Введение к работе
Актуальность теми диссертации. Протеолиэ является одним из важнейших биохимических процессов в клетках как животных,так и растений. Протеолитические ферменты участвуют в образовании гормонов .ферментов и других жизненно необходимых активных белков и пептидов (Мосолов,1971,1983; Локшина,1979.1894). Протеаэы участвуют в деградации ~елков при прорастании и их процессинге при созревании, в транспорте веществ из вегетативных органов. Они играют первостепенную роль в формировании таких физиолого-биохими-ческих свойств растений как продуктивность,белковость,всхожесть оемян,валютные реакции и др. Но, к сожалению, многие стороны этих процессов остаются не изученными. В частности, неизвестна роль отдельных эндопепгидаз при катаболизме и биосинтезе белков. Мало данных относительно протеаз,участвующих в глубоком гидролизе белков и в транспорте аминокислот в репродуктивные органы. Недостаточно сведений о протеазах, функционирующих в стареющих листьях. Из важности функций, выполняемых протеазами вытекает и важность вопроса о механизмах регуляции их активности.
Понять механизм действия и регуляцию клеточного протеолиза невозможно без исследования биохимических свойств протеолитичес-ких ферментов и их роли в хизнедеяте.г" кости растительного организма. Предполагается, что один из способов регуляции активности протеаз в клетках животных,растений и микроорганизмов реализуется через белки - ингибиторы,способные обратимо образовывать с ферментами неактивные комплексы ( Мосолов,Валуева,1993; Richardson, 1977). Вопрос регуляции протеолиза - один из актуальнейших в современной энзимологии ( Антонов,1991).
Известно,что в животном организме существует система фермент- ингибитор, контролирующая работу ферментов. Нарушение деятельности этой системы приводит к тяжелым"заболеваниям (Веремеен-ко.1971; Сыновец,Левицкий,1985). В высших же растениях протеинав-но-ингибигорная система не изучена. Не ясна роль этой системы в метаболизме белков и в адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды.Неизвестна роль отдельных компонентов этой системы, в частности, белковых ингибиторов, в регуляции эндоген-
них протеаз в связи с биосинтезом и распадом запасных белков и другими биологически важными процессами,происходящими у растении. Не решена роль протеиназно-ингибиторной системы в способности растений мобилизовать свои защитные силы при действии фитопато-генной инфекции. Не выявлена видовая и сортовая специфичность по уровню активности протеаз и белковых ингибиторов. Это в значительной степени относится к такой высокобелковой и широко распространенной культуре как люпин и другим с.х. растениям.
В свяаи с проблемой пищевого и кормового беліса остро стоит вопрос о белках-ингибиторах как антипитательном факторе.
Выделение протеинаэ и белков-ингибиторов в чистом виде, исследование их физигаэ-химических свойств будет способствовать раскрытию биологических функций указанной системы.
Исследование электрофоретического спектра отдельных компонентов системы протеинаэа-ингибитор раскрывает возможности использования и/, в качестве маркеров в селекции, при выяснении вопросов, связанных с эволюцией и генетикой растений (Кокеров М., 1992).
Изучение биохимических свойств и роли протекназно-ингиОитор-ной системы, несомненно, представляет научный и практический интерес и дает возможность разработать подходы к регулированию процессов прорастания,созревания семян, отложения белка в запас и улучшения его качественного состава. Исследование этих и некоторых других проблем обобщено в предлагаемой диссертации.
Цель и задачи исследования. Целью работы было дать целостное представление о биохимических свойствах и биологических Функциях протеиназно-ингибиторной системы у высших растений и использовать результаты исследования для решения вопросов биохимии,фитоишуии-тета и селекции о.х.культур.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие 8адачи:
- изучить уровни активности протеолитических ферментов, белковых ингибиторов и особенности эдектрофоретического спектра ин-гибиторсодержащей фракции белков генетически различных форм растений и возможности использования их в качестве белковых маркеров в селекции с.х.растений;
-. изучить реакцию протеинавно-ингибиторной системы растений на воздействие неблагоприятных факторов внешней среды;
исследовать роль протеиназно-ингибиторной системы ь процессах катаболизма,биосинтеза запасных белков растений и транспорта азотистых соединений из вегетативных органов в репродуктивные;
выделить белки-ингибиторы протеиназ в высокоочнщенном состоянии из семян и листьев разных видов люпина,исследовать их фи-
. зико-химические свойства, видоспецифичность и локализацию в субклеточных структурах;
выделить эндогенные протеиназы и их белковые ингибиторы из семян и листьев ряда бобовых растений,исследовать их свойства и субстратную специфичность;
исследовать роль белковых ингибиторов в качестве защитного фактора растений от фитопатогенной инфекции;
- белки-ингибиторы протеиназ как показатель качества белка;
Научная новизна. Изучен уровень активности отдельных компо
нентов протеиназно-ингибиторной системы семян и вегетативных ор
ганов разных видов растений. Впервые выявлены различные классы
проїполитических ферментов и белков-ингибиторов в семенах и
листьях различных видов люпина. Впервые исследовано совместное
действие протеиназ и их белковых ингибиторов у высших растений in
vivo. Изучена динамика распада и накопления запасных белков семян
люпина и характер проявления действия различных классов протеаз и
белковых ингибиторов в этих процессах.Показано существование ин
гибиторов в связанной с протеазами формэ в зрелых семенах и выс
вобождение их из этого состояния при прорастании семян. Показана
роль цистеиновых протеиназ в деградации ингибиторов трипсина при
прорастании семян люпина.. Установлена роль белков-ингибиторов в
механизмах регуляции активности протеолигических ферментов при
прорастании и созревании семян.
Впервые установлена возможность регуляции протеиназно-ингибиторной системы на начальных этапах прорастания семян с помощью фитогормонов, в частности брассиностероидов.
Впервые показана роль протеиназно-ингибиторной системы в передвижении азотистых соединении из вегетативных органов в репродуктивные и видоспецифичность взаимосвязи содержания белка в семенах люпина с уровнем активности как протеолитических ферментов,так и белковых ингибиторов в листьях. Впервые обнаружено присутствие в листьях люпина металлопрогеиназы, максимальная актив-
ность' которой отмечена у стареющих листьев,что дает возможность предполагать ее участие в утилизации белковых соединений листьев в этот период.
Из семян и листьев люпина выделена эндогенная протеиназа БА-ПАаэа, один из компонентов протеиназно-ингкбиторной системы, показана принадлежность ее к классу серияовых протеиназ и способность расщеплять некоторые полипептиды *-- к /і- конглютина, большую и малу» суС-ъедикицы рибулозо-1,5~дифосфаткарбоксилазы/окскге-назы.
Впервые выделены,очищены ингибиторы трипсина из семян и листьев различных видов люпина и дана физико-химическая характеристика. На основании анализа аминокислотного состава белков и их биохимических свойств, ингибиторы из семян люпина желтого,белого и узколистного отнесены к семейству ингибитора Кунитца из сои,а из многолетнего - к семейству ингибиторов Баумана-Бирк. Высокая эффективность лгибитора из люпина многолетнего по отношению к трипсину открывает возможности для его практического использования .
Впервые обнаружены белки-ингибиторы эндогекных протеиназ в семенах и листьях бобовых культур ( люпин,кормовые бобы). Полученные данные показывают, что регуляция активности протеолитшес-ких ферментов осуществляется с помощью белковых ингибиторов, а одновременно функционирующие протеиназы и ингибиторы разных органов растений представляют единую протеиназно - ингибиторную систему.
Впервые выявлена локализация различных классов протеиназ и белков-ингибиторов в субклеточных структурах ( хлоропласті;, митохондрии, ядра и др.) ряда бобовых растений.
Впервые установлена способность ингибиторов протеиназ снижать концентрацию Х-вирусов в листьях картофеля, подавлять активность протеинаа.рост и развитие фитопатогенных грибов Fusarium sambucinum и Fusariim oxysporum, что позволяет считать их, наряду с фитоаллекскнами,фенолами и др., одним из факторов устойчивости растений к фитопатогенной инфекции. Это имеет важное значение при созданий сортов и форм растений, устойчивых к фитопатогенкым микроорганизмам. Впервые в растениях люпина,кормовых бобов к картофеля обнаружены эндогенные ингибиторы фитопатогенной инфекции.
Показана отрицательная линейная корреляционная связь между
уровнем активности ингибиторов трипсина и переваримостью белка in vitro, что говорит об их влиянии на качество белка с.х. культур.
Полученные в результате выполнения работы сведения расширяют представление о биохимических свойствах,механизмах действия и Функциях протеинаэ и белковых ингибиторов, что вносит существенный віиіад в развитие нового направления в биохимии, связанного с изучением регуляции метаболизма белков растений. Результатами исследований обоснова j и новое направление в функциональной биохимии растений: протеиназпо - ингибиторная система как средство временной и пространственной регуляции метаболизма белков в растительном организме.
Практическая значимость получетіїп резу^ьтатез.
Результаты анализа действия протегаіазно-ннгибиторной системы, ее активности и электрофоретического спектра позволили установить четкую видовую и сортовую специфичность, что дает возможность использовать ее для анализа генофонда и в селекции с.х. культур. Предложен способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного, защищенный патентом.
Разработан способ получения ингибитора трипсина из семян люпина многолетнего, защищенный авторским свидетельством. Ингибитор трипсина ь.^жет быть использован в биохимических исследованиях при изучении механизма действия сершювых протеинаэ, в аффинной хроматографии в качестве лигавда при очистке ферментов, в медицинской практике для лечения ряда заболеваний.
Установленная способность ингибиторов протеинаэ угнетать активность протеаз,рост и развитие фигопатогенной инфекции даяа возможность разработать способ оценки устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили и способ получения средства для защиты растений, защищенные авторскими свидетельствами.
На основании результатов исследовании по действию неблагоприятных факторов внешней среды на изменение активности протеи-назно-ингибиторной системы предложено использовать показатель активности отдельных компонентов этой системы в качестве теста на техногенные воздействия.
Результаты исследований позволили также впервые использовать показатель активности ингибиторов трипсина в качестве теста при разработке режимов термовструдерной обработки зерна в комбикормовой промышленности. Этот показатель включен в ТУ " Компоненты
-"7 -
зерновые вструдированные" к используются в АКО " ЭКОМОЛ".
Материалы исследований находят также применение ь селекционных учреждениях и при чтении лекций по биохимии и физиологии растений в БГУ.
Экономическая значимость полученных результатов.
Препараты протеиназ, белков-ингибиторов трипсина и суммарного белка семян люпина могут быть использованы в качесгве коммерческих продуктов.
Основні*? положення диссертации, выносимые на защиту. . - видовая и сортовая специфичность протеиназно-ингибиторной системы ряда высших растений;
основные компоненты системы обеспечивают временную и пространственную организацию деградации и биосинтеза белков в ходе роста и развития растений;
сопряженность между накоплением белка в семенах и листьях разных видов липина и активностью элементов протеиназно-ингибиторной системы;
разработка способов получения препаратов протеиназ и белковых ингибиторов из семян и листьев люпина для изучения их физико-химических свойств и специфичности;
внутриклеточная компартментация протеиназ и белков-ингибиторов некоторых бобовых растений;
схема этапов действия протеиназно-ингибиторной системы высших растений;
белки как специфические ингибиторы эндогенных протеиназ;
протеиназно-ингибиторная система как фактор фитсиммунктета;
ингибиторы трипсина как антипитательный фактор "и термовструдирование как способ повышения качества белка семян сельскохозяйственных растений.
Апробация результатов диссертации.
Основные результаты работы были представлены и обсуждены на У1 конференции биохимиков Прибалтийских республик,Беларуси и Ленинграда (Рига, 1981 г.); на 111 Республиканской конференции физиологов и биохимиков Молдавии (Кишинев,1981); на Республиканской конференции " Научно- методические аспекты создания высокопродуктивных сортов с.х. культур" (Жодино.1982); на У111 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР ( Рига,1985); на Республиканской совещаний "Ингибиторы протеаз как факторы защиты
растений от болезней и вредителей" ( Одесса, 1987); на Всесоюзном совещании " Физиология и биохимия прорастания семян" (Душанбе, 1988); на 1 и 11 съездах физиологов растений (Минск,1990, Санкт-Петербург,1993); на ХУ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( Минск, 1993); на 1 съезде фотобиологов и биофизиков (Минск,1994); на Республиканской научной конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск,1995),на Международном совещании "Экологический статус загрязненных радионуклидами территорий" (Минск,1995), на 11 съезде Белорусского общества физиологов растений (Шнек. 1995), на 8-й Международной конференции по люпину (Нью-Йорк,1996).
Опубликовалиость результатов.
Материалы диссертации опубликованы в 66 научных работах (2 монографиях,31 научной статье, 29 тезисах, трех авторских свидетельствах и одном патенте).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста,состоит из введения,8 глав и приложения. Работа иллюстрирована 84 таблицами и 91 рисунком; в списке цитируемой литературы 490 наименований.
Принятые сокраа*ения. ПААГ- полиакриламидный гель.ОЭП- относительная электрофоретическая подвк ность, РДФК/0 - рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза/оксигеназа, кД- килодальтон,БАЛА - N^--бензоил- DL-аргинин-п-нитроанилид, БАЗЭ - ^- бенэоил-БЬ-аргинин этиловый'эфир, ОМСФ - фенилметилсульфонилфторид, ПХМВ - п-хлормер-курибензоат.КГ - круговой дихроизм,НЕ - ингибиторная единица, НЖ -над осадочная жидкость.
