Введение к работе
Актуальность темы данной работы определяется пЪе~жде_ acerb ее
направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, пектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения. Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны.
Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество. Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс. видов. Промышленное производство высших грибов ео многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль.
Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества. В настоящее время известно большое количество видов базидиальных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ. К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения дополнительного источника белка, биологически активных соединений безусловно относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes.
Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения. При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворника, 1990].
Исследования роста базидиомицетов, в том числе L. edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994]. Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989]. Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. В частности, пектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектиков в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке. исследование пектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных
особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными.
Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов. взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс; с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов). Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы - компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы.
Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций. Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гл и ко протеи нов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфо генетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование.
Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes и условий проявления их биологической активности.
Задачи исследования:
-
Провести скрининг штаммов Lentinus edodes на присутствие лектинов.
-
Выделить внеклеточные лектины L. edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность.
3. Изучить зависимость лектиновой активности культуры L edodes от
условий выращивания. Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с
целью получения максимальной лектиновой активности. Разработать способ
получения экзолектинов L, edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов.
4. Исследовать влияние катионов металлов(Н) на активность внеклеточных
лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой химии и QSAR.
5. Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую
активность L edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.
-
Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L. edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре.
-
Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры.
-
Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (Se-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов).
9. Исследовать биологические свойства лектинов: их способность к
взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами
эритроцитов; антигенные свойства.
10. Изучить возможности использования глубинной культуры L. edodes при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически перспективного посевного материала.
Научная новизна работы
Впервые в культурапьной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.
Выделены чистые препараты лектинов из культурапьной жидкости L edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность лектиноеых препаратов.
Впервые показано, что максимальное повышение внеклеточной пектиновой активности базидиомицета наблюдается при условиях, отличных от оптимальных для выращивания культуры.
Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.
Впервые обнаружен и выделен необычный для ма к ро базидиомицетов гликолипид моносахарид кой природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке.
Впервые выявлено взаимодействие лектинов ксилотрофного базидиомицета с фитогормоном ИУК, сопровождающееся значительным увеличением лектиновой активности в системе "лектин-ИУК".
Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиологе-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах.
Практическая значимость исследования
Работа вносит вклад в развитие направления лектинологии, связанного с изучением лектинов высших грибов, в рамках которого положено начало новой области исследования препаратов внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов.
Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов. Разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению. Выявлены низкомолекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными пектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями -антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гем агглютинации; некоторые антигенные свойства. Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии.
На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие характерной для данного вида коричневой мицелиальной
пленки. Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по пектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе ллодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли л ип идо в в процессе морфогенеза.
Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в создание эффективного способа получения посевного мицелия шиитаке.
Материалы работы « препараты лектинов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе химического факультета С ГУ, СВИРХБЗ. лаборатории микробиологии Института микробиологии НАН Беларуси.
По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы по заявке № 2005121033/13(023786). Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).
Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными а Приложении к диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту
-
В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentfnus edodes присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.
-
Культура L edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений.
-
Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L, edodes зависят от физико-химических условий культивирования. Наиболее значимыми факторами, влияющими на пектиновую активность глубинной культуры L. edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных источников азота, катионов металлов(И), селена s органической форме,
-
При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение пектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адэп то генной ролью лектинов L. edodes.
-
Лектины L. edodes принимают участие в морфогенетических процессах культуры. Установлена взаимосвязь внеклеточной пектиновой активности шиитаке с формированием коричневой мицелиальнои пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия — л или дам и углеводам.
-
Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L. edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолипид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L. edodes.
-
Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L. edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксид анты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий.
8, Лектины L edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом
значительно увеличивается лектмновая активность в системе "лектин-ИУК". Продукты
взаимодействия с ИУК дпя двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую
природу.
9. Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке
на основе дифференциации хром а то графических характеристик и усиления
биосинтеза одного из лектинов является воздействие Си(II).
Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина), "Роль угле вод связывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина),
Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией — к.х.н. Е.Е Федоров), с лабораторией биохимии (зав. лабораторией в период выполнения исследований - д.б.н. В .В. Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского {СГУ), при непосредственном участии д.х.н., профессора А.Н. Панкратова; на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав. кафедрой -д.х.н., профессор А.П. Кривенько).
Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (NsNa проектов 03-04-48129, 06-04-81042-Бел_а), Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (государственный контракт Na 02.444.11,7331), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине* в рамках совместного проекта ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г. Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на: 37th IUPAC Congr. Frontiers in Chemistry: Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug. 14-19, 1999); науч. конфер. "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии* (Саратов, 1999); 5th World Congr, of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug., 1999); 1-й регион, конфер. мол, ученых (Саратов, 26-27 марта 2002); Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002); межд. науч. конфер. "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов); IV Всерос. конфер. мол. ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003); Int. Symp. "Biochemicat Interactions of Microorganisms and Plants with Technogertic Environmental Pollutants" (Saratov, 28-30 July, 2003); VIII tnt. Conf, The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003); 8-й Межд. Пущинской школе-конфер, мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004); III Всерос. школе-конфер. "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов); II Российской школе-конфер. "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине* (Саратов, 13-16 октября 2004); Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва. 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практич. конфер. "Вавиловские чтения - 2004" (Саратов, 24-26 ноября
2004); II Всерос. симп. "Тест-методы химического анализа* (Саратов, 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд, Путинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005); Межд. конфер. "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября 2005); Всерос. конфер. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты* (Саратов, 15-17 июня 2005); V Всерос. конфер. мол, ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 22-24 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysls-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); II Межд, симп. "Разделение и концентрирование а аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005); 10-й Путинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006); 4-м Всерос, Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); Межд. науч. конфер. "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006); Межд. науч. конфер. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006); Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006): 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); 4-й Росс, конфер. "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов* (Москва, 4-5 июня 2007); VI Всерос. интерактивной конфер, мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежит идея, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов.
Благодарности
Следует отметить вклад в выполнение данной работы д.б.н., зав. лабораторией В.Е. Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lenttnus edodes и лектины этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды. Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В.Е. Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы.
Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация - невозможна, без сотрудничества с д.х.н., профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им. Н.Г, Чернышевского А.Н. Панкратовым,
Публикации
По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 38 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в рецензируемых иностранных изданиях и российских журналах, входящих в "Перечень периодических
научных изданий, рекомендуемых ВАК ...*, 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения. Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований.
Работа изложена на 353 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 55 рисунками и 54 таблицами. Список цитируемой литературы включает 519 источников (отечественных и зарубежных).