Введение к работе
Актуальность темы исследования. В организме человека и других видов млекопитающих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа представлена двумя тканеспецифическими изоферментами: соматическим (GAPD) и сперматозоидным (GAPDS). Их последовательности идентичны друг другу приблизительно на 70%. GAPD - хорошо изученный белок, который присутствует в клетках в очень высоких концентрациях. Исследования, проведенные в течение последних двух десятилетий, позволили установить, что GAPD вовлечена в большое количество негликолитических процессов (Seidler 2013).
GAPDS локализована в области цитоплазмы жгутика сперматозоида и прикреплена к цитоскелету (Krisfalusi et al. 2006). Ее функция заключается в снабжении энергией АТР моторного белка жгутика - динеина. Нарушения экспрессии GAPDS приводят к возникновению серьезных патологий, как правило, являющихся причиной возникновения бесплодия (Miki et al. 2004). Прочная связь между GAPDS и цитоскелетными белками препятствует выделению сперматозоидного изофермента и существенно усложняет его экспериментальное изучение. К моменту начала работы над диссертацией была опубликована лишь одна работа, посвященная выделению GAPDS из сперматозоидов и исследованию некоторых из ее энзиматических свойств, которые, как было показано, отличаются от свойств GAPD (Westhoff & Kamp 1997). Биоинформатический анализ последовательностей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ млекопитающих позволил выдвинуть предположение о том, что для GAPDS, в отличие от GAPD, нехарактерно участие в негликолитических процессах (Куравский & Муронец 2007). Также было показано, что GAPDS может быть вовлечена в развитие раковых опухолей -меланом (Hoek et al. 2008) и болезни Альцгеймера (Wang et al. 2012).
Изучение GAPDS представляет огромный интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения перспектив практического применения полученных результатов. За время работы над диссертацией было опубликовано не менее 9 работ, посвященных этому белку (включая 5 работ, выполненных в нашей лаборатории). Соматический и сперматозоидный изоферменты глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы служат хорошей моделью для исследования функциональной дивергенции и тканеспецифической специализации дуплицированных генов. GAPDS является также и актуальным объектом для экспериментального изучения, так как играет важную роль в обеспечении подвижности сперматозоидов и, следовательно, фертильности.
Воздействие на GAPDS может иметь практическое применение, связанное как с лечением бесплодия, так и с контрацепцией. Определенный интерес представляют и исследования экспрессии GAPDS в соматических тканях при различных патологических состояниях (в первую очередь, в клетках меланом и при болезни Альцгеймера). Результаты исследований могут позволить лучше понять причины возникновения этих состояний и послужить основой для разработки новых средств диагностики и лечения.
Цели и задачи. Целью настоящей работы являлось изучение эволюции сперматозоидного и соматического изоферментов глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназы человека, получение растворимого и энзиматически активного препарата GAPDS, изучение его физико-химических свойств и исследование экспрессии GAPDS при заболеваниях. Были поставлены следующие задачи:
анализ филогении генов, кодирующих изоферменты глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназы;
оценка давления естественного отбора, воздействующего на гены глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназ;
изучение процесса специализации GAPDS в спермоспецифический белок;
разработка методики выделения энзиматически активной GAPDS из бактерий-продуцентов;
исследование физико-химических свойств выделенного белка и его сравнение с соматическим изоферментом;
получение поликлональных антител, которые могли бы быть использованы для детекции GAPDS в сперматозоидах и других клетках человеческого организма;
выявление GAPDS в соматических клетках при различных патологиях и исследование возможной роли ее экспрессии.
Научная новизна и практическая значимость работы. Полученные результаты значительно расширяют круг имеющихся сведений об эволюции белкового семейства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. В частности, было показано, что GAPDS млекопитающих и ящериц специализировалась в спермоспецифический белок и приобрела дополнительный полипролиновый домен, необходимый для прикрепления к фиброзному слою жгутика сперматозоида. Выдвинуто предположение о том, что во взаимодействие с полипролиновым доменом вовлечены несколько различных белков цитоскелета, причем взаимодействие носит неспецифический характер. Установлено, что
экспрессия полипролинового домена GAPD-2 ящериц находится под контролем тканеспецифического альтернативного сплайсинга.
Была разработана методика получения рекомбинантной формы GAPDS, лишенной полипролинового домена (dN-GAPDS). Показано, что dN-GAPDS представляет собой адекватную модель для изучения энзиматических свойств полноразмерного белка и, в отличие от соматического изофермента, проявляет выраженную положительную кооперативность связывания NAD+. Анализ мутантных форм dN-GAPDS позволил установить, что важную роль в передаче структурных изменений, индуцируемых связыванием NAD+, играет ионная связь D311-H124.
Было показано, что dN-GAPDS существенно более устойчива к денатурации, чем GAPD. Результаты исследования мутантных форм dN-GAPDS свидетельствуют о том, что повышенная стабильность этого белка связана с наличием дополнительных остатков пролина Р157 и Р326, а также ионных связей Е96-Н394, E244-R320 и D311-H124. Выдвинуто предположение о возможной биологической роли повышенной стабильности GAPDS, которая может быть связана с отсутствием в зрелых сперматозоидов аппарата экспрессии генов.
Разработана методика получения поликлональных антител, узнающих либо только нативную, либо и нативную, и денатурированную конформации dN-GAPDS. Данная методика не требует какого-либо специального оборудования и может быть использована для получения антител против различных конформации других белков. Такие антитела могут иметь широкий круг применения и являются хорошей альтернативой коммерческим препаратам моноклональных антител.
Было показано, что в некоторых линиях меланомных клеток происходит экспрессия GAPDS. Экспрессируемый белок локализован в цитоплазме, лишен полипролинового домена и формирует гетеротетрамерные комплексы с участием субъединиц GAPD. Выдвинуто предположение о том, что экспрессия GAPDS может повышать эффективность энергетического метаболизма меланомных клеток и препятствовать индукции апоптоза. Дальнейшее изучение экспрессии GAPDS в меланомных клетках может помочь в разработке новых методов диагностики и лечения этого заболевания.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены и одобрены на совместном заседании отделов биохимии животной клетки и биокинетики НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, а также на следующих конференциях: Biocatalysis-2013 (Москва, 2013), 22nd ШВМВ & 37th FEBS Congress (Севилья, Испания, 2012) и Moscow Conference on Computational
Molecular Biology (Москва, 2011). Результаты работы были отмечены двумя дипломами победителю конкурса работ на присуждение грантов О. В. Дерипаска талантливым студентам, аспирантам и молодым ученым МГУ им. М. В. Ломоносова (2013, 2012), стипендиями МГУ им. М. В. Ломоносова для молодых преподавателей и ученых, добившихся значительных результатов в преподавательской и научной деятельности (2012, 2011), дипломом за Ш-е место Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ среди аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки (2011) и премией им. А. Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского (2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 3 материала международных конференций.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, разделов «Происхождение и эволюция гена GAPDS», «Экспериментальное исследование свойств рекомбинантной GAPDS» и «Экспрессия GAPDS в меланомных клетках», выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 225 страниц машинописного текста, 19 таблиц и 57 рисунков. Список цитируемой литературы включает 416 отечественных и зарубежных источников.
Приняты следующие сокращения:
DLS - динамическое светорассеяние
dN-GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы,
лишенный полипролинового домена
DSC - дифференциальная сканирующая калориметрия
ELIS А - твердофазный иммуноферментный анализ
GAPD - соматический изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
GdnHCl - гуанидингидрохлорид
Ka/Ks - отношение частот синонимичных и несинонимичных замен
ODso - концентрация антител, при которой оптическая плотность раствора, анализируемого
методом ELISA, составляет 50% от максимального значения
КМ-целлюлоза - карбоксиметилцеллюлоза
