Введение к работе
Актуальность проблемы. В процессе растительно-бактериального взаимодействия, а также в адаптации к условиям окружающей среды важнейшую роль играет поверхность клетки микроорганизма. Наружный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий содержит трехкомпонентные молекулы липополисахаридов (ЛПС), которые закреплены в ней при участии погруженных в фосфолипидный слой липидов А и экспонированы в окружающее пространство углеводными составляющими, представленными коровым олигоса-харидом и О-специфическим полисахаридом (ОПС). Такое строение макромолекул ЛПС характерно для всех бактерий - комменсалов, мутуалистов и патогенов животных и растений.
Ключ к пониманию функций ЛПС в коммуникации микробов с другими организмами находится в первичной химической структуре макромолекул. В последнее время на примере ряда бактерий - ксантомонад, псевдомонад, агро-бактерий, ризобий - показано, что вариации в структуре корового олигосахари-да и липидной части ЛПС могут быть связаны с различными типами взаимодействий этих бактерий с растениями (Newman et al., 2007). Однако в большей степени структурный анализ ЛПС сфокусирован на ОПС, которые вследствие поверхностного расположения вовлечены в процессы узнавания микроорганизма макрохозяином и инициацию иммунной реакции организма. Установлены некоторые факты участия этих макромолекул в ассоциативных взаимоотношениях, модельным объектом изучения которых являются бактерии рода Azospirillum. Обнаружено, что ЛПС-содержащие экстракты из клеток азоспи-рилл стимулируют агрегацию бактерий (Matora et al., 2001) и прикрепление их к поверхности корня (Matora et al., 1995), а изолированные препараты ЛПС индуцируют деформации корневых волосков проростков пшеницы (Федоненко с соавт., 2001). Выявлено снижение количества адсорбированных на корнях клеток мутантного штамма КМ252, дефектного по синтезу ЛПС, по сравнению с родительским A. brasilense Sp245 (Федоненко с соавт., 2001). Однако все эти биологические эффекты получены на препаратах очень ограниченного количества штаммов, главным образом, на примере ЛПС бактерий A brasilense Sp245, которые являются эндофитными (Dobereiner and Day, 1976). Любое изменение в составе молекулы ЛПС может отражаться на его свойствах и биологической активности, а структура углеводного компонента и соотношение жирных кислот (ЖК) в ЛПС разных штаммов азоспирилл характеризуются высокой вариабельностью и зависят от условий существования микроорганизмов.
Кроме того, полисахаридный участок молекулы ЛПС содержит антигенные детерминанты, которые определяют серологическую специфичность бактерий и могут быть доступны для узнавания клетками других организмов. На основании наличия общих антигенных детерминант в ЛПС шесть штаммов бактерий рода Azospirillum поделены на две серогруппы (Коннова, 2006). Однако для выяснения химической основы серологического родства и создания пол-
ноценной серологической классификации азоспирилл требуются данные о структурах ОПС других штаммов.
В связи с вышеизложенным цель данной работы заключается в выявлении особенностей структуры молекул ЛПС азоспирилл разных серогрупп в связи с коммуникативной ролью в ризосфере.
Для реализации цели в ходе исследования решались следующие задачи:
Анализ и характеристика химического состава препаратов ЛПС и ОПС, выделенных из внешних мембран восьми штаммов бактерий рода Azospirillum.
Сравнительное исследование структур повторяющихся звеньев ОПС азоспирилл и выявление химической основы их серологического родства.
Исследование активности ЛПС в коммуникации азоспирилл разных серогрупп с растительными и бактериальными клетками.
Выявление изменений в структуре ЛПС бактерий A brasilense Sp245.5, произошедших в результате спонтанного изменения плазмидного состава.
Научная новизна работы. Установлены структуры ОПС и выявлена химическая основа серологического родства бактерий A. brasilense S27, Spl07, SR15, SR80, SR55 и A. lipoferum RG20a.
Впервые в ОПС штаммов азоспирилл, выделенных из ризосферы дикорастущих растений (Zerna inermis и Sericostoma pauciflorum), в качестве повторяющихся звеньев идентифицированы линейные гомоолигомеры D-рамнозы.
Впервые для азоспирилл в ОПС бактерий A. brasilense SR55 обнаружено восьмичленное повторяющееся звено с глюкуроновой кислотой в боковой цепи.
Идентифицированы два повторяющихся звена различной структуры в ОПС бактерий A brasilense SR80.
Расшифрована уникальная структура повторяющегося звена ОПС спонтанного мутанта A. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате длительного хранения на богатой среде культуры A brasilense Sp245.
Впервые в комплексе с ЛПС бактерий A. brasilense SRI 5 идентифициро-ван N -(1-карбоксиэтил)-орнитин, принадлежащий к классу опинов.
Выявлено повышенное содержание непредельных ЖК в гидрофобных компонентах ЛПС четырёх штаммов азоспирилл (A. brasilense SR80, SR55, SR8 и SR15), выделенных из почв Саратовской области. Установлено, что ЛПС азоспирилл с различными соотношениями ЖК и/или структурами повторяющихся звеньев отличаются по активности в отношении растений.
Научно-практическая значимость. Выявленный факт биосинтеза гли-кополимеров иной структуры в связи с геномными перестройками может быть использован для прогнозирования изменений природных штаммов при длительном хранении в лабораторных условиях. Кроме того, полученные данные способствуют пониманию роли плазмидной ДНК в формировании структур клеточной поверхности, участвующих в ассоциативном взаимодействии.
Результаты исследования необходимы для химического обоснования серологической классификации бактерий рода Azospirillum, которая может использоваться для экспресс-идентификации штаммов азоспирилл. Препараты ЛПС восьми штаммов азоспирилл, полученные в ходе диссертационного иссле-
дования, применяются сотрудниками лабораторий биохимии, микробиологии, иммунохимии ИБФРМ РАН для проведения биологических и иммунохимиче-ских экспериментов. Полученные антитела (AT), специфичные к ЛПС бактерий A. brasilense SR55 и S17, могут быть использованы как инструменты для выявления соответствующих эпитопов в составе гликополимеров различного происхождения.
Результаты данной работы используются в преподавании студентам биологического и химического факультетов Саратовского государственного университета курсов «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Повторяющиеся звенья О-специфических полисахаридов бактерий
A. brasilense Spl07, S27 и A. lipoferum RG20a являются пента-Б-рамнанами,
A. brasilense SRI 5 - тетра-Б-рамнанами. Присутствие в структурах
О-специфических полисахаридов D-рамнозы является химической основой се
рологического родства и обоснованием отнесения вышеуказанных штаммов к
серогруппе I. С липополисахаридом A. brasilense SRI5 прочно ассоциирован
N -(1-карбоксиэтил)-орнитин.
О-специфический полисахарид бактерий A. brasilense SR55 состоит из октасахаридных звеньев с D-глюкуроновой кислотой в боковой цепи; в составе О-специфического полисахарида A. brasilense SR80 содержится два повторяющихся звена различной структуры. О-специфические полисахариды азоспи-рилл, включенных в состав серогруппы II, являются разветвленными гетеропо-лисахаридами, содержащими среди прочих Сахаров L-рамнозу и D-галактозу.
У мутанта A. brasilense Sp245.5, образовавшегося в результате плаз-мидных перестроек в геноме бактерий A. brasilense Sp245 при длительном хранении на богатой среде, синтезируется О-специфический полисахарид, отличный по структуре от такового родительского штамма.
Существенную роль, определяющую активность бактерий в отношении растений, играют как структура О-специфических полисахаридов, так и соотношение жирных кислот в липидах А липополисахаридов.
Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на следующих научных форумах: конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005 г.); 10-ой Всероссийской Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука 21 века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006 г., 2008 г.); 2-ой конференции стран Балтии по микробным полисахаридам «2n Baltic meetings on microbial carbohydrates» (Росток, Германия, 2006 г.); Международной школе-конференции молодых ученых «Прикладные и фундаментальные аспекты ответных, сигнальных процессов и процессов развития в системах корень-микроорганизм» (Санкт-Петербург, Россия, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты ис-
следования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007 г.); 14-ом Европейском симпозиуме «141 Eurocarb» (Любек, Германия, 2007 г.).
Доклад «Структура и участие липополисахарида Azospirillum brasilense SR55 во взаимодействии с корнями пшеницы» на научной конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2008 г.) удостоен диплома I степени.
Диссертационная работа обсуждена и рекомендована к защите на совместном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ им. Н.Г. Чернышевского 3 марта 2009 года.
Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ гос. per. 0120.040358, научный руководитель - заслуженный деятель науки РФ, проф. В.В. Игнатов). Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель проф. Игнатов В.В. и в 2008-2010 гг. № 08-04-00669, руководители проф. Игнатов В.В. и проф. Коннова С.А., а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии СГУ. Серологические исследования ЛПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН, эксперименты по ингибированию агглютинирующей активности лектина Grifola frondosa проведены сотрудниками лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН, анализ состава ЖК ЛПС осуществлен сотрудниками лаборатории структурных методов исследования ИБФРМ РАН, спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) сняты и расшифрованы совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей. Доля личного участия автора в подготовке совместных публикаций составляет до 70 %.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ в отечественных и зарубежных научных изданиях, из них 2 статьи в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, а также результатов и их обсуждения, заключения, выводов, благодарностей и списка цитируемой литературы, содержащего 368 источников, в том числе 280 зарубежных. Работа изложена на 129 страницах, содержит 14 рисунков и 8 таблиц.
