Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Свойства и функции лектинов грибов
1.1.1. Общее понятие о лектинах 20
1.1.2. Предполагаемая роль лектинов грибов 22
1.1.3. Биологические свойства грибных лектинов 28
1.1.4. Применение грибных лектинов 33
1.2. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности lentinus edodes (berk.) sing [lentinula edodes (berk.) pegler]
1.2.1. Краткая характеристика Lentinus edodes 39
1.2.2. Lentinus edodes - гриб "белой" гнили 42
1.2.3. Питательные свойства и медицинское значение Lentinus edodes 48
1.3. Значение экзогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности мицелиальных культур
1.3.1. Соединения селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур 55
1.3.1.1. Селен - составляющая часть минерального питания грибов ...55
1.3.1.2. Химия селена в живой клетке 58
1.3.1.3. Влияние искусственных добавок селенсодержащих веществ на развитие грибных культур 61
1.3.2. Соединения меди в биохимии микроорганизмов ..64
1.3.3. Фитогормон (З-индолил-3-уксусная кислота в искусственной культуре базидиомицетов 68
2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования, условия культивирования 75
2.2. Методы исследования
2.2.1. Получение чистой мицелиальной культуры и плодовых тел L. edodes 77
2.2.2. Пробоотбор грибных изолятов с плотных и жидких сред ...79
2.2.3. Определение ростовых характеристик грибной культуры 79
2.2.4,Определение гемагглютинирующей активности 80
2.2.5. Установление зависимости активности лектинов
от условий культивирования 80
2.2.6. Определение углеводной специфичности агглютининов 81
2.2.7. Определение молекулярной массы белков 82
2.2.8. Анализ аминокислотного состава 82
2.2.9. Хроматографический анализ углеводов 82
2.2.10. Дериватизация углеводных фракций 83
2.2.11. Анализ жирнокислотного состава ...84
2.2.12. Получение антител к лектинам 84
2.2.13. Иммуноферментный анализ 85
2.2.14. Определение индольных и фенольных соединений 85
2.2.15. Рентгенофазовый анализ 85
2.2.16. Спектральный анализ ЯМР 'Н 86
2.2.17. ИК спектральный анализ 86
2.2.18. Расчетные методы квантовой химии и QSAR ...86
2.2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных 87
3. Результаты и обсуждение
3.1. Обнаружение, выделение, очистка, определение специфичности гемагглютининов lentinus edodes
3.1.1. Обнаружение внеклеточных лектиновL. edodes 88
3.1.2. Выделение и очистка, определение углеводной специфичности лектинов 97
3.2. Зависимость лектиновой активности от условий культивирования 113
3.2.1. Влияние температуры, дозы посевного мицелия, возраста культуры на лектиновую активность L. edodes 114
3.2.2. Активность внеклеточных лектинов/,. edodes в зависимости от источников углерода и азота ...122
3.2.3. Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение
3.2.3.1. Катионы двухвалентных металлов .133
3.2.3.2. Катионы металлов триады железа .145
3.2.3.3. Селен в органической форме 156
3.2.4. Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность/,, edodes 168
3.3. Физико-химическая характеристика пектинов lentinus edodes
3.3.1. Внеклеточный гликопротеин L. edodes — пектин.L1 177
3.3.2. Внеклеточный протеогликан L. edodes - лектин L2 ...185
3.4. Лектины шиитаке в процессах морфогенеза
3.4.1. Лектиновая активность//, edodes на разных стадиях .«* формирования плодовых тел 205
3.4.2. Формирование пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке в зависимости от активности внеклеточных лектинов
3.4.3. Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия L. edodes
на разных стадиях морфогенеза 219
3.4.4. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности/,, edodes в процессе морфогенеза 228
3.5. Лектины шиитаке при взаимодействии с экзогенными соединениями
3.5.1. Взаимодействие лектинов с органическими селенсодержащими веществами 235
3.5.1.1. Влияние селенсодержащих соединений на активность внеклеточных лектинов L. edodes 235
3.5.1.2. Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от стадии очистки препарата лектина 239
3.5.1.3. Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от концентрации селенсодержащих соединений 245
3.5.1.4. Квантовохимические и QSAR свойства селенсодержащих соединений ряда 1,5-ди(4-К-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 ...248
3.5.1.5. Сравнительный анализ реакционной способности L-цистеина и L-метионина: некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен 256
3.5.2. Взаимодействие лектинов с катионами меди (II) 272
3.5.3. Взаимодействие экзолектинов шиитаке с фитогормоном ИУК 287
Заключение 293
Выводы 301
Литература 304
Приложение
- Свойства и функции лектинов грибов
- Объекты исследования, условия культивирования
- Обнаружение, выделение, очистка, определение специфичности гемагглютининов lentinus edodes
- Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение
Введение к работе
Актуальность темы данной работы определяется прежде всего ее направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, лектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения. Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны.
Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество. Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс. видов. Промышленное производство высших грибов во многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль.
Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества. В настоящее время известно большое количество видов базидиальных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ. К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения дополнительного источника белка, биологически активных соединений относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes.
Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения. При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию
10 биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворнина, 1990].
Исследования роста базидиомицетов, в том числе L. edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994]. Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989]. Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. В частности, лектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными.
Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов, взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс; с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов). Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому
представляло интерес изучить не только эффекторы — компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы.
Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций. Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование.
Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes и условий проявления их биологической активности.
Задачи исследования:
1. Провести скрининг штаммов Lentinus edodes на присутствие лектинов.
Выделить внеклеточные лектины L. edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность.
Изучить зависимость лектиновой активности культуры L. edodes от условий выращивания. Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности. Разработать способ получения экзолектинов L. edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов.
4. Исследовать влияние катионов металлов(И) на активность
внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой
химии и QSAR.
5. Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую
активность L. edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.
Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L. edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре.
Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры.
Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (селен-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов).
Исследовать биологические свойства лектинов: их способность к взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами эритроцитов; антигенные свойства.
10. Изучить возможности использования глубинной культуры L. edodes
при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически
перспективного посевного материала.
Научная новизна работы
Впервые в культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L. edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.
Выделены чистые препараты лектинов из культуральной жидкости L. edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность лектиновых препаратов.
Впервые показано, что максимальное повышение внеклеточной лектиновой активности базидиомицета наблюдается при условиях, отличных от оптимальных для выращивания культуры.
Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном
13 культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.
Впервые на промежуточной стадии очистки одного из лектинов обнаружен и выделен необычный для макробазидиомицетов гликолипид моносахаридной природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке.
Впервые выявлено взаимодействие лектинов ксилотрофного базидиомицета с фитогормоном ИУК, сопровождающееся значительным увеличением лектиновой активности в системе "лектин-ИУК".
Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах.
Практическая значимость исследования
Работа вносит вклад в развитие направления лектинологии, связанного с изучением лектинов высших грибов, в рамках которого положено начало новой области исследования препаратов внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов.
Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов. Разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению. Выявлены низкомолекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными лектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями - антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гемагглютинации; некоторые антигенные свойства. Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при
14 проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии.
На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие характерной для данного вида коричневой мицелиальной пленки. Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по лектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.
Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в создание эффективного способа получения посевного мицелия шиитаке.
Материалы работы и препараты лектинов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе химического факультета СГУ, СВИРХБЗ, лаборатории микробиологии Института микробиологии НАН Беларуси. По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006). Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными в Приложении к диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту
В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentinus edodes присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.
Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов
15 эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений.
3. Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L. edodes
зависят от физико-химических условий культивирования. Наиболее значимыми
факторами, влияющими на лектиновую активность глубинной культуры L.
edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных
источников азота, катионов металлов(П), селена в органической форме.
4. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной
культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается
значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со
стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.
5. Лектины L. edodes принимают участие в морфогенетических процессах
культуры. Установлена взаимосвязь внеклеточной лектиновой активности
шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной
культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном
культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим
компонентам химического состава мицелия — липидам и углеводам.
Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L. edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолипид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L. edodes.
Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L. edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксиданты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий.
Лектины L. edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно увеличивается лектиновая активность в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.
9. Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке на основе дифференциации хроматографических характеристик и усиления биосинтеза одного из лектинов является воздействие Cu(II).
Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина), "Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина).
Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - к.х.н. Е.Е Федоров), с лабораторией биохимии (зав. лабораторией в период выполнения исследований — д.б.н. В.В. Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), при непосредственном участии д.х.н., профессора А.Н. Панкратова; на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав. кафедрой - д.х.н., профессор А.П. Кривенько).
Частично данная работа получила финансовую поддержку:
- грант РФФИ "Лектины ксилотрофных базидиомицетов разных
систематических групп" № 03-04-48129 (2003-2005 гг.)
- грант РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского республиканского фонда
фундаментальных исследований) "Гликополимеры и углеводсвязывающие
белки ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность" №
06-04-81042-Бел_а (2006-2007 гг.)
- грант Федерального агентства по науке и инновациям в рамках
федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и
разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-
2006 годы (государственный контракт № 02.444.11.7331)
- программа Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", совместный проект ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на: 37th ШРАС Congr. Frontiers in Chemistry: Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug. 14-19, 1999); науч. конфер. "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии" (Саратов, 1999); 5th World Congr. of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug., 1999); 1-й регион, конфер. мол. ученых (Саратов, 26-27 марта 2002); Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002); межд. науч. конфер. "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов); IV Всерос. конфер. мол. ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003); Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Saratov, 28-30 July, 2003); VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003); 8-й Межд. Путинской школе-конфер. мол. ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004); III Всерос. школе-конфер. "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов); II Российской школе-конфер. "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 13-16 октября 2004); Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практич. конфер. "Вавиловские чтения - 2004" (Саратов, 24-26 ноября 2004); II Всерос. симп. "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005); Межд. конфер. "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября 2005); Всерос. конфер. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 15-17 июня 2005); V Всерос. конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии"
18 (Саратов, 22-24 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); II Межд. симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005); 10-й Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); Межд. науч. конфер. "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006); Межд. науч. конфер. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006); Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); 4-й Росс, конфер. "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 4-5 июня 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежит идея, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов.
Благодарности
Следует отметить вклад в выполнение данной работы д.б.н., зав. лабораторией В.Е. Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lentinus edodes и лектины
19 этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды. Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В.Е. Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы.
Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация — невозможна, без сотрудничества с д.х.н., профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им. Н.Г. Чернышевского А.Н. Панкратовым.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 38 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в рецензируемых иностранных изданиях и российских журналах, входящих в "Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК ...", 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения. Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований.
Работа изложена на 353 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 55 рисунками и 54 таблицами. Список цитируемой литературы включает 519 источников (отечественных и зарубежных).
Свойства и функции лектинов грибов
В последнее время повышенный интерес ученых вызывают углеводсвязывающие белки - лектины, которые играют важную роль в процессах биологического узнавания, найдены во всех биологических организмах, от бактерий и вирусов до человека, и имеют широкий спектр биологической активности. Они участвуют во внутриклеточных и межклеточных взаимодействиях, выступают в роли иммуномодуляторов и триггеров, обнаруживают митогенные и противоопухолевые свойства, широко используются в разных областях химии, биохимии, биологии и медицины.
Начало изучению лектинов было положено в конце XIX века работами немецкого ученого Г. Штильмарка, который установил, что экстракты семян клещевины обыкновенной Ricinus communis имеют токсическое вещество, вызывающее агглютинацию эритроцитов и их гемолиз [Stillmark, 1888]. Он описал метод выделения и свойства вещества, названного рицином (от латинского названия растения). Позднее был описан токсический агглютинин из четочника (Abrus precatorius) - абрин [Hellin, 1891]. После открытия рицина и абрина - первых представителей неизвестного ранее класса биологически активных соединений - лектинов - набор растительных объектов, исследуемых на присутствие лектинов, быстро расширялся [Olsnes and Pihl, 1977]. Особый интерес к изучению лектинов появился после обнаружения того факта, что некоторые из лектинов агглютинируют эритроциты человека дифференцированно, в зависимости от группы крови [Королев, 1984]. Несколько позднее были обнаружены лектины животных, грибов и микроорганизмов [Reitherman et ah, 1975; Simpson et al, 1978]. Открытие гемагглютининов различной природы, значительное расширение перечня ставших известными агглютининов и одновременное выявление характерного для них свойства реагировать с углеводами вызвало естественную потребность в дифференциации в научной терминологии этой группы белков, присвоении ей определенного названия.
Сам термин "лектин", впервые предложенный Бойдом и происходящий от латинского "lectus", причастия от глагола legere - выбирать, различать, отражал не столько сущность собственно белка, сколько результат его предполагаемого основного практического применения - типирование групп крови.
Наиболее предпочтительной является, по определению М. Этцлера, формулировка Коцоурека и Хордкейши, данная ими в 1983 году: лектины -белки неиммуноглобулиновой природы, способные к специфическому распознаванию углеводов (гликозильных групп) и обратимому связыванию с ними без нарушения ковалентной структуры узнаваемых гликозильных лигандов [Kocourek and Horejsi, 1983].
Согласно этому определению к лектинам можно отнести как поливалентные белки, способные агглютинировать клетки или преципитировать гликоконъюгаты и полисахариды, так и некоторые моновалентные токсические белки растительного и бактериального происхождения [Kocourek and Horejsi, 1981]. Кроме того, к таким углеводсвязывающим белкам можно отнести рецепторы транспорта углеводов, некоторые гормоны, а также ферменты углеводного обмена - гликозидазы и гликозилтрансферазы - содержащие углеводсвязывающие участки, независимые от каталитического центра [Лахтин, 1989].
Для обнаружения лектинов чаще всего используют тест на агглютинацию эритроцитов животных и человека, особенно после трипсинизации [Луцик и др., 1981]. Помимо этого, хотя и значительно реже, применяют лимфоциты, лейкоциты, клетки микроорганизмов, опухолевые клетки, а также искусственные частицы. Кроме теста на агглютинацию, используют тест на преципитацию искусственных и природных гликоконъюгатов, аффинный электрофорез и иммунологические методы, прежде всего радиоиммуноанализ [Марков и Хавкин , 1983].
Широкое практическое использование препаратов растительных лектинов в различных областях биологических и медицинских исследований определяется их активностью как углеводсвязывающих белков, значительной степенью специфичности в связывании углеводов и разнообразным спектром биологической активности в системах in vivo и in vitro [Королев, 1984]. Уникальные свойства, полифункциональность лектинов и их комплексов с эндо- и экзогенными эффекторами являются основаниями для поиска новых сырьевых источников этих белков, особенно среди микроорганизмов.
Открытию грибных лектинов способствовали исследования в области токсикологии высших грибов, связанные с обнаружением в семенах Ricinus communis и Abrus precatorius токсинов, обладающих свойствами вызывать агглютинацию эритроцитов и названных рицин [Stillmark, 1888] и абрин [Hellin, 1891]. Молекулы с подобными свойствами в отношении клеток крови были также обнаружены и в грибах.
Первый грибной гемагглютинин был открыт Ford в 1910 году [Ford, 1910]. Обнаруженное наличие лектинов в традиционных съедобных грибах, в том числе Lactarius deliciosus [Galli-Vallerio and Bornand, 1916] и Boletus edulis [Friedberger and Brossa, 1912], ускорило дальнейшие поиски лектинов, поскольку стало очевидно, что лектиновая активность не всегда связана с токсичностью. Большинство лектинов не проявляют пищевой токсичности и не служат причиной грибных отравлений. Исключение, как недавно было обнаружено, составляет bolesatin, выделенный из Boletus satanas [Kretz, 1992; Kretz etai, 1989,1991a, b].
Вызывает интерес вероятность биохимического и филогенетического сродства между гемолизинами и агглютинирующими лектинами; и гемолиз, и гемагглютинация являются процессами, вторичными по отношению к связыванию молекулы с эритроцитом. В базидиомицете Laetiporus sulphureus лектин PSL, выделенный из базидиом, обладает как гемолитическими, так и гемагглютинирующими свойствами, причем обе активности ингибируются одними и теми же сахарами [Konska, 1993].
Объекты исследования, условия культивирования
Данное исследование выполнено на материале коллекции штаммов высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. В работе использованы 4 штамма L. edodes: NY, F-249, 2Т, 0779 (таблица 2.1-1). Культуры грибов поддерживали на сусло-агаре при 4С.
При подборе сред для выращивания чистых культур L. edodes использовали агаризованное пивное сусло (4 и 8 по Баллингу) и агаризованную среду на основе пшеничного отвара.
В процессе исследования лектиновой активности L. edodes на разных стадиях морфогенеза промежуточную культуру для получения плодовых тел выращивали на среде следующего состава ([Song et al, 1987], г/л): D-глюкоза -10; L-аспарагин - 1; КН2Р04 - 5; MgS047H20 - 2.5; FeS047H20 - 0.03; тиамин -510"4; Н20 до общего объема 1л
При изучении влияния состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов L. edodes использовали следующие источники углерода (300 мМ по углероду): D-глюкоза, сахароза, L-арабиноза, L-рамноза, D-манноза, D-мальтоза, D-фруктоза, D-галактоза, D-лактоза, ацетат натрия. В качестве источника азота в среду вносили в различных концентрациях L-аспарагин, NaNC 3, NH4C1. Рассчитывали оптимальное соотношение C:N. В состав сред входили только указанные компоненты. Кислотность исходной среды культивирования устанавливали добавлением НС1 или NaOH (0,05М) в стерильных условиях после раздельной стерилизации компонентов.
Для исследования взаимосвязи молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании L. edodes использовали синтетические среды на основе D-глюкозы (50 мМ) с источниками азота: хлорид аммония или нитрат натрия (соотношение углерод:азот в среде составляло от 7,5:1 до 150:1); эссенциальные аминокислоты (20 мМ по азоту). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали катионы Са или Мп в виде хлоридов.
С целью изучения стимуляторов лектиновой активности на агаризованных средах при культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): D-глюкоза (Glc), сахароза (Sue), L-арабиноза (Ага), L-рамноза (Rha), D-манноза (Man), D-мальтоза (Mai), D-фруктоза (Fra), D-галактоза (Gal), D-лактоза (Lac); источником азота (концентрация 20 mM по азоту): глицин (Gly), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Не), цистин (Cys), метионин (Met), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), аспарагин (Asn), фенилаланин (Phe), триптофан (Тгр), NH4C1, а также среду с фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,2) и композиции указанных компонентов. Среды Gly, Ala, Val, Leu, He, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Тгр содержали также 0,4500 г/л Glc. Среда PBS содержала также, г/л: Glc - 0,4500, NH4C1 - 0,2140. Среда Glc-NH4C1 содержала, г/л: Glc - 0,4500, NH4C1 - 0,2140.
Исследование влияния селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность L. edodes проводили на жидких и агаризованных средах. При глубинном культивировании L. edodes использовали среды: с D глюкозой и L-аспарагином, соотношение C:N 15:1 (среда I); пивное сусло, 2 по Баллингу (среда И); среда на основе пшеничной муки (20 г/л) (среда III); среда на основе экстракта дубовых опилок (среда IV). В состав плотных сред того же состава (la, Ша, IVa) и 4-го агаризованного пивного сусла (Па) входил дополнительно агар (18 г/л). В качестве селенсодержащего компонента сред выращивания использовали ДАФС-25 в виде раствора в подсолнечном масле высшей степени очистки. Препарат ДАФС-25 синтезирован, описан и любезно предоставлен авторами [Древко и др., 2001]. Концентрация в пересчете на селен в средах культивирования составляла 0,1 мг/л.
Изучая влияние двухзарядных катионов металлов на активность внеклеточных лектинов шиитаке, использовали синтетические жидкие среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): D-глюкоза, L-арабиноза, сахароза; источником азота служил L-аспарагин (10 мМ). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали соли металлов (концентрации 0-10 ммоль/л): MgS04"7H20, СаС122Н20, МпС12-4Н20, FeS047H20, CuS04-5H20, ZnS047H20, СоС126Н20, NiS046H20, SnCl22H20.
Синтетическая среда для изучения процессов хелатообразования в рамках проблемы влияния Fc(II), Co(II), Ni(II) на активность внеклеточных лектинов L. edodes состояла из глюкозы (50 мМ), аспарагина (10 мМ), включала добавки Fe(II), Co(II), Ni(II) (4 мМ) и этиленгликоля (2 мМ или 4 мМ).
Обнаружение, выделение, очистка, определение специфичности гемагглютининов lentinus edodes
О наличии лектинов Lentinus edodes информация крайне ограничена и представлена двумя работами [Jeune et al, 1990; Wang et al, 1999], касающимися выделения лектина из плодовых тел L. edodes. В литературе отсутствуют данные о внеклеточных лектинах шиитаке. Поэтому, учитывая важность и разнообразие функций лектинов в живых организмах, а также разностороннее значение базидиомицета Lentinus edodes, мы предприняли исследования по обнаружению внеклеточных лектинов, находящихся в культуральной жидкости гриба, а также в пассивных смывах с поверхности мицелия в условиях твердофазного культивирования.
Осуществление намерений обнаружить внеклеточные лектины L. edodes естественно было начать с экспериментов по поискам гемагглютининов культуральной жидкости. Для этих экспериментов применяли среду (далее обозначенную как "минеральная") следующего состава (["Методы...", 1982], г/л): глюкоза - 10; аспарагин - 1; КН2Р04 - 5; MgS047H20 - 2,5; FeS047H20 -0,03; тиамин -510"4; Н20 до общего объема 1 л.
В результате проведенных исследований была обнаружена гемагглютинирующая (ГА) активность в культуральной жидкости (КЖ) у всех взятых в эксперимент штаммов L. edodes F-249, 2Т, 0779, NY, выращенных на минеральной среде при 26С, в возрасте 21 суток. Данные представлены в таблице 3.1-1. Гемагглютинирующая активность в КЖ была наибольшей у штаммов 0779 (титр ГА 512) и F-249 (титр ГА 256). Наименьшей ГА активностью обладал штамм NY, титр ГА которого в 32 раза ниже максимальной из обнаруженных нами величин. То есть анализ КЖ показал значительные вариации ГА активности в зависимости от штамма шиитаке.
Возникает вопрос, не объясняются ли эти штаммовые различия по продукции внеклеточных гемагглютининов разной способностью культур к накоплению биомассы? Для корректности сравнения ГА активности у разных штаммов L. edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов на минеральной среде. Из таблицы 3.1-1 видно, что при температуре 26С в возрасте 21 сут скорости роста штаммов NY и F-249 практически не различаются и лишь в 1,2 раза ниже, чем наибольшая в этом ряду скорость роста штамма 0779; 2Т занимает промежуточное положение. Культура NY накапливает биомассу в 1,04 раза быстрее по сравнению с F-249, при этом титр ГА у NY ниже в 16 раз. То есть различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия в скорости роста культур штаммов при выращивании на данной среде.
Полученные данные позволяют говорить о большом количестве внеклеточных агглютининов, выделяющихся в среду выращивания. Для доказательства принадлежности выявленных гемагглютининов к классу лектинов были получены результаты определения углеводной специфичности агглютининов КЖ методом ингибирования агглютинации эритроцитов углеводами (таблица 3.1-2).
Из данных таблицы 3.1-2 следует, что лектины штаммов L. edodes имеют сходства и различия в отношении углеводной специфичности, и что имеется набор углеводов, ингибирующих реакцию ГА лектинов КЖ всех изученных штаммов, хотя для этого требуются разные минимальные концентрации таких углеводов. Агглютинины всех штаммов высокоспецифичны к D-галактозе (кроме NY), D-лактозе, в меньшей степени - D-мальтозе. Отличия штамма NY не ограничиваются отсутствием специфичности его гемагглютининов к D-галактозе, - наблюдается также относительно высокая специфичность к двум N-ацетил-О-гексозаминам. Ингибирующая концентрация углевода минимальна в случае D-лактозы и штамма F-249. Эти величина почти совпадает с ингибирующей концентрацией лактозы для штаммов 0779 и NY, а также с минимальной концентрацией D-галактозы для процесса ингибирования лектиновой активности КЖ штамма F-249. Специфичность к галактозе у других изучаемых штаммов L. edod.es ниже. То есть следует отметить, что в нашем эксперименте наиболее высокая специфичность агглютининов L. edodes проявляется по отношению к трем углеводам, имеющим в своей структуре остатки галактозы и глюкозы. При этом аминопроизводные этих двух моносахаридов весьма малоэффективны в отношении ингибирования реакции ГА лектинов КЖ всех штаммов: минимальная концентрация указанных двух аминосахаров 66,7 мМ. Иначе проявляют себя N-ацетил-аминопроизводные галактозы и глюкозы, но исключительно в отношении внеклеточных лектинов штамма NY: ингибирующие концентрации 4,17 и 16,7 мМ соответственно (в сравнении с концентрациями более 100 мМ в случае штаммов F-249 и 2Т) позволяют говорить о достаточно высокой углеводной специфичности лектинов штамма NY, особенно к ІЧ-ацетил-О-галактозамину (4,17 мМ). В связи с этой штаммоспецифичностью ингибирующего гемагглютинацию углевода следует вспомнить работу Wang с соавторами [Wang et ai, 1999], в результате которой из плодовых тел гриба Lentinus edodes выделен лектин со специфичностью к N-ацетилгалактозамину и N-ацетилглюкозамину и молекулярной массой 43 кДа. Авторы не указывают, к сожалению, какой штамм шиитаке был использован для выделения лектина из плодового тела.
Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение
Исследование влияния низкомолекулярных соединений на рост и развитие съедобных грибов представляет одну из важных областей биохимии и физиологии высших грибов. Одним из актуальных вопросов в связи с продукцией вторичных метаболитов в настоящее время является изучение биосинтетического потенциала грибов и механизмов его регуляции [Козловский и др., 2000]. Известно, что активными факторами воздействия на эти процессы могут быть элементы минерального питания. Показано стимулирующее влияние некоторых микроэлементов, в том числе катионов металлов, на синтез вторичных метаболитов различными грибами [Scott and Gaucher, 1984; Козловский и Соловьева, 1986; Hughes and Poole, 1989; Ловкова и др, 1995; Козловский и др., 2000]. О механизмах их действия на процесс в целом или на его отдельные этапы известно крайне мало. Изучение влияния добавок неорганических солей, образующих двухзарядные катионы металлов, к синтетической среде культивирования Lentinus edodes могло бы иметь значение как для понимания фундаментальных аспектов, связанных с проблемой биосинтеза внеклеточных лектинов, так и для решения прикладных задач.
Поэтому исследование лектиновой активности L. edodes во взаимосвязи с химическим составом среды культивирования мы продолжили с использованием введения в состав синтетических сред катионы металлов (II) в виде солей. Девять металлов(П) выбрали по принципу биологической значимости их катионов для минерального питания грибов. Соли выбранных металлов входят в микроколичествах в состав оптимизированных питательных сред ксилотрофных базидиомицетов [напр., "Высшие ... ", 1983; Бухало, 1988; Дворнина, 1990; Дудка и др., 1992].
При глубинном культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 ммоль/л по углероду): D-глюкоза, L-арабиноза, сахароза; источником азота служил L-аспарагин (10 ммоль/л). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали соли металлов (концентрации 0-10 ммоль/л): MgS047H20, СаС122Н20, MnCl24H20, FeS047H20, CuS045H20, ZnS047H20, СоС126Н20, NiS04 6H20, SnCl2 2H20. Температура выращивания: 26С.
Результаты определения лектиновой активности культуральной жидкости L. edodes F-249 при использовании солей некоторых металлов в степени окисления +2 представляли в виде графиков зависимостей титра гемагглютинации от продолжительности выращивания. Эта последняя величина выбрана в соответствии с полученными нами ранее данными о скорости роста штамма и наступлении стационарной фазы после 21 суток культивирования. Источником азота служил L-аспарагин. Изучаемые концентрации Ме2+ - от 1 до 10 ммоль/л.
На рисунках 3.2-14 — 3.2-21 представлены результаты исследования лектиновой активности культуральной жидкости в процессе выращивания L. edodes F-249 в присутствии катионов Ме2+. Источником азота служил аспарагин. Пример состава соответствующих сред глубинного культивирования приведен в таблице 3.2-3.
Среды выращивания с кальцием (источник углерода — глюкоза (рисунок 3.2-14), сахароза (рисунок 3.2-15), арабиноза (рисунок 3.2-16)) различаются как величинами титров гемагглютинации (максимальные значения составляют 1024 для глюкозы и арабинозы, 256 для сахарозы), так и периодами проявления наибольшей лектиновой активности. Так, титр 1024 наблюдается при содержании Са2+ 1 ммоль/л на 9-е сутки и в период 16-28 суток культивирования в случае глюкозы, но только в интервале 21-28 суток в случае арабинозы. Максимальная лектиновая активность (титр 256) на среде с сахарозой наблюдается лишь на 3-й и Более высокое содержание магния (2 мМ) способствует проявлению наибольшей для среды с этим катионом активности внеклеточных лектинов L. edodes F-249 с титром гемагглютинации культуральной жидкости 1024 в течение самого длительного из вышеупомянутых периода выращивания 13-28 суток (рисунок 3.2-17).
В случае марганца (рисунок 3.2-18), аналогично кальцию, более благоприятна для проявления лектиновой активности 1 мМ концентрация катиона. Возраст культуры 21-28 суток; титр не превышает 512. В единственном случае, на 5-е сутки, эта величина титра соответствует 2 ммоль/л Мп2+.
Интересно, что при использовании в качестве добавки к синтетической среде культивирования L. edodes F-249 двузарядных катионов меди (рисунок 3.2-19) имела место зависимость "лектиновая активность - концентрация Ме2+", противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе. Наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди; титр гемагглютинации 1024 при возрасте культуры 5 и 21-28 суток. И если до 3 суток выращивания оптимальна концентрация 6-8 ммоль/л Си2+ (титр 256 по сравнению с 128 для 10 ммоль/л Си2+), то в течение всего периода культивирования 5-28 суток титр гемагглютинации жидкой среды наиболее высок при 8-10 мМ Си2+. Обсуждаемые выше для других металлов концентрации 1 мМ и 2 мМ в случае Си2+ способствуют проявлению максимальной для этих концентраций лектиновой активности с титром 256 и 512, соответственно, при возрасте культуры 21-28 суток.
Результаты исследования влияния двузарядных катионов железа, цинка, олова, никеля и кобальта на активность внеклеточных лектинов L. edodes F-249 показаны на рисунках 3.2-20 и 3.2-21.
