Введение к работе
Актуальность проблемы. Подавляющая часть терминальных внутриклеточных окислительно-восстановительных превращений протекает на биологических мембранах, где локализованы оксидоре-дуктазы, использующие в качестве акцептора электронов молекулярный кислород. Б тканях животных терминальные оксидоредук-тазы представлены главным образом медьсодержащими ферментами: в митохондриях таким ферментом является вдтохроы с оксидаза (К.Ф.1.9.3.1), в хромаффинных гранулах, везикулах норадренэр-гических и адренэргических нейронов роль терминальной системы выполняет дофамин f-монооксигеназа СК.Ф. I.I4.I7.I), в секреторных гранулах многих эндокринных и нейроэндокринных тканей процессинг пептидных гормонов сопровождается редокс превращениями меди пептидилглицин <*-амидирущей монооксигеназы (К.Ф. I.14.17.3). Терминальные реакции восстановления молекулярного кислорода, сопряженного с синтезом АТР, образования нейроме-диатора и горюна, норадреналина, и <х-амидированных пептидных гормонов, катализируемые соответственно цитохромоксидазой (ЦО), дофами: f-монооксигеназой 1ДБМ) и пептидилглицин оС-ами-дирующей монооксигеназой (ПТАМ), представляют вачснеііше биохимические процессы в организме.
Информация о функциональных особенностях, молекулярной структуре и строении активных центров ГІГАМ, ДБИ и ЦО, а также механизмах реакций, катализируемых этими оксидоредуктазаш, не одинакова и отражает как сложность фермента и катализируемой ям реакции, так и продолжительность времени, в течение которого фермент находится в центре внимания исследователей.
ПГАМ, обнаруженная в 1982 г. (Braabury et аі., 1982), в настоящее время выделена из секреторных гранул многих типов (Шароян, Налбандян, 1988; Emeson, 1984; Conway et аі., 1985; Murthy et аі., 1986; bleng, Isou, 1988). Однако к началу наших исследований были очищены и частично охарактеризованы лишь препараты фермента из передней и промежуточной долей гипофиза крупного рогатого скота (Glembotski, 1985; Murthy et аі., 1986), гипофиза свиньи (Kizer et аі., 1986), а также кожи лягушки Ouizuno et аі., 1986) и было сообщено о наличии- активности ПГАМ в гомогенатах предсердной тка-
- 2 -ни крысы (sakata etai., 1986), тогда как активность фермента в медулле надпочечников не была обнаружена. Кроме того, из данных, полученных для передней и промежуточной долей гипофиза, следовало, что практически вся ПГАМ в секреторных гранулах находится В Р-фОрме (Glembotski et al., 1984; Murthy et al., 1986), существование М-формы фермента не было установлено.
Как показано для ДШ, фермент в хромаффинных гранулах и нейрональных везикулах находится в двух формах - мембраносвя-занной и растворимой, однако соотношение этих форм,по данным разных авторов, варьирует ( Viveros et al., 1969; Hortnagl et al., 1972; Kuzuya, Nagatsu, 1972; Baerrum et al., 1979; Stewart, Klinman, 1988). He выяснена также функциональная и структурная взаимосвязь этих форм. Кроме того, сведения об' общем содержании атомов меди фермента и атомах, участвущих в каталитическом акте, довольно противоречивы (Blackburn et al., 1980; Ash, 1984; Klinman et al., 1984; Syversten et al., 1987).
В литературе сообщалось об эндогенных медьзависимых ингибиторах ДШ и ПГАМ (йшЪЪ et al., 1969; Belpaire, Laduron, 1970; Lander, Austin, 1976; Elpper et al., 1983; Glembotski et al., 1984), природа которых однако не была установлена. Несомненно идентификация этих ингибиторов является очень важной.
Как известно, реакция восстановления молекулярного кислорода оксидоредунтазаш может протекать в несколько стадий с образованием промежуточных форм кислорода разной степени восстановленное ти. Так, для ЦО реакции установлено, что перенос 4-х электронов, необходимых для полного восстановления кислорода, сопровождается образованием "короткоживущих" промежуточных соединений, представляющих комплекс кислорода разной степени восстановленное с ферментом (chance et al., 1975). Таким образом, проблема изучения механизма реакции восстановления кислорода ЦО заключается в обнаружении и идентификации промежуточных форм кислорода и выявлении изменений структуры участка фермента, с которым связан кислород. Сведений о способности ЦО утилизировать промежуточные формы восстановления кислорода до начала наших исследований не было.
В связи с высокой скоростью реакции восстановления кислорода ЦО в физиологических условиях изучение механизма реакции проводится в основном при помощи низкотемпературных кинетик с использованием быстрорегистрирующей аппаратура. Применение ингибиторов ЦО, взаимодействующих с кислородсвязывающим участком фермента и продлевающих "время жизни" промежуточных соединений, представляет подход, который также может способствовать изучению механизма реакции.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выяснению вопросов, связанных с функциональными особенностями, строением и свойствами терминальных медьсодержащих оксидоре-дуктаз, ПГАМ, ДБМ и ЦО, а также роли атомов меда в активных центрах этих ферлентов в реакции восстановления кислорода. В частности в задачи исследования входило:
-
Поиск М- и Р-форм ПГАМ в секреторных гранулах предсердий и хромаффинннх гранулах надпочечников крупного рогатого скота.
-
Разработка методов выделения М- и Р-форм ПГАМ из секреторных гранул предсердий и одновременного выделения М- и Р-форм ПГАМ и ДБМ из хромаффинных гранул. Определение количественного соотношения М- и Р-форм этих ферментов, выявление факторов, влияющих на это соотношение. ;.;.'
-
Характернети~ч физико-химических и каталитических свойств препаратов ЯГАМ, ДБМ и ЦО (для ДБМ и ПГАМ сравнительная характеристика М- и Р-форм).
-
Реконструкция апоформ ПГАМ и ДБМ ионами металлов.
-
Выявление возможности переноса меди между монооксигена-зами (ПГАМ и ДБМ) и другими медьсодержащими белками. Идентификация эндогенных медьзависидах ингибиторов ПГАМ и ДБМ.
-
Изучение особенностей реакции восстановления кислорода ЦО. Выявление способности ЦО утилизировать помимо молекулярного кислорода промежуточные формы восстановления кислорода. Использование соединений азота разной степени восстановленно-сти для выявления промежуточных форм не полностью восстановленного кислорода. Изучение влияния азотсодержащих соединений на физико-химические свойства фермента.
Научная новизна работы. Обнаружены М- и Р-формы ПГАМ в сек-
_ 4 -реторных гранулах предсердий и хроыаффинных гранулах надпочечников. Разработаны методи одновременного выделения из хромаффинннх гранул препаратов М- и Р-фор\ч двух монооксигеназ, ИГАМ и ДБМ, и медьсодержащего белка - нейрокупреина и из секреторных гранул предсердий - препаратов М- и Р-форм ПГАМ, а также нейрокупреина, впервые обнаруженного нами в этих гранулах. Установлено количественное соотношение М- и Р-форм этих ферментов, выявлены факторы, влияющие на переход М-форм в растворимое состояние. Впервые из секреторных гранул предсердий и хромаффинннх гранул надпочечников получены препараты Р-формы ПГАМ в электрофоретически гомогенном состоянии. Показана близость каталитических свойств для препаратов М- и Р-форм ПГАМ и М- и Р-фори ДБМ. Впервые проведено исследование окружения меди в активном центре ПГАМ. Установлено, что медь в ПГАМ так же, как и в ДБМ относится к типу 2. Выявлена аналогичность антигенных свойств ПГАМ и ДБМ. Обнаружено, что ферментативные активности ПГАМ и ДБМ ингибируются апоформой нейрокупреина, медьсодержащего белка, содержащегося в секреторных гранулах различных эндокринных тканей. Установлено, что инги-бирование апоформой нейрокупреина связано с хелатированием меди этих ферментов. Обнаружено, что единственных.! металлом, кроме меди, способным реактивировать апофорыу ДБМ, является ванадий, находящийся в виде ионов ванадила. Впервые продемонстрирована возможность переноса меди между ДБМ и Си-тионеи-ном'. Выявлены факторы, влияющие на перенос меди от Си-тионе~ ина к ДБМ и в обратном направлении, от ДБМ к тионеину.
Обнаружена СОД активность у препаратов ЦО. Установлено,что за СОД активность ЦО ответственны атомы меди фермента. Предполагается функциональное значение СОД активности ЦО.
Обнарумены нитритоксидазная и гидразиноксндазная активности ЦО. Впервые показано, что нитрит и гидразин взаимодейст-' вуют с кислородсвязывающим участком ЦО, выступая одновременно как доноры электронов и ингибиторы ЦО реакции. В присутствии нитрита и гидразина установлено образование довольно стабильных форм фермента, обычно наблюдающихся в ходе реакции восстановления молекулярного кислорода ЦО при низкотемпературных кинетиках. Обнаружено, что в окружении атома меди кислород-
связывающего участка ЦО находится кислород даже в условиях, рассматриваемых как строго анаэробные.
Научно-практическое значение работы. Проведенное исследование оксвдоредуктаз, ПГАМ, ДБМ и ЦО, представляет фундаментальный вклад в область изучения медьсодержащих ферментов.
Выявление роли нейрокупреина.содержащегося в гранулах,сек-ретирущих пептидные гормоны и КА, как ингибитора моноокси-геназ, ПГАМ и ДБМ, установление характера ингибирования имеет важное значение для понимания механизма регуляции процес-синга этих гормонов. Нейрокупреин как регулятор ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ может иметь применение при терапии психических заболеваний, связанных с нарушениями обмена ыеди в организме. Изучение переноса меди между ДБМ и медной формой тиойеина важно для понимания физиологической роли Си -тионеина как ингибитора или активатора медьсодержащих ферментов. Обнаружение способности ионов ванадила реактивировать апоформу ДБМ полезно с точки зрения изучения возможной роли ванадия в живых организмах. Предложенный метод выделения и очистки ПГАМ из секреторных гранул предсердий и хромаффйнных гранул надпочечников может быть использован для выделения этого фермента из секреторных гранул других эндокринных и нейрозндокрянных тканей. Обнаружение СОД активности у ВД.;. важно с точки зрения выявления функциональных особенностей ЦО. Данные по влиянию некоторых азотсодержащих соединений на ЦО реакцию и свойства фермента могут способствовать изучению, механизма реакции восстановления молекулярного кислорода ЦО.
На основании результатов исследования влияния на ЦО азотсодержащих соединений, используемых в медицине и народном хозяйстве, можно судить о токсичности этих соединений для организма человека. Результаты исследования влияния нитропруссида на ЦО, направленные на выявление токсического действия этого препарата на дыхание (реакцию восстановления молекулярного кислорода ЦО), позволяют обосновать дозировку этого препарата при внутривенном введении (внедрено в практику в отделе реанимации и интенсивной терапии Ереванского филиала ВНЦХ с 20.03.1984г.). На основании данных, полученных при исследовании влияния производных гидразина (регуляторов роста расте-
ний) на ферментативную активность ЦО, предложено рассматривать ЦО как экспериментальную модель для ускоренного прогнозирования токсичности соединений азота (внедрено в лаборатории общей токсикологии Ереванского филиала ВНШГИНТОКС с 1987г.). Основные положения, выносимые на защиту.
-
Существование в секреторных гранулах предсердий и хро-маффинных гранулах надпочечников М- и Р-форм ПГАМ. Зависимость соотношения М- и Р-форм ПГАМ и М- и Р-форм ДБЫ от экспериментальных условий, роль протекторов при выделении и лизи-ровании гранул.
-
Аналогичность антигенных свойств и окружения атомов меди в активных центрах ПГАМ из предсердных гранул и хромаффин-ных гранул и ДБМ из хромаффинных гранул.
-
Роль атомов меди для ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ. Возможность реактивации апофорлы ДБМ ионами ванадила.
-
Ингибирование ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ апоформой нейрокупреина. Нейрокупреин как возможный эндогенный белковый регулятор процессинга пептидных гормонов и нор-адреналина.
-
Обнаруженная СОД активность у препаратов ЦО связана с атомами меди фермента. СОД активность ЦО монет иметь функциональное значение.
-
Использование нитрита и гидразина, взаимодействующих с кислородсвязыващиы участком ЦО и являющихся одновременно восстановителями и ингибиторами ЦО, для изучения механизма реакции восстановления кислорода ферментом.
-
ЦО как экспериментальная модель для определения токсичности азотсодержащих соединений.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Ш Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции активных центров ферментов" (Москва, 1976); Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1977, 1989); ІУ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Шнек, 1977); ХП Конференции ФЕБО (Дрезден, 1978); I Всесоюзной конференции по кровоснабжению, метаболизму и функции органов при реконструктивных операциях (Ереван, 1979); П Закавказской конференции по применению радиоспектроскопии в химии, физике и
- 7 -биологии (Ереван, 1979); X меадународном конгрессе кардиологов (Москва, 1980); Ш Республиканской сессии по вопросам биофизики (Ереван, 1982); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Всесоюзной конференции по химии и биохимии порфи-ринов (Самарканд, 1982); Объединенном симпозиуме биохимических обществ ГДР и СССР "Окислительный метаболизм, гликолиз и АТР" (Лейпциг, 1983); I Всесоюзной конференции по переносу электрона в белковых системах (Вильнюс, 1985); ХП Конференции международного общества нейрохимиков іАлгарви, Португалия, 1989). Диссертационная работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии АН АрлССР 22 июня 1989 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 32 работы в отечественных и международных изданиях. На основании результатов исследований получено два акта о внедрении.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 281 странице машинописного текста, включая 10 таблиц и 70 рисунков. Список цитированной литературы содержит 530 наименований.
Список сокращений, использованных в автореферате: БГФ -большая гранулярная фракция, ДДТК - диэтялдитиокарбамат, ДСН - додецилсульфат натрия, ДЭАЭ - диэтилаииноэтил, КА -катехоламинн, М - мембранный (ая), Ю - 2-ыеркаптоэтанол, ПААГ - полиакриламидный гель, Р - растворимый (ая), СМ -субмитохондриальные частицы, ТЕС - N -трнс(гидроксилметил) метил-2-аминоэтансулъфоновая кислота, ФМСФ - фенилметилсуль-фонилфторид, ЦШ - цетилпиридиний хлористый.
