены генетические характеристики 100 новых штаммов вируса краснухи, что позволило обновить информацию о классификации вирусов, выделить референс-штаммы (WHO, 2007). В настоящее время, обновленная номенклатура описывает 13 генотипов дикого типа вируса краснухи: основные генотипы 1В, 1С, ID, IE, IF, IG, IH, 2A, 2B, 2C и условные генотипы la, li, и lj (Abemathy at al., 2011).
При этом, Россия была определена экспертами ВОЗ как территория с эндемичным распространением вирусов краснухи генотипа 2с (по новой классификации 2С) (WHO Rubella Nomenclature Report, 2005). По последним данным на территории России циркулируют вирусы краснухи разных генотипов: в Сибири вирусы, относящиеся к генотипу IE и 1Н, в Москве IF, 1G и 1Н (Серегин и др., 2011; Тюнников и др., 2007). Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира (Десятскова, 1974., Зверев и др. 2002), изменения в составе генома вируса под действием коллективного иммунитета создают предпосылки возникновения новых вариантов вируса (Лаврентьева и др., 2008; Онищенко и др., 2008). Изучение генетической вариабельности циркулирующих штаммов вируса краснухи в условиях массовой вакцинации позволяет проследить пути передачи и направление изменчивости вирусов под влиянием социальных и биологических факторов. Кроме того, молекулярно-генетический анализ изолятов вируса краснухи дает возможность классифицировать случаи инфекции как эндогенные или завозные и корректировать профилактические и противоэпидемические мероприятия. Цель исследования. Дать характеристику биологических и молекулярно-генетических свойств вирусов краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге, провести сравнительную оценку современных методов диагностики краснушной инфекции. Задачи исследования
-
Провести анализ заболеваемости краснухой детского и взрослого населения Санкт-Петербурга в период с 1995 по 2010 гг.
-
Изучить популяционный иммунитет к краснухе населения мегаполиса в условиях массовой вакцинации детей и подростков.
-
Дать сравнительную оценку эффективности современных серологических и молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики краснушной инфекции.
-
Обосновать выбор оптимальных иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи и изучения популяционного иммунитета.
-
Охарактеризовать биологические свойства штаммов вируса краснухи, изолированных в Санкт-Петербурге, на модели инфекции in vitro.
-
Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ изолятов.
Научная новизна работы
Впервые исследованы показатели заболеваемости краснухой и популяционный иммунитет населения мегаполиса в условиях массовой иммунизации против краснушной инфекции. Впервые дана молекулярно-генетическая характеристика вирусов краснухи, выделенных в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербург), что расширяет представления о молекулярной эпидемиологии данного возбудителя. В результате масштабных исследований дана сравнительная оценка иммуноферментных тест-систем, мотивирован выбор оптимальной тест-системы. Сопоставлена диагностическая значимость серологических (ИФА) и молекулярно-генетических (ПЦР) методов идентификации краснушной инфекции. Практическая значимость работы
Из клинических образцов больных краснухой были выделены 22 штамма вируса краснухи (SPb-l/Russia/2007-SPb-22/Russia/2007), которые были депонированы в Музей вирусов НИИ гриппа. Полученные последовательности гена Е1 вирусов краснухи RVs/SPb-13/7/Russia/2007, RVs/SPb-16/8/Russia/2007 депонированы в Международную базу данных GenBank (коды доступа JQ036235, JQ036236).
Определен генотип вирусов краснухи, циркулирующих в Санкт-Петербурге, что позволяет определять характер (эндемичный или завозной) случаев краснухи и организовывать адекватные противоэпидемические мероприятия. Обоснованы преимущества российских тест-систем «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» и «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» (производство ЗАО «ЭКОлаб», Россия) по сравнению с другими диагностическими тест-системами российского производства. Показано их соответствие по чувствительности и специфичности референс-системам производства США. Полученные данные направлены на совершенствование эпидемиологического надзора и контроля над краснухой на территории Российской Федерации. Основные положения, выносимые на защиту
-
Реализация программ вакцинации против краснухи в рамках национального календаря прививок и национального проекта «Здоровье» создала предпосылки для снижения уровня заболеваемости краснухой и случаев СВК до показателя <1 на 1 000 000 населения, что соответствует задачам, поставленным в Программе ВОЗ.
-
В результате 5-ти летней массовой иммунизации против краснухи детей и подростков значительно вырос уровень популяционного иммунитета - 96,3% обследованных контингентов были серопозитивны. Среди серонегативных лиц мужчины старше 15 лет встречались в 5 раз чаще, чем женщины.
-
Метод ОТ-ПЦР при обследовании больных в первые дни заболевания (1 -3 день) является наиболее информативным. Начиная с 4-го дня заболевания, увеличивается диагностическая значимость иммуноферментного анализа. Российские иммуноферментные тест-системы «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» и «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» имели преимущества перед другими тест-системами российского производства при диагностике краснухи и оценке популяционного иммунитета.
-
Вирусы краснухи, изолированные в Санкт-Петербурге в 2007 году, относились к IE генотипу и имели 97,7% гомологии к изолятам из Минска и 99,0 - 99,6% гомологии к изоляту из Барнаула.
-
На модели краснушной инфекции in vitro показана динамика клеточного морфогенеза, вызванного вновь изолированными вирусами и формирование репликативных комплексов и оболочек вирионов вирусов краснухи.
-
На фоне массовой вакцинации против краснухи в России отмечено исчезновение эндемичного вируса генотипа 2С и появление штаммов вируса краснухи генотипов IE, 1Н, и 1G.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Молекулярно-генетические исследования клинических образцов и выделенных штаммов вируса краснухи (ПНР, секвенирование) и компьютерная обработка данных проведены лично автором. Вклад соавторов заключается в выделении вирусов краснухи на культурах клеток, тестировании сывороток крови серологическими методами, проведении электронно-микроскопических исследований. Работа выполнена в рамках Проекта МНТЦ «Совершенствование и стандартизация лабораторных и эпидемиологических методов надзора за краснухой в Российской Федерации» (№ 3373). Апробация материалов диссертации
Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» Алматы, 2008 г.; Российско-итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций», Петрозаводск, 2008 г.; представлены на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, 2009 г.; на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» Москва 2010. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 21 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 8 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 197 источников на русском и английском языках.
