Введение к работе
Актуальность проблемы. Лимонная кислота является важным биотехнологическим продуктом и широко используется в пищевой и фармацевтической промышленности.
Лимонная -кислота занимает ключевую позицию в промежуточном метаболизме всех живых клеток. Кроме хорошо известного окисления цитрата в ЦТК, он также является источником ацетил-СоА и оксалоацетата, необходимых для многих биосип-тегических процессов (Goodwin, 196S; Lowenstein, 1968) и действует как положительный и отрицательный регулятор некоторых ключевых ферментов первичного метаболизма (Srcre, 1965). Концентрация такого важного метаболита находится пол строгим контролем в клетке. Однако существует ряд организмов, которые накапливают в среде лимонную кислоту в значительном количестве (Финогенова, Илларионова, Лозинов, 1973; Rohr, КиЫсек, 1981).
Сновными продуцентами лимонной кислоті.! являются мицелиальные грибы Aspergillus niger {КиЫсек, Rohr, 1986; Mattey, 1992) и дрожжи Candida lipolytica (Финогенова, Илларионова, Лозинов, 1973). В последнее время все больше внимания уделяется микробиологическому способу получения лимонной кислоты с использованием дрожжей С. lipolytica. Необходимым условием активного процесса кислоторбра-зования является лимитирование роста дрожжей одним из компонентов среды -источником азота, фосфора, серы или Mg2* (Лозинов с соавт., 1974). В разработанных технологиях микробиологического синтеза лимонной кислоты наиболее часто используется лимитирование роста клеток дрожжей источником азота.
Дрожжи проявляют разные физиологические ответы при лимитировании роста клеток источником азота в условиях избытка углеродного субстрата. Дрожжи Candida hpolyticu экскрешруют в среду лимонную кислоту, "липидные" дрожжи ( hrusix/nis, Apiotricliwn curvatum, Rhodotorula glutinis и др.) накапливают значительные количества эндогенных липидов - до 70% от сухого веса (Evans, Ratledge, 1985с). Можно выделить также группу так называемых дрожжей-"непродуцентов" (С?, maltosa, С. bouiinii, С. utilis), которые при аналогичных условиях культивирования не синтезируют ни значительного количества липидов, ни лимонной кислоты. Биохимическая основа подобных различий в физиологических ответах на лимитирование роста источником азота до сих пор остается невыясненной. Для понимания процесса сверхсинтеза лимонной кислоты необходимо знать какие ферменты участвуют в биосинтезе лимонной кислоты, где они локализованы и как регулируются.'
Метаболические пути синтеза лимонной кислоты из глюкозы у дрожжей достаточно хорошо изучены. Однако данные о наличии ряда ферментов (АТФ-цитратлиазы, малик-фермента) противоречивы (Evans, Ratledge, 1985с; Финогенова с соазт., 1989). Неизвестна также субклеточная локализация ключевого фермента анаплерогических путей - пируваткарбоксилазы, играющего решающую роль в непрерывном процессе синтеза лимонной кислоты.
Процесс сверхсинтеза лимонной кислоты, по-видимому, возможен лишь при ограничении одной из реакций ЦТК. Имеющиеся в литературе данные о регуляции ферментов ЦТК у дрожжей (Marched et al, 1977; Evans, Ratledge, 1985c) позволяют предположить участие НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в процессе накопления в культуральной среде лимонной кислоты.
Для непрерывного синтеза лимонной кислоты необходим активно функционирующий гликолиз. В то же время известно, что фосфофруктокиназа, ключевой фермент гликолиза, ингибируется цитратом (Sols et al, 1971; Evans, Ratledge, 1984c). Таким образом, вопрос о том, каким образом осуществляется гликолитический контроль у кислотообразущих штаммов до сих пор остается невыясненным.
Цель и задачи исследования. С учетом вышеизложенного цель нашей работы заключалась в изучении субклеточной локализации ферментов у дрожжей при росте на глюкозе и исследовании регуляции ключевых ферментов.
Для реализации указанной цели решались следующие задачи:
-
исследование субклеточной локализации пируваткарбоксилазы, АТФ-цит-ратлиазы, малик-фермента, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, "липидных" дрожжей и дрожжей-"непродуцентов";
-
исследование регуляции НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у дрожжей-продуцентов (Yarrowia lipolytica) и "непродуцентов" (Candida maltosa) лимонной кислоты;
-
исследование регуляции фосфофруктокиназы у дрожжей-продуцентов (Yarrowia lipolytica) и "непродуцентов" (Candida maltosa) лимонной кислоты.
Научная новизна работы. Исследована субклеточная локализация ферментов у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты, дрожжей, накапливающих значительное количество липидов и дрожжей-"непродуцентов" - не синтезирующих ни значительного количества лимонной кислоты, ни липидов в условиях лимитирования роста источником азота на среде с глюкозой. Результаты исследований позволили выяснить особенности субклеточной локализации ферментов и дали возможность по-новому взглянуть на направленность метаболических потоков в клетках дрожжей с учетом компартментализации процессов; выявлены биохимические отличия дрожжей, синтезирующих лимонные кислоты, от группы дрожжей, накапливающих при аналогичных условиях не лимонную кислоту, а липиды.
В результате сравнительного исследования регуляторних свойств НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и фосфофруктокиназы у дрожжей Y. lipolytica и С maltosa выявлены важные особенности регуляции ферментов у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты. Показано, что фосфофруктокиназа дрожжей К lipolytica менее чувствительна к ингибированию цитратом по сравнению с ферментом из С maltosa. Различная устойчивость фосфофруктокиназ к действию цитрата определяет различия в способности к сверхсинтезу лимонной кислоты из
глюкозы. На основе проведенных исследований предложена схема субклеточной локализации и регуляции ферментов метаболизма глюкозы у дрожжей-продуцентов лимонной кислоты Y. lipolytica .
Практическая ценность работы. Исследование субклеточной локализации и регуляции ферментов у дрожжей-продуцентов и непродуцентов лимонной кислоты позволило глубже понять механизм сверхсинтеза лимонной кислоты с учетом компартмептализации процессов, а также особенностей регуляции ферментов в клетках дрожжей при росте на глюкозе и создать научные предпосылки для улучшения технологии производства лимонной кислоты.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на сессиях научных работ ИБФМ РАН в 1992, 1993 гг, на совместных семинарах лаборатории окислительного обмена веществ и лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН.
Публикации. По материалам работы опубликовано 3 печатные работы, одна работа принята к печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит '^страниц машинописного текста, включая /О таблиц, /Yрисунков. Список литературы содержит А?6источников (из них л*/- зарубежные).
