Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1. Оксилипины как биологически активные соединения 22
1.2. Метаболизм оксилипинов 27
1.3. Общая характеристика липоксигеназ 30
1.4. Специфичность действия липоксигеназ 32
1.5. Модели специфичности действия липоксигеназ 39
1.6. Третичная структура липоксигеназ 43
1.7. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3) 48
1.8. Общая характеристика ферментов Р450 49
1.9. Общая характеристика ферментов семейства CYP74
1.10. Структурная организация ферментов семейства СYP74 55
1.11. Алленоксидсинтазы 59
1.12. Гидропероксидлиазы 63
1.13. Дивинилэфирсинтазы 66
1.14. Эпоксиалкогольсинтазы 68
1.15. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP74
и монооксигеназ Р450 69
1.16. Локализация ферментов CYP74 79
1.17. Регуляция экспрессии генов ферментов липоксигеназного каскада 81
1.18. Молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада 85
1.18.1. Общие представления о молекулярной эволюции 85
1.18.2. Классификация и молекулярная филогения липоксигеназ 91
1.18.3. Классификация цитохромов семейства CYP74 95
1.18.4. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений з
1.18.5. Молекулярная филогения ферментов CYP74 98
1.19. Постановка цели
исследования 107
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 115
2.1. Методы биоинформатики 115
2.2. Подготовка растительного материала 117
2.3. Выделение тотальной РНК из листьев растений 118
2.4. Реакция обратной транскрипции и получение двуцепочечной кДНК 118
2.5. Полимеразная цепная реакция 119
2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле 119
2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 120
2.8. Молекулярное клонирование ДНК
2.8.1. Характеристика бактериальных штаммов 121
2.8.2. Среды для культивирования бактерий 123
2.8.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli 123
2.8.4. Перенос плазмид в компетентные клетки Е. coli 124
2.8.5. Клонирование ПЦР-фрагментов 125
2.8.6. Клонирование полноразмерных кДНК 125
2.8.7. Клонирование целевых генов в экспрессирующие векторы 127
2.9. Сайт-направленный мутагенез клонированных генов 130
2.10. Наработка и очистка рекомбинантных белков 132
2.10.1. Выращивание культур продуцентов и индукция синтеза
рекомбинантных белков 132
2.10.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном
геле 133
2.10.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков 134
2.11. Реактивы и материалы для исследований катализа
рекомбинантных ферментов 136
2.12. Получение препаратов из растительного материала и подготовка
субстратов 137
2.12.1. Получение препаратов ацетонового порошка семян 137
2.12.2. Получение препаратов свободных жирных кислот 137
2.12.3. Получение препаратов гидроперекисей жирных кислот 138
2.13. Кинетические исследования реакций липоксигеназного каскада 139
2.14. Анализ продуктов реакций липоксигеназного каскада методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 140
2.14.1. Хроматография на обращенной фазе 140
2.14.2. Хроматография на нормальной фазе 140
2.15. Спектральные исследования 141
2.15.1. Подготовка образцов для ГХ-МС 141
2.15.2. Проведение экспериментов по ГХ-МС 141
2.15.3. Получение спектров оптического поглощения 142
2.15.4. Получение ЯМР-спектров 142
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 143
3.1. Получение рекомбинантного фермента ZmLOX3 143
3.1.1. Экспрессия ZmLOX3 в бактериальном продуценте 143
3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента ZmLOX3 144
3.2. Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOXl 148
3.3. Участие (78)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути 151
3.4. Направленная модификация первичной структуры ZmLOX3
3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOX3 154
3.4.2. Окисление линолевой кислоты мутантными формами ZmLOX3 156
3.4.3. Окисление сложных липидов ZmLOX3 и ZmLOX3Ala562Gly 159
3.5. Моделирование механизма ферментативного действия ZmLOX3 162
3.5.1. Трехмерная модель ZmLOX3 162
3.5.2. Модели позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ 164
3.6. Клонирование гена алленоксидсинтазы томата LeAOS3 171
3.7. Получение очищенного рекомбинантного фермента Le АО S3 173
3.8. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3 174
3.9. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты 181
3.10. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона 182
3.11. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3 184
3.12. Характеристика специфичности действия LeAOS3 (CYP74C)
и алленоксидсинтазы кукурузы ZmAOS (CYP74A) 186
3.13. Превращение окиси алленаЬеАОБЗ in situ 188
3.14. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой LeAOS3 190
3.15. Исследование доменов LeAOS3 и гидроперксидлиазы люцерны MtHPL методом сайт-направленного мутагенеза 194
3.15.1. Определение домена IHCD в первичной структуре ферментов CYP74 194
3.15.2. Выбор позиций и аминокислотных замен в полипептидной 4ennLeAOS3 199
3.15.3. Анализ продуктов катализа мутантных форм LeAOS3 201
3.15.4. Выбор сайтов и аминокислотных замен в полипептидной цепи MtHPL 207
3.15.5. Сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL 208
3.16. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца 214
3.17. Выявление и клонирование кДНК CYP74B16 218
3.18. Получение препарата рекомбинантного белка CYP74B16 224
3.19. Идентификация фермента СYP74B16 225
3.20. Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых LuDES 231
3.21. Сравнение LuDES с другими членами подсемейства CYP74B 235
3.22. Направленная модификация первичной структуры LuDES 238
3.23. Каталитические свойства LuDES E292G 240
3.24. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада
3.24.1. Филогенетический анализ липоксигеназ 250
3.24.2. Филогенетический анализ цитохромов CYP74 254
Заключение 276
Выводы 288
Список литературы
- Специфичность действия липоксигеназ
- Выделение тотальной РНК из листьев растений
- Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOXl
- Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых LuDES
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений - оксилипинов. У высших растений ок-силипины отвечают за регуляцию роста, морфогенез, участвуют в формировании системной устойчивости к экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2002]. Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у бактерий, бурых и красных водорослей, кораллов, хордовых и пластинчатых [Lee et al., 2008].
Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада являются липоксигеназы и ци-тохромы семейства CYP74 суперсемейства Р450. В зависимости от региоспецифичности действия липоксигеназы растений в основном разделяют на 9- и 13-специфичные, а также обладающие дуалистичными свойствами. Продукты липоксигеназной реакции - гидроперекиси жирных кислот - преобразуются при участии ферментов CYP74: алленоксидсин-таз (АОС), гидропероксидлиаз (ГПЛ), дивинилэфирсинтаз (ДЭС). Алленоксидсинтазы и дивинилэфирсинтазы являются дегидразами, в то время как гидропероксидлиазы - изо-меразами. Разнообразие генов семейства CYP74 в геномах различных организмов предполагает и другие типы катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, а также несколько ДЭС разных видов растений. Существует мнение, что ферменты последнего класса не имеют широкого распространения в природе.
Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в агропромышленном производстве и биотехнологии. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование их молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.
Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, существенно расширил представления о механизмах ферментативного катализа. Во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов CYP74 остается недостаточно охарактеризованным. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным.
Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ позволяет предположить их возникновение до цитохромов. Однако отсутствие функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в уже существующий метаболический процесс, в котором поступление данного субстрата происходило в результате неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.
Филогения и систематика ферментов CYP74 до сих пор остается на стадии разработки. Использование стандартных алгоритмов классификации приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. Некоторые типичные представители CYP74 по биохимическим характеристикам не удовлетворяют принятым критериям принадлежности к семейству, в связи с чем их предложено включить в одноименный «клан» [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, связанной с их выходом на сушу. Однако открытия липоксигеназного каскада у животных, бурых водорослей и прокариот, свидетельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.
Данные противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов CYP74. Так, у классического объекта - льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с которого началось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины - необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные - линолипины [Chechetkin et al., 2008]. Однако фермент, ответственный за синтез дивиниловых эфиров, до настоящего времени оставался неизученным.
Выяснение эволюционных процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представляют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновременной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях первичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогенетической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигена-зы ZmLOX3 кукурузы (Zea mays).
-
Получение мутантных форм ZmLOX3; сравнение реакций превращения ли-нолевой кислоты и других субстратов при участии фермента дикого типа и его мутантных форм.
3. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и липоксигеназы GmLOXl
сои (Glycine max) с субстратами на основании экспериментальных данных и компью
терного моделирования.
-
Выявление особенностей механизма катализа рекомбинантной алленоксид-синтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum) в сравнении с алленок-сидсинтазами подсемейства CYP74A.
-
Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез ((о5.)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.); получение рекомбинантного фермента, его структурно-функциональная характеристика.
-
Получение мутантных форм LeAOS3 и фермента, ответственного за биосинтез (ю57)-этероленовой кислоты у льна-долгунца {Linum usitatissimum L.), с модификациями каталитически важных доменов. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.
7. Получение мутантных форм гидропероксидлиазы MtHPL люцерны
(Medicago truncatula); сравнение особенностей каталитического действия фермента
дикого типа и его мутантных форм.
-
Проведение эволюционного анализа генетической информации, накопленной в отношении ферментов липоксигеназного каскада.
-
Построение филогенетических моделей, отражающих молекулярную эволюцию ферментов липоксигеназного каскада высших растений и их таксономическое положение.
Научная новизна работы. На основании экспериментальных данных и результатов компьютерного моделирования определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (9S)- и (135)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOXl, соответственно). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре GmLOXl и ZmLOX3 различается, однако в обоих случаях субстрат погружается в активный центр метильной концевой группой; инверсии субстрата под действием внешних факторов не происходит. Специфичность действия ZmLOX3 не определяется ориентацией субстрата в активном центре, а детерминируется объемом активного центра, его пространственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа.
Выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены получена мутантная форма ZmLOX3 с измененной региоспецифичностью.
Впервые показано, что алленоксидсинтаза LeAOS3 подсемейства CYP74C цитохро-мов Р450 является многофункциональным ферментом и катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Показано, что продуктами LeAOS3 являются (95)-а-кетол и рацемическая смесь z/иоІО-оксо-П-фитоеновой кислоты.
Выявлен ген дивинилэфирсинтазы LuDES льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), клонирована его открытая рамка считывания. LuDES идентифицирована как первый фермент подсемейства CYP74B, гомологичный 13-гидропероксидлиазам, входящим в состав данного подсемейства, и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой. На сегодняшний день LuDES является единственной известной 13-гидропероксид-специфичной дивинилэфирсинтазой.
Проведен сравнительный анализ первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и представителей семейства CYP74; выявлены гипотетические детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих консервативные последовательности у ферментов с разным типом катализа - алленоксидсинтаз, гидропе-роксидлиаз и дивинилэфирсинтаз. Смоделированы модификации первичной структуры алленоксидсинтазы LeAOS3 томата, гидропероксидлиазы MtHPL люцерны, дивинилэфирсинтазы LuDES льна; проведен сайт-направленный мутагенез соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм ферментов. Впервые показано изменение механизмов каталитического действия ферментов семейства CYP74 в результате замены аминокислотных остатков, находящихся вблизи гема. Получены мутантные формы алленоксидсинтазы LeAOS3, обладающие гидропероксидлиазной активностью, что означает конверсию дегидразного типа реакции в изомеразный. Впервые дивинилэ-фирсинтаза LuDES превращена в алленоксидсинтазу, которая катализирует преобразование 13-гидроперекиси а-линоленовой кислоты в 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту и а-кетол. Проведенные превращения ферментов CYP74 могут служить подтверждением дивергенции генов CYP74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Липоксигеназа ZmLOX3 кукурузы проявляет (^^-специфичность при окислении линолевой кислоты в нейтральных и щелочных условиях в диапазоне рН 6,5-9,5. Анализ моделей взаимодействия липоксигеназ с субстратами показал, что для ZmLOX3 характерен единственный способ позиционирования субстрата в активном центре, обусловленный проникновением жирной кислоты в субстрат-связывающий карман метильной концевой группой. Аминокислотный остаток А1а562, расположенный в активном центре ZmLOX3, важен для проявления региоспецифичности действия; замена аланина на меньший по размерам глицин приводит к частичному проявлению (13і?)-региоспецифичности.
-
Специфичность действия липоксигеназ высших растений не обнаруживает строгой взаимосвязи с общей первичной структурой, что характерно для липоксигеназ животных, грибов и прокариот.
-
13-специфичные липоксигеназы являются анцесторной группой по отношению к 9-специфичным липоксигеназам, которые образовались монофилетически до дивергенции однодольных и двудольных растений.
-
В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C, является многофункциональным. LeAOS3 катализирует
синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Первичный продукт LeAOS3, окись аллена, после высвобождения из активного центра захватывается тем же ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно - стереоспецифический гидролиз с образованием (9і?)-а-кетола и циклизацию с образованием рацемической z/иоІО-оксо-П-фитоеновой кислоты.
-
Фермент LuDES льна является единственной дивинилэфирсинтазой, классифицируемой по общей первичной структуре как член подсемейства CYP74B цитохромов Р450, до сих пор включавшего только 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна обладает строгой 13-региоспецифичностью к субстрату; предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты, основным продуктом является (а)5^-этероленовая кислота.
-
В формировании определенного типа катализа ферментов семейства CYP74 принципиальная роль принадлежит центральному домену 1-спирали и ERR-триаде.
-
Все ферменты семейства CYP74 относятся к одной близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Семейство CYP74 сформировалось на ранних этапах эволюции цитохромов Р450 до дивергенции эу-кариот от последнего общего предка. Предковая форма ферментов CYP74 высших растений дала начало трем большим группам. Первая включала 13-ГПЛ, вторая - 13-АОС, третья - 9/13-АОС, 9-АОС и 9/13-ГПЛ. Дивинилэфирсинтазы являются эволюционно наиболее молодыми ферментами, имеющими полифилетическое происхождение, не завершившееся формированием таксономически обособленных единиц. Субстратная специфичность наряду с типом катализируемой реакции является существенным таксономическим признаком представителей семейства CYP74; дивинилэфирсинтазы связаны с родственными группами общей субстратной специфичностью.
Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов липоксигеназной сигнальной системы - оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, а также в формировании ответа на стрессовые факторы. Многие оксилипины являются физиологически активными, бактерицидными соединениями.
В экономическом аспекте актуальными являются исследования липоксигеназного каскада масличных, зерновых и технических культур, а также лекарственных растений. Оксилипины во многом определяют ценные технологические, органолептические и лечебные свойства растений, которые могут быть востребованы в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.
Разработаны системы получения и препаративной очистки липоксигеназ и цитохромов растений, способные найти применение в промышленности. Ферменты с измененными каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохо-
зяйственного производства, и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.
Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в биоинженерии. Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2004 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. per. №: 01200901959). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, 09-04-12222-офим, программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантом ведущей научной школы НШ № 6992.2010.4, Федеральной целевой программой «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров» (ГК № 14.740.11.0797 от 30.10.2010). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (Солт-Лейк-Сити, США, 2007); на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Вальядолид, Испания,2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Лозанна, Швейцария, 2009); на 35-ом и 36-ом конгрессах FEBS (Прага, Чешская республика, 2009; Турин, Италия, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); на 4-ом Съезде ЕМВО (Ницца, Франция, 2012); на 18-ой Международной конференции «Цитохромы Р450: биохимия, биофизика и биотехнология» (Сиэтл, США, 2013); на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2006-2013 гг.).
Публикации. По результатам работы опубликовано семь статей в отечественных и семь в зарубежных рецензируемых изданиях. По докладам на научных мероприятиях опубликовано 50 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 345 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В работе представлено 13 таблиц и 92 рисунка. Список литературы включает 395 источников.
Специфичность действия липоксигеназ
Оксилипины относятся к вторичным метаболитам, наиболее характерным для высших растений {Streptophytd). У растений оксилипины составляют обширную и разнообразную группу биологически активных компонентов, продуцируемых в результате окислительного метаболизма полиненасыщенных жирных кислот [Mosblech et al, 2009]. Эта группа включает гидроперокси-, гидрокси-, оксо- и эпоксижирные кислоты, дивиниловые эфиры, летучие альдегиды (рис. 1) [Gobel, Feussner, 2009; Andreou et al, 2009a]. Структурное разнообразие оксилипинов увеличивается за счет этерификации с глицеролипидами и конъюгации с аминокислотами и другими метаболитами, такими как глутатион, этаноламин и различные углеводы [Mosblech et ai, 2009]. В ходе эволюции оксилипины приобрели биологические функции в качестве вторичных посредников и защитных метаболитов [Gullner et ai, 2010]. Например, жасмоновая кислота обеспечивает индукцию защитных реакций на атаку фитопатогенных микроорганизмов; С6-и Сд альдегиды являются сигналами взаимодействия растения с насекомыми; С о- и со-оксокислоты участвуют в заживлении ран; дивиниловые эфиры подавляют рост мицелия и прорастание спор некоторых видов оомицетов [Kallenbach et al, 2011].
Раневой стресс, патогенные инфекции, или обработка элиситорами заметно увеличивают концентрацию ряда оксилипинов в растительных тканях, что позволяет провести их идентификацию и характеристику [Gullner et al, 2010]. Инфицирование арабидопсиса {Arabidopsis thaliand) патогенным грибом Verticillium longisporum вызывает увеличение количества жасмоновой, 12-оксофитодиеновой, динор-оксофитодиеновой, 9,12,13-тригидрокси-10,15-октадекадиеновой и 9,12,13-тригидрокси-10-октодеканоидной кислот, которые, являются частью иммунного ответа растения [Floerl et al., 2012].
К числу распространенных физиологически активных растительных оксилипинов относятся (2)-додецен-1,12-дикарбоксиловая (травматиновая) кислота и 12-оксо-(10іГ)-додеценовая кислота (травматин), идентифицируемые ранее как раневые гормоны. Они способны индуцировать деление клеток и образование каллуса в местах повреждения растения [Тарчевский, 2001]. Также отмечается их участие в стресс-специфичном изменении экспрессии генов [Kallenbach et al, 2011]. Еще одно близкое к ним по структуре соединение - 12 24 гидрокси-(92)-додеценовая кислота - было идентифицировано в экспериментах in vitro с проростками гороха. Внесение данного соединения к культуре клеток каллуса вызывало прирост его биомассы до 400 % по сравнению с контролем [Тарчевский, 2001].
Нарушение целостности растительных тканей приводит к высвобождению летучих соединений, имеющих специфический аромат, «запах свежескошенной травы», обусловленный С6- и Сд-соединениями [Hughes et ah, 2009]. Гексенали и гексенолы, относящиеся к Сб-соединениям, являются одними из наиболее важных антимикробных и фунгицидных агентов, обеспечивающих первичную химическую защиту раневой поверхности растения от атаки патогенов [Mohamed, Pare, 2002]. Инфицирование растений табака грибом Golovinomyces cichoracearum, вызывающим мучнистую росу, приводит к увеличению количества 2()-гексеналя, ослабляющего развитие инфекционного процесса [Quaglia et ah, 2012]. При фитопатогенезе растений томата (Solatium Lycopersicum), вызванном Botrytis cinerea («серая гниль»), происходит высвобождение (3Z)- и (2іГ)-гексеналей, 3(2)-гексенола, 1-пенден-3-ола и (32)-гексенилацетата, которые подавляют дальнейшее развитие грибковой инфекции [Copolovici et ah, 2012]. Группа летучих Отсоединений -(2)-ноненаль и (32)-ноненаль - обусловливают «запах огуречной свежести» [Тарчевский, 2002]. Выделение этих соединений связано с механическим повреждением растений [Stumpe et ah, 2006] и действием на них патогенов [Huang, Schwab, 2011].
Обширное семейство биологически активных оксилипинов образовано производными жасмоновой кислоты [Delporte et ah, 2011]. Структурной особенностью данных соединений, важной для их биологической активности, является наличие плоского пятичленного кольца, пентениловой боковой цепи, находящейся в Су-положении, а также кетогруппы в С3-положении (рис. 1) [Piotrowska, Bajguz, 2011].
Жасмонаты у растений участвуют в регуляции прорастания семян, развития пыльцы, формирования клубней, синтеза этилена, старения растения [Ballare, 2011; Piotrowska, Bajguz, 2011]. Жасмоновая кислота отвечает за передачу сигналов в ответ на биотические и абиотические стрессоры [Piotrowska et al., 2009] и совместно с этиленом отвечает за формирование системного ответа [Van der Ent et al., 2009]. Жасмоновая кислота и метилжасмонаты влияют на уровень концентрации витамина С, наиболее распространенного антиоксиданта в растениях [Suza et al., 2010].
Жасмонаты были обнаружены во всех частях растения; наибольшая их концентрация встречается в растущих тканях, таких как верхушки побегов, кончики корней, незрелые плоды и молодые листья [Piotrowska et al., 2009]. Показано, что жасмонаты могут образовывать сопряженные соединения с глюкозой и аминокислотами [Tamogami et al., 2008], что используется для транспортировки и хранения этих соединений [Piotrowska et al., 2009].
Центральное место в регуляции стрессовых ответов занимают пластиды. В этих органеллах находится ряд ферментов, участвующих в биогенезе внутри-и внеклеточных сигналов, в том числе оксилипинов (например, жасмоновой кислоты и летучих Сб-соединений), терпеноидов и фенольных соединений [Bonaventure, Baldwin, 2010]. При повреждении растительной ткани в хлоропластах в течение нескольких секунд производятся химические сигналы, активирующие как системный, так и локальный иммунный ответ (рис. 2). Центральное место в этом процессе отводится оксилипинам. Высвобождение 18:2 и 18:3 жирных кислот приводит к быстрому накоплению (2)- и (3Z)-гексеналей, жасмоновой кислоты и различных С -фитонцидов [Bonaventure, Baldwin, 2010].
Таким образом, оксилипины у растений играют ключевую роль в качестве сигнальных и защитных соединений, участвуя в процессах развития и формировании ответа на стрессовые факторы, что позволило выделить липоксигеназный каскад в качестве самостоятельной сигнальной системы [Тарчевский, 2001]. Функционально и по особенностям биосинтеза оксилипины имеют аналоги среди эйкозаноидного семейства липидных регуляторов позвоночных [Itoh, Howe, 2001]. И в том и другом случае регуляторные систе
Выделение тотальной РНК из листьев растений
Одной из ключевых задач молекулярной эволюции служит установление законов изменения наследственной информации в живых системах, изучение частоты и других характеристик эволюционных изменений в макромолекулах -нуклеиновых кислотах и белках, а также механизмов и причин, определяющих эти изменения. Другим направлением является изучение истории жизни. В общем случае реконструкция эволюционной истории основана на том принципе, что изменения в определенных локусах генов и межгенных спейсерах происходят во времени с некоторой частотой. Этот принцип известен как концепция молекулярных часов. Совокупность отличий двух гомологичных (имеющих общее эволюционное происхождение, общего предка) нуклеотидных или аминокислотных последовательностей характеризует эволюционную дистанцию между ними. Экспериментально показано, что кроме факторов естественного отбора, случайные, стохастические процессы в значительной степени определяют судьбу мутаций. В связи с этим, при расчете эволюционной дистанции используется математический аппарат, описывающий случайные процессы [Felsenstein, 1985]. На практике такой расчет представляет собой сложную задачу. Совершенные эволюционные модели должны учитывать разную частоту изменений в консервативных и вариабельных областях генов и соответствующих полипептидов, множественные замены нуклеотидов (аминокислот), в том числе реверсии, значимость изменений с точки зрения функциональных последствий, влияющих на приспособленность организма, влияние рекомбинационных событий, вероятность горизонтального переноса генетической информации. Кроме того, следует учитывать не только замены, но также вставки, дупликации и делеции [Posada, Crandall, 2001].
Идентификация вставок и делеций, имевших место в их эволюционной истории - выравнивание последовательностей, является первым этапом филогенетического анализа группы последовательностей. Эта процедура необходима для того, чтобы установить гомологичные позиции анализируемых последовательностей. После выравнивания последовательностей проводится оценка числа и качества различий между ними, расчет эволюционных дистанций [Лукашов, 2009].
Выравнивание последовательностей может быть осуществлено с учетом имеющихся замен или проведено путем введения инсерций/делеций (инделов). В решении задачи минимизации числа эволюционных событий минимизация числа замен и числа/длины пробелов находятся в противоречии друг с другом. Подходом к решению этой задачи является введение системы положительных и отрицательных оценок (scores), присваиваемых различным эволюционным событиям. Как правило, в практической работе штраф за несовпадение нуклеотида устанавливают -1, начало пробела от -3 до —20 и более. Штраф за продолжение пробела устанавливают около —1. Причина этого связана с тем, что вставка или удаление нескольких нуклеотидов может быть результатом одного события [Лукашов, 2009; Felsenstein, 1985].
Для установления эволюционных дистанций между полипептидами используются подходы, основанные на матрицах вероятностей конкретных аминокислотных замещений, построенные на экспериментальных наблюдениях [Henikoff, Henikoff, 1978]. Гидрофобные аминокислоты более вероятно будут замещаться гидрофобными, ароматические - ароматическими, и т.д. Замещение цистеина другой аминокислотой имеет наименьшую вероятность. В матрице учитываются также различия в кодонах, кодирующих аминокислоты. В некоторых случаях аминокислотное замещение требует не менее двух конкретных нуклеотидных замен, тогда как в других - одной случайной замены. Каждому событию (сохранение аминокислоты или ее замещение каждой другой аминокислотой) также присваиваются положительные и отрицательные оценки, в зависимости от вероятности этих событий. Составленные таким образом матрицы (20x20) вероятностей замещения используются при расчете эволюционных дистанций. Менее вероятные замещения учитываются как значительно больше увеличивающие дистанцию между двумя последовательностями, чем более вероятные замещения. Первыми были матрицы класса РАМ (point accepted mutations), рассчитанные Маргарет Дэйхофф [Dayhoffe? al., 1978]. Эти матрицы отражают вероятности сохранения каждой аминокислоты и ее замещения каждой другой аминокислотой в случаях, если замещается 1 из 100 (РАМІ), 10 из 100 (РАМ 10), 50 из 100 (РАМ50) и т.д. Этот подход не оптимален при анализе не близкородственных последовательностей [Лукашов, 2009]. Эта проблема решается в матрицах класса BLOSUM (block substitution matrix) [Henikoff, Henikoff, 1978]. Разработка матриц этого класса основывается на рассмотрении только консервативных участков последовательностей. Кроме того предложены матрицы Gonnet [Gonnet et al., 1992], WAG [Whelan and Goldman, 1992] и др. В отличае от замен, сколько-нибудь надежная количественная оценка вероятностей вставок и делеций весьма затруднена. При филогенетическом анализе присутствующие в последовательностях пробелы, как правило, не учитывается. Аналогично подходят к участкам, последовательность которых не известна.
Поскольку все формы жизни на Земле имеют общее происхождение, их эволюционная история - это порядок дивергенции от общих предков. Задачей филогенетического анализа является реконструкция эволюционной истории -установление родственных связей между формами жизни и датирование эволюционных событий, моментов дивергенции. Эволюционные отношения между формами жизни представляют в виде филогенетических деревьев. Филогенетическое дерево состоит из внутренних и внешних ветвей, узлов и корня (по выбору исследователя). Внутренние ветви соединяют внутренние узлы, внешние ветви ведут непосредственно к объектам исследования. Объектами могут быть гены или их участки, нуклеотидные или аминокислотные последовательности, организмы, популяции и другие объекты, которые называются оперативные таксономические единицы (ОТЕ) [Лукашов, 2009].
Деревья с корнем отражают направление эволюции. Деревья без корня показывают родственные отношения между анализируемыми последовательностями. Внутренний узел представляет последнего общего предка для последовательностей, ответвляющихся от этого узла. В масштабируемых деревьях длина ветвей отражает эволюционную дистанцию или время после дивергенции ОТЕ. Для определения положения корня дерева может быть использована внешняя группа - одна или несколько ОТЕ, отпочковавшихся заведомо раньше анализируемых ОТЕ [Лукашов, 2009].
Методы построения филогенетических деревьев делятся на две группы -дистанционные методы и методы анализа дискретных признаков. Из первой группы чаще всего применяется метод минимума эволюции, и метод присоединения соседей. Метод минимума эволюции [Rzhetsky, Nei 1992] подразумевает построение всех теоретически возможных деревьев и выбор из них дерева с наименьшей суммой длин всех ветвей. Трудоемкость процедуры заставила разработать метод присоединения соседей [Saitou, Nei, 1987], в котором из выборки последовательностей перебираются все варианты объединения пар в одну ветвь и выбираются варианты с наименьшей суммой эволюционных дистанций. Выбранная пара объединяется в композитную последовательность, после чего процесс повторяется N-1 циклов; на каждом
Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOXl
Анализ продуктов, полученных при окислении линолевой кислоты при участии мутантных форм ZmLOX3, позволил определить специфичность действия этих ферментов. Преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 Ala560Gly была ( -гидроперекись жирной кислоты. Количество минорных продуктов: ((9R)-, (135)-, (13І?)-гидроперекисей 18:2) составляло не более 3%, что соответствовало реакции при участии ZmLOX3 дикого типа (рис. 39, табл. 3). Скорости реакции при участии ZmLOX3 дикого типа и Ala560Gly с 18:2 были примерно одинаковыми. Согласно построенной нами компьютерной модели (раздел 3.5.), боковая группировка А1а560, входящего в состав той же а-спирали, что и А1а562, не участвует в формировании внутренней поверхности субстрат-связывающего кармана. По-видимому, субстрат, находясь в активном центре, не взаимодействует с данным аминокислотным остатком.
Данные, представленные для (9і?)-специфичной ЛОГ Nostoc и ее мутантных форм по сайту Коффа Alal62Gly, А1а16211е и Alal62Val, позволяют предположить, что лишь более объемные боковые группы аминокислотных остатков играют роль в определении специфичности ЛОГ [Andreou et al., 2008].
Продуктами окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3Ala562Gly являлись 9-гидроперекись (68,5%) и 13-гидроперекись (31,5%) (рис. 39, табл. 3). С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показано, что среди 9-гидроперекисей линолевой кислоты преобладали (5)-энантиомеры (97%), среди 13-гидроперекисей - (Я)-энантиомеры (96%) (рис. 39). Для ZmLOX3 константа Михаэлиса составила 20,2 мкМ, для ZmLOX3Ala562Gly - 3,2 мкМ. Согласно картине кинетики окисления при участии ZmLOX3Ala562Gly (данные не приведены), наблюдалось удлинение лаг-фазы реакции. Понижение значения константы Михаэлиса и удлинение лаг-фазы реакции наблюдались для Ala542Gly GmLOXl и мутантных форм
Анализ нормально-фазовой ВЭЖХ гидроперекисей, полученных в результате окисления линолевой кислоты ZmLOX3 дикого типа (а), ее мутантной формой Ala560Gly (г), и мутантной формой Ala562Gly (ж). Энантиомерный анализ продуктов окисления при участии ZmLOX3 (б), (в) и мутантной формы Ala560Gly (д), (е) и мутантной формы Ala562Gly (з), (и). других ферментов [Coffa, Brash, 2004; Coffa et al., 2005], что объяснялось эффектом ингибирования реакции при высоких концентрациях субстрата. Таким образом, проведенная нами мутация Ala562Gly липоксигеназы кукурузы ZmLOX3 привела к изменению региоспецифичности каталитического действия фермента. GmLOXl, обладающая (138)-специфичностью, имеет оптимум активности при щелочных значениях рН, когда карбоксильная группа ионизирована. В этих условиях, согласно теории Коффа [Coffa, Brash, 2004], субстрат входит в активный центр фермента метильным концом. Для (9S)-специфичных липоксигеназ оптимум сдвинут в кислую область, когда ионизации карбоксильной группы не происходит. Предполагается, что это позволяет субстрату проникать в активный центр карбоксильной группой, что, по мнению авторов, необходимо для образования (98)-гидроперекиси. Альтернативная покетная гипотеза заключается в том, что ориентация субстрата всегда одинакова и соответствует его погружению в активный центр метильной концевой группой. Полученные нами данные подтверждают покетную гипотезу. По нашему предположению специфичность определяется архитектурой активного центра. В частности, боковая группа аминокислотного остатка А1а542 GmLOXl (соответствующая А1а562 ZmLOX3), расположенного у входа в субстрат-связывающий карман, существенна для правильного позиционирования субстрата в активном центре. Вероятно, для (135)-специфичных липоксигеназ боковая группа А1а542 закрывает от молекулы кислорода 9-ый атом углеродной цепи субстрата (рис. 6, раздел 1.5). Для (95)-специфичных липоксигеназ боковая группа соответствующего А1а562 закрывает 13-ый атом углеродной цепи субстрата. При замене аминокислотного остатка аланина на остаток глицина, боковая группировка которого состоит из атома водорода вместо метильной группы, позиция 13-го атома углерода открывается для присоединения кислорода. Еще одним следствием мутации является нарушение фиксации углеродного скелета в активном центре. Результатом является то, что мутантная форма Ala562Gly производит не только (9S)-, но и (13/?)-гидроперекиси линолевой кислоты.
Доказательством обратных ориентации субстратов для (9S)- и (135)-специфичных липоксигеназ, послужили данные по окислению сложных липидов in vitro. Было показано, что (135)-липоксигеназы способны окислять сложные липиды: GmLOXl окисляла остатки арахидоновой и линолевой кислоты в составе фосфатидилхолина [Brash et al., 1987, Perez-Gilabert et al., 1998], ЛОГ огурца окисляла трилиноленин сразу по.трем остаткам жирных кислот [Hornung et al., 1999]. Сообщалось, что -Специфичные липоксигеназы томата [Regdel et ah, 1994], картофеля [Huang et al., 2008] и ячменя [Holtman et al., 1997] не были способны окислять сложные липиды. Эти данные объяснялись тем, что массивная группировка на карбоксильном конце субстрата являлась стерическим препятствием, не позволяющим субстрату проникнуть в активный центр (95)-липоксигеназ карбоксильной группой [Coffa, Brash, 2004]. Другими авторами были получены данные, свидетельствующие о том, что ZmLOX3 окисляет монолинолеоилглицерол и лизофосфохолин [Chechetkin et al., 2011]. В наших исследованиях мы задались целью определить характер окисления монолинолеоилглицерола мутантантной формой ZmLOX3 с частичным изменением региоспецифичности и провести сопоставление полученных каталитических свойств с характером окисления сложных липидов ферментом дикого типа.
Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых LuDES
Перед проведением очистки лизаты клеток продуцента проверяли на каталитическую активность в отношении гидроперекисей жирных кислот. Для этого в буфер (100 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7.5), содержащий субстрат 13-ГПОТ, вносили 2 мкл лизата и измеряли скорости снижения поглощения реакционной смеси при 234 нм. Лизаты, обладавшие активностью, использовали для получения очищенных белковых препаратов. После металлоаффинной хроматографии и ультрафильтрации качество очистки фермента (рис. 72) оказалось достаточным для исследования каталитических свойств СYP74B16.
Очищенный препарат CYP74B16 обладал ферментативной активностью в отношении гидроперекисей жирных кислот. Об этом свидетельствовало изменение оптической плотности их растворов при длине волны 234 нм после добавления очищенного белка. Для подбора оптимальных условий реакции нами был испытан диапазон концентраций субстрата от 5 до 300 мкмоль, а также буферы с различными значениями рН. В результате было установлено, что рекомбинантный белок CYP74B16 проявляет каталитическую активность в широком диапазоне рН, с выраженным максимумом активности в слабощелочных условиях, при значениях рН от 7,5 до 8,0 (рис. 73). Дальнейшие исследования проводились при рН 7,5.
Для определения типа каталитической активности нами была проведена характеристика продуктов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот при участии рекомбинантного белка CYP74B16. Было установлено, что снижение оптического поглощения реакционной смеси при длине волны 234 нм компенсировалось возрастанием поглощения в области 267 нм. Поглощение в этой области характерно для дивиниловых эфиров, что было подтверждено данными спектрометрического анализа. Его результаты представлены на рисунке 74.
Зависимость каталитической активности рекомбинантного фермента CYP74B16 от значения рН реакционной смеси. Белый треугольник -Na-ацетатный буфер (50 ммоль); черные треугольники - Na-фосфатный буфер (50 ммоль); черные кружки - трис-НСІ буфер (50 ммоль); белый кружок -глицин/NaOH буфер (50 ммоль).
Результат анализа продуктов инкубации рекомбинантного фермента CYP74B16 с (135)-гидроперекисью а-линоленовой кислоты методом ГХ-МС: А - хроматограмма продуктов инкубации по полному ионному току (TIC) (Me эфиры ТМС производных); Б - электронный масс-спектр основного продукта (метиловый эфир); В - электронный масс-спектр продукта каталитического гидрирования основного продукта (метиловый эфир).
Среди продуктов превращения (135)-ГПОТ было выявлено преобладающее соединение, проявляющее [М]+ при m/z 306. Его профиль фрагментации был идентичен профилю, описанному ранее для метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998; Chechetkin et al., 2008] и этероленовой кислоты [Grechkin et al., 1995]. В результате анализа продуктов реакции в виде Ме/ТМС после восстановления боргидридом натрия и каталитического гидрирования (раздел 2.15.) наряду с гидрированным дивиниловым эфиром (13-оксанонадекановой кислотой) был выявлен С -фрагмент (12-гидрокси-додекановая кислота (Ме/ТМС)).
Соотношение 12-гидроксидодекановой кислоты к дивиниловому эфиру, определенное из текущих данных ГХ-МС по полному ионному току, составляло 10:90. Таким образом, преобладающим продуктом являлся дивиниловый эфир. Каких-либо продуктов алленоксидсинтазной реакции в результате проведенных экспериментов обнаружено не было.
Метиловые эфиры продуктов реакции были проанализированы также с помощью ВЭЖХ. Анализ подтвердил присутствие одного мажорного продукта с максимумом поглощения в метаноле при 267 нм (рис. 75).
Данное соединение было очищено и исследовано методами ЯМР-спектрометрии. В таблице 8 представлен Н-ЯМР спектр исследуемого вещества, который оказался идентичен спектру (со52)-этероленовой кислоты, полученному ранее [Chechetkin et ah, 2008]. Значения констант спин-спинового взаимодействия Jn,i2 = 12,0 Гц и Jyy = 6,2 Гц свидетельствуют о транс и цис-конфигурации этих двойных связей, соответственно.
Полученные данные позволили идентифицировать продукт преобразования 13(5)-ГПОТ как (ш57)-этероленовую кислоту, а фермент CYP74B16 как дивинилэфирсинтазу. В соответствии с номенклатурой ферментов CYP74, новому ферменту было присвоено тривиальное название LuDES (дивинилэфирсинтаза L. usitatissimum), также как и соответствующему гену - LuDES [Gogolev et ah, 2012].
Обнаружение (92)-12-оксо-9-додеценовой кислоты в продуктах реакции не противоречит проведенной идентификации фермента. Некоторые АОС и ДЭС проявляют минорную гидропероксидлиазную активность. Так, 13-гидропероксидлиазные продукты из (135)-ГПОТ в некоторых количествах образуются при участии ДЭС чеснока, алленоксидсинтаз риса и арабидопсиса [Grechkin et al., 1995; Schenkman, Jansson, 2006]. Кроме того, дивиниловые эфиры могут подвергаться фрагментации в результате спонтанного гидролиза.
В совокупности полученные результаты указывают на то, что фермент льна CYP74B16 является уникальным объектом, представляющим особый интерес для изучения механизма катализа и филогении как ферментов семейства CYP74, так и цитохромов Р450 в целом. По гомологии первичной структуры белок относится к подсемейству CYP74B. Однако в то время как все известные цитохромы подсемейства CYP74B являются гидропероксидлиазами, CYP74B16 проявляет дивинилэфирсинтазную активность. В связи с этим, обнаружение дивинилэфирсинтазы LuDES открывает перспективы выявления особенностей структуры активного центра ферментов CYP74, определяющих тип катализа. Кроме того, полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярной эволюции семейства CYP74.
