Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Общие представления о процессе фотосинтеза растений 10
1.1.1. Организация фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений 15
1.1.2. Мембранный комплекс фотосистемы 2 16
1.1.3. Мембранный комплекс фотосистемы 1 24
1.1.4. Переносчики фотосинтетической электрон-транспортной цепи хлоропластов 28
1.1.5. Пластохиноны - подвижные переносчики электронов фотосинтетической электрон транспортной цепи 30
1.2. Кислород и активные формы кислорода 35
1.2.1. Синглетный кислород 37
1.2.2. Супероксидный анион-радикал 40
1.2.3. Пероксид водорода 44
1.2.4. Гидроксильный радикал 45
1.2.5. Липидные пероксиды 47
1.3. Образование активных форм кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи высших растений 48
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 56
2.1. Выделение тилакоидов 56
2.2. Измерение скорости выделения или поглощения кислорода в суспензии тилакоидов 57
2.3. Измерение флуоресценции хлорофилла тилакоидов 57
2.4. Измерение восстановления цитохрома С в тилакоидах 58
2.5. Измерение изменений окислительно-восстановительного состояния цитохрома/в тилакоидах 58
2.6. Измерение окисления пула пластохинона после выключения света 58
2.7. Освещение 59
2.8. Измерение концентрации хлорофилла 59
2.9. Создание анаэробных условий 59
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Характеристика восстановления кислорода в пуле пластохинона в присутствии ДНФ-ИНТ, ингибитора окисления пластогидрохинона цитохромным комплексом 60
3.2. Внутритилакоидное образование пероксида водорода при функционировании полной фотосинтетической электрон-транспортной цепи и его количественная оценка 66
3.2.1. Образование пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны 66
3.2.2. Возможные причины образования пероксида водорода в присутствии цитохрома 72
3.2.3. Влияние интенсивности света на количество электронов, участвующих в образовании пероксида водорода внутри тилакоидной мембраны 78
3.3. Участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи 81
3.3.1. Влияние интенсивности света на скорости поглощения кислорода при функционировании полной фотосинтетической электрон-транспортной цепи и при ингибировании физиологического пути окисления пула пластохинона 81
3.3.2. Влияние интенсивности света на участие пула пластохинона в восстановлении кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи 84
3.4. Окисление пула пластохинона после выключения света 90
Заключение. Схема восстановления кислорода в
фотосинтетической электрон-транспортной цепи 102
Выводы 104
Литература 106
- Общие представления о процессе фотосинтеза растений
- Супероксидный анион-радикал
- Характеристика восстановления кислорода в пуле пластохинона в присутствии ДНФ-ИНТ, ингибитора окисления пластогидрохинона цитохромным комплексом
- Возможные причины образования пероксида водорода в присутствии цитохрома
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема восстановления кислорода в фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ФЭТЦ) хлоропластов высших растений и водорослей возникла после открытия этого явления Мелером (Mehler, 1951). По мере выяснения состава переносчиков ФЭТЦ и ее структуры становилось все более очевидным, что перенос электронов, поступивших в ФЭТЦ от воды, на кислород - явление неизбежное в кислородной атмосфере Земли: часть переносчиков ФЭТЦ обладают достаточно низкими окислительно-восстановительными потенциалами, чтобы восстановить молекулу (. За эти годы не раз менялись представления об основной роли, которую этот процесс может играть в хлоропластах. В результате восстановления 02 продуцируются активные формы кислорода (АФК), такие как супероксидный анион-радикал, 02"~, и пероксид водорода, Н202, которые могут играть деструктивную роль. Считается, что в результате переноса электронов на кислород поддерживается электронный транспорт, ведущий к аккумуляции протонов в люмене тилакоидов, обеспечивающей как синтез АТФ, не сопряженный с восстановлением НАДФ , так и стимуляцию процессов, ведущих к диссипации энергии в антенне (виолаксантиновый цикл); а также происходит окисление переносчиков ФЭТЦ, предотвращающее фотоингибирование и обеспечивающее протекание циклического электронного транспорта вокруг Фотосистемы 1 (ФС1). В последние годы основное внимание уделяется возможной сигнальной функции этого процесса, когда АФК, образующиеся в ФЭТЦ, передают информацию о состоянии ФЭТЦ системам регуляции.
Возможно, что каждая из выше перечисленных функций важна в тех или иных условиях жизни растений. Однако если до сих пор нет общепринятого мнения о реальной важности этих функций, то, прежде всего, потому, что остается неизвестным механизм самого процесса. Довольно рано сложилось представление, что основными восстановителями кислорода в ФЭТЦ выступают компоненты акцепторной части ФС1, которые имеют самые низкие окислительно-восстановительные потенциалы среди переносчиков ФЭТЦ. Существенную роль в восстановлении кислорода приписывали растворимому железо-серному акцептору — ферредоксину, пока не было выяснено, что константа скорости его окисления кислородом невелика. Предполагалось, что восстановление кислорода с образованием АФК происходит и на акцепторной стороне Фотосистемы 2 (ФС2). Одним из вероятных кандидатов является восстановленная молекула феофитина, первичного акцептора электрона в ФС2 (Клеваник с соавт., 1977). Время жизни этого состояния мало при ненасыщенном фотосинтезе, около 200 пс (Shuvalov et al., 1980; Nuijs et al., ] 986). Однако, при восстановлении пластохинона (ПХ) происходит накопление анион-радикала феофитин", который может окисляться кислородом (Klimov et al., 1985). Тем не менее, было выяснено, что восстановление кислорода в ФС2 невелико (окислительно-восстановительные потенциалы однократно-восстановленных терминальных акцепторов in situ выше (Petrouleas, Diner, 1987), чем окислительно-восстановительный потенциал пары 0210г~) и возрастает только при нарушении целостности тилакоидной мембраны (Хоробрых с соавт., 2002). Возможность восстановления кислорода в пуле пластохинона не отрицалась, но отсутствие экспериментальных, данных долгое время не позволяло оценить вклад этого переносчика в восстановление кислорода в ФЭТЦ. С другой стороны, весьма близкий к ГГХ компонент электрон-транспортной цепи митохондрий, убихинон, уже давно рассматривали как главный продуцент АФК в этих органеллах. Первые убедительные данные о восстановлении кислорода в пуле пластохинона тилакоидов были получены в нашей лаборатории (Khorobrykh, Ivanov, 2002). Были исследованы рН-зависимости этого процесса. Показано, что происходит одноэлектронное восстановление молекул 02 и что непосредственным восстановителем служит пластосемихинон, ПХ"~ Однако, многие вопросы остались невыясненными. В какие реакции может вступать супероксид, возникший в пуле пластохинона? Какой вклад в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ может вносить пул пластохинона в разных условиях функционирования ФЭТЦ? Как влияет участие пула пластохинона в восстановлении кислорода на функционирование других компонентов ФЭТЦ? Знание механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода имеет наибольшее значение для понимания хронологически последней из приписываемых этому процессу функций, а именно, продукции АФК как сигнальных молекул. Предположено, что пул пластохинона является частью механизма поддержания баланса между накоплением и детоксикацией АФК (Maciejewskau et al., 2002). В настоящее время известно (Allen, 2002), что окислительно-восстановительное состояние этого пула инициирует целый ряд регуляторных процессов в клетках растений, в частности, активирует работу как хлоропластных, так и ядерных генов. Было высказано предположение, что АФК, образующиеся в пуле пластохинона, могут служить сигналом о состоянии ФЭТЦ системам экспрессии генов (Ivanov, Khorobrykh, 2003).
Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в установлении механизма участия пула пластохинона в восстановлении кислорода в ФЭТЦ. Для достижения этой цели в ходе выполнения диссертационной работы решались следующие задачи:
Исследовать характеристики восстановления кислорода в пуле пластохинона при ингибировании переноса электронов от пула пластохинона к ФС1;
Установить вклад пула пластохинона в восстановление кислорода в ФЭТЦ;
Выяснить участие пула пластохинона в образовании конечного продукта восстановления кислорода в тилакоидах, Н202;
Исследовать характеристики окисления пула пластохинона в условиях восстановления кислорода в ФЭТЦ.
Научная новизна работы. Впервые был оценен вклад пула пластохинона в общее восстановление кислорода в ФЭТЦ. Было показано, что участие пула пластохинона в восстановлении кислорода зависит от интенсивности света и при высокой интенсивности света составляет 50-70 % от общего восстановления кислорода в ФЭТЦ. Новым результатом, полученным в ходе выполнения работы, является доказательство того, что образование пероксида водорода в ходе восстановления кислорода частично происходит внутри тилакоидной мембраны. При этом с увеличением интенсивности света относительный вклад внутритилакоидного образования пероксида водорода в суммарное образование Н202 увеличивается. Как результат обобщения полученных экспериментальных данных предложена модифицированная схема функционирования ФЭТЦ, которая включает реакции переноса электрона с участием молекул кислорода и супероксида.
Практическая значимость работы. Полученные в диссертационной работе данные позволяют по-новому представить функционирование ФЭТЦ высших растений в кислородной атмосфере, что весьма важно для понимания механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу.
Исследование участия пула пластохинона в восстановлении кислорода позволяет лучше понять аытиоксидантные функции хинонов в растительных тканях. Учитывая, что АФК выступают как универсальные сигнальные молекулы в клетках в условиях стресса, от которых напрямую зависит функционирование ФЭТЦ, детальное знание механизмов образования АФК в ФЭТЦ важно для направленного конструирования генома растений, более устойчивых к изменениям окружающей среды.
Общие представления о процессе фотосинтеза растений
Более 200 лет назад в опытах Джозефа Пристли было обнаружено, что растения способны выделять кислород. В настоящее время считается общепризнанным, что фотосинтез является основным источником кислорода в атмосфере земли, а также основным источником органических веществ на Земле,
В 1941 г. в лаборатории А.П. Виноградова, а также в лаборатории Рубена и Камена с помощью изотопного метода было установлено, что кислород выделяется из молекул воды. В результате исследований многих лабораторий было найдено, что реакция разложения воды и реакция ассимиляции углекислого газа происходят в хлоропластах растительной клетки, но разделены между собой. В хлоропластах высших растений в бесцветной строме внутренние мембраны образуют тилакоиды, которые либо тесно соприкасаются друг с другом и уложены в стопки, или граны (тилакоиды гран), либо принизывают строму, соединяя граны между собой (тилакоиды стромы)(рис. 1). Тилакоиды гран состоят из близко расположенных мембран толщиной -90 А, разделенных щелевидным пространством (Miilethaler, 1971). Мембраны образуются липидами типа галактозилдиглицеридов, дигалактозилглицеридов и сульфолипидов (Мецлер, 1980). В толщу мембраны тилакоида погружены РЦ, светособирающие комплексы и компоненты цепи переноса электрона. Комплексы ФС1 расположены по всей площади гранальных тилакоидов, включая области стыковки. Концентрация комплексов ФС1 уменьшается в направлении от краевых участков к центру гранального тилакоида. На краях гранальных тилакоидов присутствуют несвязанные комплексы ФС1, в центре гран свободные, несвязанные комплексы ФС1 отсутствуют. В гранальных тилакоидах присутствуют связанные состояния ФС1-ФС2, причем концентрация таких ассоциатов неравномерна по мембране и зависит от парциальных концентраций комплексов. Неоднородность распределения связанных состояний ФС1-ФС2 указывает на положительный градиент в направление к центру граны. Образование гранальной структуры внутри хлоропластов значительно повышает общую эффективность фотосинтеза и создает дополнительные возможности для регуляции световых реакций. Разложение воды тесно связано с реакцией фотохимического переноса электрона в так называемых реакционных центрах фотосинтеза, а также с работой цепи переносчиков электрона, находящихся внутри мембран хлоропласта. В результате отрыва электрона от воды происходит восстановление никотинамидадениннуклеотидфосфата (НАДФ+) до НАДФН, а также синтез молекул аденозинтрифосфата (АТФ). Далее молекулы НАДФН и АТФ участвуют в цикле Кальвина, приводящем к ассимиляции углекислого газа и синтезу углеводов.
Наличие двух фотосистем в зеленых растениях было установлено в опытах Эмерсона с соавт. (Emerson et al., 1957). Было обнаружено, что пучки света с длинами волн 650 и 700 нм при их одновременном действии обуславливают более высокую скорость фотосинтеза, чем получающуюся при сложении скоростей для каждого их них, действующего в отдельности. Как позже было показано, две фотохимические системы: коротковолновая (фотосистема 2) и длинноволновая (фотосистема 1) содержат два разных типа реакционных центров с пигментами Р680 и Р700 соответственно, причем Р680, поглощающий свет при 680 нм, не способен возбуждаться светом при 700 нм. В результате этих и других экспериментов было сформулировано впервые Хиллом и Беидалем понятие «Z-схема фотосинтеза». Согласно принципу работы Z-схемы фотосинтеза, электрон от воды поднимается против термодинамического градиента при поглощении двух квантов света последовательно двумя фотосистемами (рис. 2).
Биохимическое разделение двух фотосистем (Anderson, Boardman, 1966) наглядно показало реальное их существование, а также разделение компонентов транспорта электрона между этими фотосистемами. Фотосистема 2 (ФС2) ответственна за реакцию разложения воды, для протекания которой необходимы ионы Mn (Cheniae, Martin, 1970).
Первичным донором электрона является пигмент Р680 (Doring et al., 1967), который при возбуждении передает свой электрон на пластохинон и далее в цепь мембранных переносчиков электрона, таких, как пул пластохинона, цитохром/, пластоцианин (Khaff, Malkin, 1978). Пластоцианин является донором электрона для пигмента Р700 (Ке et al., 1975), который при поглощении кванта света передает свой электрон на ферредоксин и далее на НАДФ+ (Ке et al., 1973). Перепад окислительно-восстановительного потенциала между водой (+ 0,8 В) и ферредоксином (-0,4 В) составляет 1,2 В.
Согласно Z-схеме, для разложения воды с выделением одной молекулы Ог необходим отрыв четырех электронов с поглощением восьми квантов света (два на каждый электрон). В опытах Эмерсона и Арнольда (Emerson, Arnold. 1932) при использовании коротких (несколько микросекунд) вспышек света было, однако, найдено, что за один цикл работы фотосинтетического аппарата примерно на каждые 2500 молекул хлорофилла, ответственных за поглощение квантов света, поглощается 1 молекула С02. Отсюда следует, что каждый фотохимически активный центр фотосинтеза (реакционный центр, РЦ) обслуживается в среднем 300 молекулами хлорофилла. Это было подтверждено в дальнейших работах. Таким образом, светособирающие комплексы хлорофилла (Thornber et al., 1977) поглощают энергию квантов света и передают энергию возбуждения на РЦ, в которых происходят фотохимические процессы. Такой механизм необходим в связи с тем, что скорость работы РЦ значительно превышает скорость поглощения квантов света самими РЦ (Шувалов, Красновский, 1981).
Супероксидный анион-радикал
Супероксидный анион-радикал образуется в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода соединениями с низким редокс-потенциалом. Образование 02" возможно при автоокислении многих веществ биологического происхождения. Источником 02 в присутствии металлов переменной валентности могут служить гемопорфирины, лейкофлавины, тетрагидроптериды, катехоламины, нафтохиноны, аскорбат (Аверьянов, Лапикова, 1988; Fridovich, 1983; Byczkowsky, Gessner, 1988). Генерация 02" наблюдается при автоокислении полифенольных соединений (Мерзляк, 1989). Показано, что образование семихинонов ведет к генерации 02 (Аверьянов, Лапикова, 1988; Афанасьев, 1979; Афанасьев, 1984). Некоторые радикалы, такие как метилвиологен, восстанавливаясь до катион-радикала быстро окисляются 302 с образованием супероксида (к = 7,7 х 10s М"1 с"1) (Farrington et al, 1973). Генерация 02" происходит также в фотосенсибилизированных реакциях (фотодинамическая реакция типа 1, см. выше).
Помимо генерации 02 при автоокислении органических соединений, его образование наблюдается в ряде ферментативных процессов. В хлоропластах 02" генерируется в оксигеназной реакции с участием РБФК/О (Михайликс соавт., 1988; Wildner, 1981). Ксантиноксидаза, использующая в качестве субстрата ксантин, дегидрогеназа оротовой кислоты, пероксидаза, мембраносвязанные НАДФ-оксидазы, флавиновые дегидрогеназы - являются теми ферментами, при работе которых происходит образование 02" (Rabinovitch, Fridovich, 1983; Halliwell, Gutteridge, 1984; Halliwell, Gutteridge, 1985; Byczkowski, Gessner, 1988). Наиболее эффективным из ферментативных генераторов 02 является ксантиноксидаза, которая часто используется для генерации 02"" в модельных системах (Aust et al., 1985).
Кроме образования 02 в ферментативных реакциях и при автоокислении субстратов, электрон-транспортные цепи и некоторые мембранные системы являются теми специфическими структурами, где образование Ог"" происходит с высокой скоростью. Митохондрии при окислении субстратов продуцируют 02" . Генерация 02 происходит при участии убихинона и флавопротеида (НАДН-дегидрогеназы) и может варьировать от 4 до 10% от общего потребления кислорода (Boveris, Cadenas, 1982; Naqui et al., 1986). Среди важных компонентов мембран, цитохромы в присутствии восстановленных пиридиннуклеотидов служат местами активации кислорода и источниками генерации 02 "; например, цитохром Р-450 и цитохром Ь$ (Владимиров, Арчаков, 1972; .Tones, 1985; Bast, 1986).
О/" интенсивно продуцируется при функционировании электрон-транспортной цепи хлоропластов (Allen, 1977; Asada, 1980; Elstner, 1982; Asada, Takahashi, 1987).
Супероксидный анион-радикал обладает слабо выраженными восстановительными свойствами, стандартный окислительно-восстановительный потенциал, Е(1 для пары 02/02 " составляет -0,16 В (рис. 8) (Fee, Valentine, 1977). EQ для пары 02 7Н202 составляет 0,94 В. Отличительным свойством Ог"" является его относительно долгое время жизни, которое составляет порядка нескольких миллисекунд (Мерзляк, 1989). Кроме того, 02 " способен проникать через липидные мембраны. Коэффициенты проницаемости для 02 " варьируют в широком пределе (от 10"8 до 10"6 см с"1) (Gus kova et al., 1984; Takahashi, Asada, 1983). Есть основания полагать, что 02" способен проникать по анионным каналам (Gus kova etal., 1984). Одной из основных реакций, которая определяет свойства 02 , является реакция протонирования, в ходе которой образуется гидроперикисный радикал (Н02 ), обладающий более сильными окислительными свойствами (Gebicki, Bielski, 1981). Константа скорости реакции протонирования 02" в воде составляет 5x10 ТУГ с" (Афанасьев, 1984). При рН 7,7 количество НО/ радикалов составляет 0,25% от количества 02" , поскольку рК для Н02" равна 4,8. Тем не менее, в гидрофобных средах, где величина рК может быть существенно выше, содержание Н02 радикалов может оказываться высоким вследствие протонирования 02 при его взаимодействии с донорами протонов. Вблизи поверхности мембран, где величина рН может быть локально смещена в кислую сторону, количество НО/ радикалов также способно повышаться.
Взаимодействие супероксидных радикалов друг с другом приводит к их дисмутации и образованию другой формы активного кислорода — пероксида водорода:
Скорость этой реакции зависит от степени протонирования 02" . Константа скорости реакции при щелочных рН, когда 0/ находится, в основном, в депротонированной форме, очень низка. Протонирование 0/ приводит к тому, что константа скорости реакции дисмутации возрастает и составляет для величины рН равной величине рК (4,8) 10 М" с . При кислых рН, меньше 4,8, когда основное количество супероксида находится в протонированной форме, константа скорости реакции дисмутации снова уменьшается (Green, НІ11, 1984).
Супероксидный анион-радикал не вступает в реакцию с большинством белков, липидов, нуклеиновых кислот и только его протонированная форма может вызывать перекисное окисление липидов (Bielski, 1986). Супероксид-зависимое окисление клеточных компонентов обычно происходит вследствие генерации гидроксильного радикала в реакциях супероксида с Н202. Однако 02 и сам по себе может инактивировать, например, ферредоксин-зависимую нитрат редуктазу, взаимодействуя с молибденом в ее активном центре (Aryan, Wallace, 1985; Mikami, Ida, 1986). При взаимодействии 02 с гемом каталазы, последний переходит в неактивную форму (Капо, Fridovich, 1982; Shimizu et al., 1984). Некоторые пероксидазы, такие как, аскорбатпероксидаза и глутатионпероксидаза, также инактивируются супероксидным анион-радикалом.
Характеристика восстановления кислорода в пуле пластохинона в присутствии ДНФ-ИНТ, ингибитора окисления пластогидрохинона цитохромным комплексом
Исследование поглощения ( компонентами пула пластохинона тилакоидной мембраны проводили в присутствии ДНФ-ИНТ, ингибитора окисления пластогидрохинона b f цитохромным комплексом. Это было необходимо для того, чтобы предотвратить перенос электронов от воды к ФС1 и, тем самым, устранить процесс восстановления ( компонентами акцепторной стороны ФС1.
Ранее было показано, что в присутствии 5 мкМ ДНФ-ИНТ скорость поглощения кислорода при рН 6,5 и при рН 7,8 близка к 10 мкмоль 02 (мг Хл)"1 ч"1, а скорость поглощения кислорода в присутствии диурона равна ],5-2 мкмоль ( (мгХлУ ч" (Khorobrykh, Ivanov, 2002). Было предположено, что более высокая скорость поглощения кислорода в присутствии ДНФ-ИНТ связана с участием пула пластохинона в данном процессе, и что восстановление кислорода в пуле пластохинона происходит в результате реакции взаимодействия кислорода с пластосемихиноном с образованием супероксида внутри тилакоидной мембраны (Khorobrykh, Ivanov, 2002). Была предложена схема восстановления кислорода в пуле пластохинона, согласно которой образующиеся супероксиды не только выходят в среду из мембраны, но и, образовавшись внутри тилакоидной мембраны, могут там же либо дисмутировать, либо вступать в реакцию с пластогидрохиноном, либо выходить из мембраны в люмен (Khorobrykh, Ivanov, 2002).
Для оценки количества супероксидов, оказывающихся вне мембраны, была использована реакция окисления аскорбата сулероксидом. Аскорбат в низких концентрациях не накапливается внутри мембраны тилакоидов, хотя и проникает через мембрану в люмен тилакоидов (Foyer, Lelandais, 1996), т.е. может взаимодействовать с 02 не только вне тилакоидов, но и в люмене. При добавке аскорбата в суспензию тилакоидов его реакция с супероксидом заменяет реакцию дисмутации супероксидов, и стехиометрия между переносом электронов по ФЭТЦ и поглощением кислорода изменяется. В отсутствие аскорбата процесс описывается уравнениями (1), (2) и (3). В результате реакции окисления аскорбата супероксидом образуется пероксид водорода и монодегидроаскорбат (МДА) (реакции (1), (2) и (4)). При этом, стехиометрия между переносом электронов от воды к кислороду такова, что перенос 4 электронов по цепи сопровождается поглощением 3 молекул 02, т.е. е : 02J, =4:3 (Allen, 1977), в то время как без аскорбата перенос 4 электронов по цепи сопровождается поглощением 1 молекулы 02, т.е. е : 02 = 4:1 (Allen, 1977). Таким образом, если все супероксиды взаимодействуют с ловушкой, то скорость поглощения кислорода должна увеличиваться в 3 раза.
На основе ранее полученных данных (Khorobrykh, Tvanov, 2002) о восстановлении кислорода в пуле пластохинона в экспериментах в присутствии ДНФ-ИНТ, для исследования были выбраны значения рН 6,5 и 7,8, поскольку в вышеупомянутой работе было показано, что при величинах рН больше 6,0 поглощение кислорода в пуле пластохинона термодинамически возможно. Также рН 7,8 представляет интерес, поскольку это физиологическое значение рН. Как показано нарис. 9 скорость поглощения 02 в присутствии аскорбата увеличивалась на 23% при рН 6,5 и в два раза при рН 7,8. Добавка СОД и при рН 6,5 и при рН 7,8 подавляла стимуляцию скорости поглощения кислорода с аскорбатом, что свидетельствует о том, что реакция дисмутации супероксидов действительно заменяется реакцией взаимодействия супероксида с аскорбатом. Скорость переноса электронов в присутствии ДНФ-ИНТ ограничена на стадии восстановления кислорода, и присутствии аскорбата не влияет на нее. Увеличение скорости поглощения кислорода при неизменной скорости электронного транспорта в присутствии аскорбата позволяет рассчитать, какое количество супероксидов вступило в реакцию с аскорбатом.
Расчет количества супероксидов, регистрируемых вне тилакоидной мембраны с помощью аскорбата, проводили следующим образом. Введем следующие обозначения:
А - скорость поглощения кислорода в отсутствие аскорбата, В - скорость поглощения кислорода в присутствии аскорбата, X - количество супероксидов, реагирующих с аскорбатом В отсутствие аскорбата все супероксиды дисмутируют, и тогда, согласно стехиометрии е : СЬ =4:1, скорость образования супероксидов (и скорость переноса электронов по ФЭТЦ) равна А х 4, далее 4А.
После добавки аскорбата скорость переноса электронов не меняется, а поглощение кислорода возрастает только из-за реакции взаимодействия части супероксидов с аскорбатом согласно стехиометрии е : Ог]. =4:3. Так как X - количество супероксидов, реагирующих с аскорбатом, то (4А - X) - количество супероксидов, которые дисмутируют и приводят к поглощению /2 (4А-Х) молекул кислорода. Электроны, продуцирующие супероксиды, которые взаимодействуют с аскорбатом, обеспечивают скорость поглощения кислорода, численно равную X. Поскольку при переносе 4А электронов по ФЭТЦ происходит выделение кислорода из воды в ФС2 со скоростью, численно равной А, то кислородный баланс в присутствии аскорбата (В):
Возможные причины образования пероксида водорода в присутствии цитохрома
Образование Н202 в присутствии цитохрома С могло происходить в зоне стэкинга тилакоидов, если проникновение цитохрома С и взаимодействие с супероксидами в этой зоне затруднены. Размер длинной оси цитохрома С равен 34 A (Bushnell et all., 1990), а размер просвета между тилакоидами в гранах был оценен как 45 A (Jennings et al., 1979).
Рис. 11 в. показывает, что и в расстыкованных тилакоидах происходит значительное образование Н202. Рассчитанная, как описано выше, доля электронов, участвующих в образовании Н202 в «расстыкованных» тилакоидах, уменьшалась до 40 % по сравнению с 50 % в контрольных тилакоидах в этих экспериментах. Нельзя исключить, что это уменьшение свидетельствует о том, что, действительно, не все 02" в зоне стыковки тилакоидов в гранах доступны для цитохрома С. Количество супероксидов в пространстве между тилакоидами в гранах не должно быть велико: в основном, это - супероксиды, генерируемые с небольшой скоростью в пуле пластохинона внутри мембраны, но способные выйти из нее (Ivanov, Khorobrykh, 2003), тогда как генерация супероксидов вне мембраны мало вероятна, поскольку в гранальных мембранах практически отсутствует ФС1. Скорее всего, наблюдаемое уменьшение доли электронов, участвующих в образовании Н202, это - результат изменения взаимодействия переносчиков ФЭТЦ в условиях «расстыковки» тилакоидов (Jennings et al., 1983; Chow, 1984).
Образование H202 в присутствии цитохрома С могло происходить во внутреннем пространстве тилакоидов (люмене), если часть 02" выходит в люмен и там дисмутирует. Для оценки количества супероксидов, участвующих в образовании Н202 в люмене, были измерены скорости поглощения кислорода в присутствии и в отсутствие аскорбата при наличии в суспензии СОД, предотвращающей реакцию 02" с аскорбатом в среде.
При восстановлении супероксидов аскорбатом стехиометрия между поглощением 02 и переносом электронов от воды для таких супероксидов становится е : 03 =4:3 (см. раздел З.1.), что ведет к увеличению скорости поглощения кислорода при неизменной скорости электронного транспорта (в данном случае скорость электронного транспорта лимитируется скоростью восстановления молекул От) (см. далее раздел 3.3.2.). Из величины прироста скорости пот-лощения кислорода при добавке аскорбата была найдена доля в суммарном потоке тех электронов, которые продуцируют 02 , реагирующие с аскорбатом в люмене, куда СОД не проникает. Способ расчета был аналогичен тому, который использовали для получения результатов, представленных в Таблице 1, но данные в последнем столбце в Таблице 3 относятся (из-за присутствия СОД в среде) только к электронам, образующим суяероксиды, проникающие в люмен. Эта величина варьировала от 5 до 11 % (Таблица 3). Это максимальная оценка, поскольку нельзя исключить донирование аскорбатом электронов в ФЭТЦ (Mano et а]., 2004), что может дополнительно (не вследствие изменения стехиометрии е : 02!) увеличить скорость поглощения 02.
Было оценено, что концентрация аскорбата 0,5 мМ является концентрацией, при которой скорость реакции взаимодействия супероксида с аскорбатом в 100 раз больше скорости реакции дисмутации супероксидов. Расчет проводили следующим образом.
Обозначим скорость реакции дисмутации супероксидов, удисм = кдисм х [02"-]\ а скорость реакции взаимодействия супероксида с аскорбатом, Уацк=каскх[ОГ]х[Аск]. Пусть скорость поглощения кислорода 10 мкмолей 02 (мг Хл)" ч" , что соответствует скорости генерации 02" 40 мкмолей (мг Хл)" ч" . Предположим, что половина из них идет в люмен, т.е. 20 мкмолей 02" (мг Хл)"! ч" . Если объем люмена составляет 30 мкл (мг Хл)" , тогда скорость миграции супероксидов в люмен равна 185 мкМ с" . При наличии аскорбата в люмене протекают обе реакции, и в стационарных условиях скорость миграции супероксидов в люмен и скорость их исчезновения при дисмутации и взаимодействии с аскорбатом должны быть равны, т.е.:
Возможный вклад образования Н202 в люмене в суммарное внутритилакоидное образование был также оценен косвенно, без введения в реакционную смесь восстановителя. Известно, что изменение рН приводит к значительному изменению константы скорости реакции дисмутации супероксидов, и можно было предположить, что, если супероксиды выходят в люмен, то доля электронов, участвующих в образовании Н202, должна зависеть от рН в люмене и от размера люмена. Было найдено, что изменение потока супероксидов в люмен при изменении его объема, и изменение скорости дисмутации супероксидов в люмене, путем варьирования рН люмена, существенным образом не влияло на эту величину (Таблица 4, эксперименты I и II). Изменение объема люмена достигали изменением осмолярности среды, варьирование рН люмена - исключением из среды реакции грамицидина D (при рН среды 7,8 значение рН в люмене на свету в его отсутствие ниже, чем в его присутствии).
Введение в суспензию цианистого калия и азида натрия (KCN и NaN3), ингибиторов СОД хлоропластов растений не влияло на количество электронов, участвующих в образовании Н2О2 в присутствии цитохрома С (Таблица 4, эксперименты III и IV). Это показывает, что данное образование Н2О2 не является результатом дисмутации 02 с участием СОД, которая могла «не отмыться» с мембраны тилакоидов при выделении.
