Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физиолого-биохимические особенности Yarrowia lipolytica
1.1. История изучения и распространение в природе 11
1.2. Ассимиляция источников углерода 14
Глава 2. Секреция органических кислот - интермедиатов ЦТК
2.1. Микробный биосинтез органических кислот 32
2.2. Лимонная и Tpeo-Ds-изолимонная кислоты 34
2.3. Пировиноградная кислота 44
2.4. а-Кетоглутаровая кислота 54
Глава 3. Организация и регуляция ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов
3.1. Биохимия образования лимонной кислоты грибами Aspergillus niger 60
3.2. Физиологические основы биосинтеза лимонных кислот у Y. lipolytica 44
3.3. Физиологические основы биосинтеза кетокислот у Y. lipolytica 70
3.4. Характеристика ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов 72
Глава 4. Структурно-функциональная организация метаболических путей
4.1. Компартментализация и регуляция метаболических путей 85
4.2. Надмолекулярные ферментные комплексы 87
4.3. Связывание ферментов с клеточными мембранами 93
4.4. Метаболические каналы внутри надмолекулярных ферментных комплексов 96
Глава 5. Материалы и методы исследования
5.1. Микроорганизмы и условия выращивания 99
5.2. Аналитические методы 100
5.3. Определение активности ферментов 101
5.4. Субклеточное фракционирование дрожжей 102
5.5. Очистка ферментов глицеролкиназы, липазы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы 109
5.6. Пермеабилизация клеток Y. lipolylica 112
5.7. Связывание цитратсинтазы Y. lipolylica с внутренней мембраной митохондрий 112
5.8. Иммунноэлектронная микроскопия 113
5.9. Хроматография Hummer-Dreyer 113
5.10. Осаждение комплекса цитратсинтазы/малатдегидрогеназы полиэтиленгликоле и проведение сопряженных реакций с ферментами "ловушками" 114
5.11. Методика исследования метаболических эффектов нарушения локализации цитратсинтазы у дрожжей 115
5.12. Получение слитого белка цитратсинтазы/малатдегидрогеназы 120
Глава 6. Пути метаболизма глицерина, растительных масел и глюкозы Y. lipolytica
6.1. Пути метаболизма глицерина 123
6.2. Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина 127
6.3. Очистка и свойства глицеролкиназы 129
6.4. Физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ 133
6.5. Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел и продуктов их гидролиза
6.6. Очистка и свойства липазы 146
6.7. Особенности регуляции ключевых ферментов метаболизма глюкозы у Y. lipolytica 150
6.8. Индукция ферментов глиоксилатного цикла у Y. lipolytica и в органах млекопитающих 161
Глава 7. Сверхсинтез органических кислот дрожжами Y. lipolytica
7.1. Механизмы сверхсинтеза пировиноградной и а-кетоглутровой кислот при росте в среде с глицерином, глюкозой и этиловым спиртом 170
7.2. Механизмы сверхсинтеза лимонных кислот на различных источниках углерода 189
7.3. Очистка и свойства цитратсинтазы 195
7.4. Очистка и свойства НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы 199
7.5. Биохимический механизм сверхсинтеза лимонной кислоты из глюкозы у Y. lipolytica 205
Глава 8. Надмолекулярная организация ЦТК
8.1. Изучение регуляции цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in situ
8.2. Связывание цитратсинтазы Y. lipolyiica с внутренней мембраной митохондрий
8.3. Фермент-ферментные взаимодействия между цитрагсинтазой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле
8.4. Субстратный канал оксалоацетата внутри слитого белка цитратсинтазы/малатдегидрогеназы
8.5. Метаболические эффекты дислокализации цитратсинтазы в клетках дрожжей
V. Заключение
VI. Выводы
VII. Список литературы
- Физиологические основы биосинтеза лимонных кислот у Y. lipolytica
- Метаболические каналы внутри надмолекулярных ферментных комплексов
- Очистка ферментов глицеролкиназы, липазы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы
- Индукция ферментов глиоксилатного цикла у Y. lipolytica и в органах млекопитающих
Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию неконвенционных дрожжей Yarrowia lipolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и генно-инженерной экспериментальной биологии Y. lipolytica; усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al. 2004).
Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей Y. lipolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у Y. lipolytica изучены достаточно хорошо при использовании н-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК - проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы – метаболоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и глицерина у дрожжей Y. lipolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
-
Изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжами Y. lipolytica.
-
Исследование механизмов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y. lipolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах.
-
Выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7).
-
Изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов регуляции у дрожжей. Создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.
Научная новизна работы. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.
Ключевые ферменты ассимиляции метаболизма триглицеридов и глицерина – липаза (КФ 3.1.1.3) и глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) выделены, очищены и охарактеризованы.
Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) из дрожжей Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что кинетические свойства цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in vitro и in situ существенно различаются. Фермент в условиях in situ оказался значительно более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.
Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Новизна предполагаемого подхода состоит в том, что ферменты одного метаболического пути впервые рассматриваются не в качестве отдельных функциональных единиц, а как элементы единого структурно-функционального комплекса. С использованием различных методологических подходов показано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата.
Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.
На примере пероксисомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.
Практическая значимость работы. На основании изучения метаболической организации путей ассимиляции триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжей Y. lipolytica созданы научные основы для разработки микробиологических способов получения пировиноградной и лимонной кислот. Процессы получения лимонной кислоты из рапсового масла и пировиноградной кислоты из глицерина были воспроизведены в полупромышленных масштабах на Опытно-технологической установке ИБФМ РАН.
Разработаны простые оригинальные методы очистки внеклеточной липазы, глицеролкиназы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицеролкиназы из дрожжей защищен авторским свидетельством № 1433980 (1988). Липаза из Y. lipolytica может применяться в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производства растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.
Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на четырнадцатой конференции "Транспорт и энергетика дрожжей" (Бонн, Германия, 1996), на третьей международной конференции по Y. lipolytica (Дрезден, Германия, 2002), на первом и втором международных конгрессов федерации европейских микробиологов (Любляна, Словения, 2003 и Мадрид, Испания, 2006), на девятнадцатом международном симпозиуме, посвященном достижениям в микробной безопасности пищевых продуктов (Порторош, Словения, 2004), на втором греческом симпозиуме биотехнологов (Афины, Греция, 2005), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2007), на ежегодных международных конференциях Института биотехнологии "Биохимия и биотехнология микроорганизмов – продуцентов органических кислот" (Авги-Салоники, Греция, 2006, 2007, 2008), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (1994-2008).
Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2009 гг. в Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002-2006 гг.” (госконтракт № ИФ-15/02-2006), Российским фондом фундаментальных исследований, международным грантом CRDF RBO – 10305, и договорами с ООО «Зеленые линии» и ООО «НТМ-ФАРМ».
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 54 печатные работы, в том числе, 28 статьи (в их числе 3 обзора) из списка журналов ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 329 страницах, содержит 44 таблицы и 51 рисунков. Список литературы включает 434 наименований, из них 330 – публикации в иностранных изданиях.
Физиологические основы биосинтеза лимонных кислот у Y. lipolytica
Увеличение содержания железа в биомассе также вызывало увеличение синтеза ЛК и ИЛК, но в значительно меньшей степени - только в 3 раза. При увеличении концентрации ионов железа до 7 мг/г сухой биомассы синтез кислот прекращается. Отмечено также влияние содержания ионов железа в биомассе на соотношение выделяемых в среду кислот. При низком содержании железа (до 0,4 мг/г) образуются равные количества ЛК и ИЛК; с увеличением содержания железа синтез сдвигается в сторону большего накопления ЛК (2:1), при повышении концентрации до 4,8 мг/г соотношение ЛК к ИЛК составляло 3:1 (Камзолова, 1995). Напротив, при биосинтезе ЛК у дрожжей С. oleophila, растущих на среде с глюкозой, увеличение концентрации железа приводит к полному ингибированию синтеза кислот и увеличению биомассы (Anastassiadis and Rehm, 2005а,б).
Большое значение в регуляции процесса сверхсинтеза ЛК играет внесение различных ингибирующих веществ в среду культивирования. Добавление ингибиторов белкового синтеза (циклогексимид, хлорамфеникол) в начале процесса сверхсинтеза подавляет образование ЛК. Снижение уровня образования ЛК происходит также при внесении в среду арсената или реумицина. Степень снижения выхода ЛК пропорциональна внесенной концентрации деэнергизующих веществ. Подавление процесса сверхсинтеза ЛК происходит на фоне отсутствия или незначительного влияния этих веществ на уровень биомассы. То есть сверхсинтез инициируется в условиях избытка НЛД(Ф)Н и АТФ и осуществляется за счет этого избытка, а также направлен на его снижение. В процессе сверхсинтеза ЛК из глюкозы задействован энергозависимый фермент, который катаболизирует пируват со скоростью, изменяющейся пропорционально внутриклеточному уровню НАД(Ф)Н и АТФ. Из ферментов, метаболизирующих пируват, такая регуляция характерна для пируват-карбоксилазы и это обусловливает зависимость процесса сверхсинтеза ЛК от уровня АТФ и НАДФН. Добавление арсената в среду культивирования приводит к снижению впуїриклеточного уровня НАДН и АТФ, активность пируват-карбоксилазы падает, что приводит к уменьшению синтеза оксалоацстата и ЛК (Ермакова, 1985; Ильченко и др., 2003; Ruijter et al., 2004). Внесение малата в суспензию деэнергизированных манатом дрожжей приводит к увеличению внутриклеточной концентрации малата, малик-фермент переходит в состояние насыщения по субстрату. Восстанавливается НАД уровень НАДН и АТФ увеличивается. Активность пируват-карбоксилазы увеличивается, что приводит к синтезу большего количества оксалоацетата, который в свою очередь расходуется на образование цитрата (Звягильская и др., 1991; Трутко и др., 1993).
Условия образования Tpeo-Ds-C+Уизолимонной кислоты О производстве биологически активной трео-Оз-(+)-изолимонной кислоты (далее ИЛК) микробиологическим путем в промышленных условиях сведения единичны. В 1983 г. в СССР на заводе ЭЗБП (г. Рига) был апробирован микробиологический способ производства получения монокалиевой соли ИЛК из жидкого парафина с помощью дрожжей С. lipolytica и выпущена опытная партия препарата (чистота 98%). Продукт был использован в биохимических лабораториях страны, небольшая партия продукта была продана за рубеж. Этот технологический процесс разрабатывался общими усилиями микробиологов, химиков и технологов ИБФМ (г. Пущино) под руководством А.Б. Лозинова и Т.В. Финогеновой и ЭЗБП (г. Рига) под руководством Р.Я. Карклиня и И.Ж. Пелцмане. Использовался природный штамм С. lipolytica 704, который в условиях лимитирования роста азотом, синтезирует ЛК и ИЛК одновременно. В результате биохимических исследований было показано, что соотношение обеих кислот у этого штамма определяется активностью ферментов аконитат-гидратазы, изоцитрат-лиазы и изоцитрат-дсгидрогеназы (Ermakova et al., 1986; Finogenova et al., 1986). Снижение активности аконитат-гидратазы и повышение активности изоцитрат-лиазы приводит к преимущественному накоплению ЛК, в то время как повышение активности аконитат-гидратазы при одновременном снижении активности изоцитрат-лиазы и изоцитрат-дегидрогеназы связано с синтезом ИЛЬС. В отношении активности аконитат-гидратазы имеется работа, подтверждающих эти данные (Agrawal et al., 1983).
Ферментация со штаммом С. lipolytica проводилась методом глубинного периодического культивирования в ферментерах емкостью 100 и 150 л, оборудованных турбинной мешалкой и кольцевым барбатером, аппаратурой для измерения и регистрации температуры, рН и рОг. Процесс осуществлялся на модифицированной среде Ридер с добавками тиамина и смеси микроэлементов. В качестве источника азота использовался сернокислый аммоний, а источника углерода— жидкие парафины (Сп-Сгі). Концентрацию растворенного в среде кислорода поддерживают на уровне 60-70% от полного насыщения. рН поддерживали на уровне 5,0 - 6,0 путем титрования 10-15% NaOH. Направленность метаболизма в сторону ИЛК обеспечивается лимитированием роста биомассы по азоту и внесением итаконата или оксалата натрия - ингибиторов изоцитрат-лиазы. Поддерживалась оптимальная для биосинтеза ИЛК температура в пределах 28-29 С. Проверены различные концентрации парафинов в процессе ферментации (Пелцмане с соавт., 1988). Продуцент в данных условиях с наибольшей эффективностью усваивал питательную среду, содержащую 6-7% парафинов. При этом выход по субстрату составлял 110-120%. Продолжительность ферментации 96-110 ч, а уровень биосинтеза составляет 50-60 г/л ИЛК. Ферментация осуществлялась до полного потребления парафина.
Исследовано влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на биосинтез ИЛК (Пелцмане с соав., 1984). Наилучший положительный эффект получен при использовании синтетических пеногасителей - пропанола и контрамина. Добавление этих ПАВ в концентрациях 0,02 - 0,025% на 20 - 24 ч ферментации сокращало продолжительность цикла ферментации на 24-28 ч, способствовало полному ассимилированию углеводородов и улучшало процесс фильтрации сброженной жидкости.
В ходе работы по влиянию ингибиторов было показано, что итаконат, внесенный в среду перед посевом, сильно ингибировал рост дрожжей, а внесенный после исчерпания азота в среде в различных концентрациях (1-60 мМ) абсолютно не влиял на дальнейший рост биомассы, но при этом сильно менялось соотношение образуемых ЛК и ИЛК (Карклинь с соавт., 1991). Однако, в связи с возможным присутствием в сырье (жидкий парафин или другие алканы) канцерогенных углеводородов произведенная ИЛК не могла быть использована в качестве пищевой добавки или в медицинской практике. Такой продукт может рассматриваться в качестве биохимического реактива только для лабораторного использования.
В 1984 году появилось сообщение японских исследователей Института прикладной биохимии университета Цукубы о способности мутантного штамма дрожжей С. calenulate синтезировать практически одну ИЛК при росте на среде с глюкозой (Oogaki etal., 1984).
Метаболические каналы внутри надмолекулярных ферментных комплексов
И.Т. Ермаковой (1970аб) показано, что дрожжи Y. lipolyiica 695 на гексаде-кане имеют широкий диапазон рН среды для ростовых процессов (от 2,0 до 8,0), в то время как максимальный синтез а-кетоглутарата происходит при рН=4,0. Японские исследователи (Tsugawa et al., 1969) показали, что максимальный биосинтез а-кетоглугарата из парафина достигается при рН=6,0. Для ацетат-растущих клеток Y. lipolyiica при лимитировании роста тиамином показано, что при изменение рН среды от 6,0 до 8,0 происходило увеличение биомассы и удельной скорости роста и резкое снижение интенсивности ки-слотообразования. При использовании глюкозы изменение рН среды от 6,0 до 8,0 приводило к снижению выхода биомассы и удельной скорости роста, тогда как интенсивность синтеза изменялась незначительно (Ермакова и др., 1979а). Для активного сверхсинтеза а-кетоглутарата из этанола необходимо поддержание рН среды на уровне 4,5 (Чернявская, 1998). При более высоких значениях рН (5,5 и 6,0) отмечалось накопление в среде уксусной кислоты до 1 г/л в период роста дрожжей, что ингибировало рост и сверхсинтез а-кетоглутарата. При рН=3,0 отмечалось накопление значительного количества уксусной кислоты - до 8,0 г/л, что резко ингибировало накопление биомассы и синтез а-кетоглутарата. В дальнейшем уксусная кислота потреблялась дрожжами.
Одним из факторов, влияющих на интенсивность биосинтеза а-кетоглутарата, является обеспечение клеток кислородом. И.Т. Ермаковой (1970а,б) исследовано влияние аэрации на рост трех штаммов Y. lipolytica (212, 585 и 695), растущих на среде с гсксаде-каном в условиях дефицита тиамина. Отмечается, что в условиях низкой аэрации (0,15 г Ог/л ч), процесс роста культуры сильно растянут, он заканчивается только на десятые сутки, при этом достигнута высокая биомасса (4,1 г/л), в то время как содержание а-кетоглутарата не превышало 1,5 г/л. При более высокой аэрации среды (0,46 - 0,76 г Ог/л в час) рост дрожжей заканчивался к четвертым суткам, при этом накопление биомассы составляло 2,7 r/л, а количество а-кетоглутарата возрастало в 4 раза. Дальнейшее повышение аэрации в пределах (0,76 — 2,70 г Ог/л ч) уже не оказывало влияния на накопление биомассы и синтез а-кетоглутарата.
Французкими исследователями предложен процесс биосинтеза КГК при культивировании в условиях достаточного обеспечения клеток кислородом (скорость подачи воздуха - 0,2 л Ог/л среды в мин). При этом природный штамм С. lipolytica накапливал 31,5 г/л КГК, а мутантный штамм - 66,6 г/л КГК (патент Франции, 1974).
Для дрожжей Y. lipolytica 695, растущих на глюкозе и ацетате в условиях лимитирования роста тиамином, изменение интенсивности аэрации от 5-10% до 90% от насыщения не оказывало заметного влияния на характер роста и на удельную скорость роста культуры в экспоненциальной фазе (Ермакова с соавт., 1979а). Однако, концентрация растворенного в среде кислорода в значительной степени определяла уровень биомассы и накопление кислот. При одной и той же исходной концентрации тиамина в среде в условиях низкого обеспечения клеток кислородом (рОі=5-10% от насыщения) биомасса дрожжей была в 1,5-2 раза выше, чем при высоком обеспечении клеток кислородом (рО2=60-90% от насыщения). Интенсивность биосинтеза а-кстоглутарата в условиях низкого обеспечения клеток кислородом, наоборот, значительно понижалась (в 2 - 3 раза). О.Г. Чернявской (1998) показано, что интенсивный синтез а-кетоглутарата из этанола дрожжами Y. lipolytica осуществлялся при низкой концентрации кислорода в среде (5-8% от насыщения). Это является уникальной особенностью данного процесса, поскольку другие процессы синтеза органических кислот - а-кетоглутарат из //-алканов и глюкозы, пируват - из глицерина, лимонной и изолимонной кислот из //-алканов и этанола - с помощью дрожжей осуществлялись при значительно более высокой концентрации кислорода в среде. При концентрации кислорода в среде 5-8%, по сравнению с концентрацией кислорода 50-55%, выше удельная скорость синтеза и накопление в среде а-кетоглутарата, а также выше максимальная удельная скорость роста и накопление биомассы. В условиях дефицита тиамина при низкой концентрации кислорода в среде (5-8%) по сравнению с высокой концентрацией кислорода (50-55%) в клетках дрожжей показано увеличение активности ферментов начальных этапов окисления этанола, центральных путей метаболизма, а также карбоксилирующих ферментов - ацетил-СоА-карбоксилазы и иируват-карбоксилазы (Чернявская, 1998; Chemyavskay el al., 2000).
И.Т. Ермаковой показано, что дрожжи Candida, растущие на гексадекане, способны к сверхсинтезу а-кетоглутарата не только в условиях лимита тиамина, но и при определенном количестве азота в среде культивирования. Так, если для накопления максимального количества биомассы дрожжами С. rugosa было достаточно 100 мг/л азота, то для максимального биосинтеза а-кетоглутарата концентрация азота должна быть увеличена до 200 мг/л. Обращает на себя внимание факт, что накопление биомассы, а также кетокислот продолжается и после полного исчерпания азота из среды (Ермакова с соавт., 1969). Синтез а-кетоглутарата находится в прямой зависимости от исходного содержания азота в среде в определенной области концентраций. Количество кетокислот в культуралыюй жидкости, синтезируемое единицей биомассы, последовательно растет от 0,23 г/г при концентрации азота в среде 20 мг/л (C:N = 300) до 1,53 г/г при концентрации азота 210 мг/л (C:N = 30). Увеличение содержания азота до 630 мг/л не приводило к значительному повышению количества кетокислот. Позднее О.Г. Чернявской (1998) также отмечается важное влияние азота для сверхсинтеза а-кетоглутарата из этанола. Активный синтез а-кетоглутарата наблюдался при концентрации азота в среде в период синтеза 0,9 — 1,0 г/л. В этом исследовании было показано потребление азота в период синтеза а-кетоглутарата и обнаружена связь более высокой удельной скорости синтеза а-кетоглутарата с большим потреблением азота в период синтеза.
В настоящей главе в большем объеме представлены результаты многолетних исследований сотрудников ИБФМ РАН по изучению сверхсинтеза метаболитов дрожжевыми организмами. В данное время эти исследования позволяют относительно полно ответить на вопрос, какие метаболиты, в каком количестве и при каких условиях могут выделяться при росте дрожжей на ряде широко используемых источниках углерода, в том числе на глюкозе, этаноле и «-алканах. Результаты проведенных работ позволяют заключить следующее: 1. Лимитирование роста дрожжей компонентами питательной среды приводит к выделению клетками тех или иных метаболитов во многих, но далеко не во всех случаях. В общей форме можно сказать, что как появление процесса сверхсинтеза, так и состав, количество и соотношение выделяемых веществ зависят от организма, источника углерода и фактора (компонента среды), лимитирующего рост культуры. 2. По своей способности к сверхсинтезу представители разных видов дрожжей и, даже разные штаммы одного и того же вида могут существенно различаться. Одни из них выделяют те или иные метаболиты при росте на ряде субстратов (глюкоза, этанол, н-алканы) и при лимитировании роста многими отдельными компонентами питательной среды, у других сверхсинтез имеет место только при культивировании на каком-либо источнике углерода и при лимитировании роста только одним определенным компонентом среды.
Очистка ферментов глицеролкиназы, липазы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы
По мнению ряда авторов способность дрожжей Y. lipolytica синтезировать ЛК из «-алканов обусловлена функционированием глиоксилатного цикла после прекращения роста клеток. В клетках алкан-ассимилирующих дрожжей, образующих цитрат, обнаружена высокая активность изоцитрат-лиазы, которая несколько уменьшалась в период лимитирования роста клеток азотом. Штаммы, неспособные синтезировать ЛК, в условиях азотного голодания утрачивали этот фермент (Глазунова, Финогенова, 1976). Данные об участии ферментов глиоксилатного цикла в синтезе ЛК подтверждены в работах немецких (Bekrenset al., 1977) и японских (Aiba, Matsuoka, 1978) исследователей.
Как уже отмечалось, дрожжи Y. lipolytica синтезируют одновременно две кислоты - ЛК и ИЛК. Полагают, что соотношение цитрат/изоцитрат определяется соотношением активности аконитат-гидратазы, изоцитрат-лиазы и НАД-изоцитратдегидрогеназы (Глазунова, Финогенова, 1976; Финогенова с соавт., 1979; Финогенова, 1982). В результате сравнительного изучения активности ферментов цитратного и глиоксилатного циклов в клетках трех штаммов Y. lipolytica (мутанта 1, мутанта 2 и природного), продуцирующих, соответственно ЛК, ИЛК и обе кислоты одновременно, были установлены следующие различия. Мутант 1 - продуцент ЛК - отличался от родительского штамма более низкой активностью аконитат-гидратазы и высокой активностью изоцитрат-лиазы; мутант 2 - продуцент ИЛК - имел более высокую активность аконитат-гидратазы и низкую активность изоцитрат-лиазы. Роль аконитат-гидратазы в образовании ИЛК обсуждалась и в работах других исследователей (Akiyma, 1974; Hattori et al., 1974). Японскими исследователями был получен мутант С. lipolytica с резко уменьшенной активностью изоцнтрат-лиазы (Matsuoka et al., 1980). В отличие от исходной формы, указанный мутант продуцировал преимущественно изоцитрат. Ингибирование изоцитрат-лиазы дикого штамма Y. lipolytica итаконатом и оксалатом также приводило к продукции ИЛК (Финогенова, 1982). Сведения о механизме образования ЛК из глюкозы очень ограничены. Было показано, что ферменты глиоксилатного цикла отсутствовали в клетках дрожжей-продуцентов при росте на глюкозе (Глазунова, Финогенова, 1976; Лозинов с соавт., 1976; Финогенова, 1982). Клетки, синтезирующие цитрат, имели высокую активность цитратсинтазы, высокую суммарную активность НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ и относительно низкую активность аконитат-гидратазы.
Данные о механизме экскреции органических кислот из клеток дрожжей в среду культивирования единичны. Имеются указания на существование активного процесса транспорта малата, зависящего от энергизации мембраны у Saccharomyces cerevisiae (Salmon, 1987). Для Saccharomyces carlsbergensis продемонстрирована система транспорта сукцината с участием переносчика (Петров, 1987). В отношении цитрата было показано, что вакуолярная цитрат-транспортирующая система не функционирует у Y. lipolylica в условиях секреции ЛК (Кулаковская с соавт., 1993). Следовательно, выход цитрата в культуральную жидкость должен был осуществляться непосредственно через плазматическую мембрану. Известно, что основой энергообеспечения транспорта через плазматическую мембрану у дрожжей является работа Н+-АТФазы, создающей ДцН+. Вместе с тем, было показано, что активность АТФазы уменьшалась в 10 раз при переходе дрожжей Y. lipolytica в стационарную фазу роста, когда активность кислотообразования и выход цитрата в культуральную жидкость максимальны. Экскреция цитрата не подавлялась ингибитором АТФазы плазмалеммы дизтилстильбссіролом. На основании этих экспериментов был сделан вывод о том, что процесс выхода ЛК из клеток Y. lipolylica не является энергозависимым (Кулаковская с соавт., 1994). Следовательно, нет оснований предполагать, что выход ЛК осуществляется посредством активного транспорта. Напротив, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что этот процесс носит неэнергозависимый характер и осуществляется путем диффузии.
Особенности энергетического обмена в период экскреции ЛК В литературе имеется много данных о том, что при переходе микробных клеток из экспоненциальной фазы роста в стационарную, вызванную исчерпанием источника азота из среды культивирования, происходит изменение биоэнергетического состояния клеток, т.е. изменение соотношений АТФ/АДФ и/или АТФ/АМФ (Boulton and Ratledge, 1983; Marchal et al., 1977; Mitsushima et al., 1978). Однако, данные относительно концентраций и соотношений адениловых нуклеотидов противоречивы. Сведения о содержании в клетках дрожжей-продуцентов пиридиновых нуклеотидов практически отсутствуют. В связи с изучением механизма образования ЛК из я-алканов Marchal с соавт. (Marchal et al., 1977) рассмаривали содержание адениловых нуклеотидов в клетках Sac-charomycopsis lipolytica. Было установлено, что при переходе культуры в стационарную фазу роста, вызванную дефицитом азота, происходит резкое падение концентрации ЛМФ и АДФ, увеличение содержания АТФ и, соответственно, увеличение энергетического заряда. Эти изменения совпадали с началом продукции кислот. Как известно, ЛМФ является аллостерическим регулятором НАД-изоцитратдегидрогеназы. В период продукции ЛК и без того низкая активность этого фермента полностью тормозится низким уровнем АМФ. Наряду с этим авторы высказывают предположение, что, по всей вероятности, в клетках S. lipolytica цитратсинтаза не контролируется уровнем АТФ и остается активной даже при высоком энергетическом заряде (Boulton, Ratledge, 1980).
Напротив, исследование концентраций адениловых нуклеотидов в работе японских исследователей (Mitsushima et al., 1978) показало, что у дрожжей Y. lipolytica, растущих на глюкозе в условиях лимитирования роста клеток азотом, происходит снижение концентрация АМФ (в 10 раз), АДФ и АТФ (в 5 раз) в фазе синтеза ЛК. При снижении общего пула адениловых нуклеотидов (в 6 раз) соотношение АТФ/АМФ в клетке увеличивалось в 2 раза. Аналогичные результаты были получены для "липидных" дрожжей Candida 107 и Lipomyces starkey. При лимитировании роста азотом происходило существенное снижение пула АМФ (Botham and Ratledge, 1979; Boulton and Ratledge, 1983).
Помимо изучения внутриклеточного содержания адениловых нуклеотидов у дрожжей проводились исследования по влиянию нуклеотидов на образование цитрата изолированными митохондриями. У дрожжей С. lipolytica добавление АТФ в инкубационную смесь приводило к увеличению выхода цитрата из митохондрий, тогда как добавление АМФ - к значительному снижению выхода цитрата (Mitsushima et al., 1978). Оба эти эффекта сильно заметны и у "липидных" дрожжей (Evans et al., 1983а). Авторы показали, что скорость выхода цитрата из митохондрий не зависит от активности цитратсинта-зы, ни от работы цитрат-транслоказы, а определяется активностью НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы, чувствительной к изменению концентрации адениловых нуклеотидов (АТФ и АМФ). Снижение внутриклеточного содержания АМФ и увеличение соотношения АТФ/АМФ в клетках дрожжей, выращенных в условиях лимитирования роста источником азота, приводит к блокировке ЦТК на уровне НАД-изоцитратдегидрогеназы. По мнению исследователей такое событие имеет решающее значение для понимания механизма сверхсинтеза ЛК и липидов дрожжами.
Кроме основной фосфорилирующей дыхательной цепи в клетках микроорганизмов обнаружена альтернативная цианидрезистентная дыхательная цепь, перенос электронов по которой не сопровождается генерацией трансмембранного потенциала. То есть, функционирование нефосфорилирующей альтернативной дыхательной цепи позволяет осуществлять реокисление НАД без генерации энергии (Акименко, 1989; Акименко, Меденцев, 1989; Акименко, Головченко, 1989).
Индукция ферментов глиоксилатного цикла у Y. lipolytica и в органах млекопитающих
Клетки живых организмов сохраняют постоянный баланс между различными процессами расщепления поступающих извне белков, углеводов и жиров и биосинтетическими процессами, в ходе которых образуются сравнительно крупные клеточные компоненты. Клеточный гомеостаз достигается благодаря функционированию эффективной и сложной системы регуляции, приводящей каждый отдельный метаболический процесс в строгое соответствие с нуждами клетки в целом. Чтобы достичь эффективного функционирования этой сложной системы, в клетке должна существовать координированная связь между метаболическими процессами.
Поскольку практически все клеточные реакции катализируются ферментами, координация метаболизма в существенной мере сводится к регуляции интенсивности протекания ферментативных реакций, образующих метаболические пути. Эффективность биологического катализа в клетке может регулироваться как изменением количества катализатора-фермента, так и активацией или ингибированием ферментативной активности. Количество фермента в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Скорость синтеза данного фермента в микробной клетке может сильно изменяться в зависимости от условий культивирования. Существуют ферменты, которые всегда присутствуют в клетке в относительно постоянных количествах (конститутивные ферменты). В отличие от них, индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на появление в среде определенного субстрата. Гены, контролирующие синтез индуцибельных ферментов, обычно находятся в состоянии репрессии и вводятся в действие только в присутствии индуктора.
Механизмы регуляции ферментативной активности на уровне синтеза ферментов являются достаточно медленными, для их реализации необходимы по меньшей мере часы. Более быстрыми являются регуляторные механизмы, направленные непосредственно на ферменты. Для многих ферментов, катализирующих ключевые стадии метаболических путей, существуют модуляторы их активности. Ярким примером подобной регуляции может служить ингибирование первого фермента метаболического пути конечным продуктом этого пути. Достаточно подробно физико-химические механизмы регуляции активности ферментов изложены в монографии Б.И. Курганова (Курганов, 1992).
В дополнение к вышеописанным механизмам, регуляция метаболизма достигается физическим разделением некоторых метаболических путей. В эукариотических клетках существуют разделенные мембранами компартменты - органеллы. Органеллы содержат специфический набор белков, специализированных для выполнения определенных функций. Такой вид структурной организации позволяет как синтетическим, так и деградатив-ным процессам происходить одновременно в одной и той же клетке, но в различных ком-партментах. Например, синтез жирных кислот происходит в цитозоле, в то время как их деградация - в митохондриях.
Вместе с тем, существует много примеров, когда как синтетические, так и деградативные процессы происходят в одном клеточном компартменте. Так деградация и синтез глюкозы происходят в цитозоле. Эти два процесса не являются полиостью идентичными, так как несколько стадий глюконеогенеза перекрещивается с необратимыми реакциями гликолиза. На этих этапах происходит замена киназных реакций на фосфатазы и карбоксилазы, катализирующих обратные реакции кииаз. Эти ферменты обычно регулируются через классические регуляторные механизмы, такие как фосфорилирование, аллостсрическая активация/ингибирование. Одним из примеров может служить регуляция фосфофруктокиназы фруктозо-2.6-бисфосфатом. Однако существуют наблюдения, которые указывают на более высокую степень клеточной организации ферментов в пределах органелл, которая гарантирует строго определенную компартментализацию интермедиатов метаболизма. Было показано, что последовательные ферменты метаболического пути могут взаимодействовать как между собой, так и со структурными элементами клетки с образованием высокоорганизованных белковых комплексов (Srere and Estabrook, 1978; Srere, 1987; Ovadi, 1995).
Для определения таких фермент-ферментных комплексов был предложен термин — метаболой (Srere, 1985; Robinson and Srere, 1985). Включение в состав метаболона структурных элементов клетки составляет главное различие между метаболоном и мультиферментным комплексом. Фиксация мультиферментного комплекса на специфических якорных площадках клеточных структур означает его превращение в метаболой. Например, пируватдегидрогеназный комплекс, адсорбированный на специфическом центре внутренней мембраны митохондрий, природу которого еще предстоит определить, может рассматриваться как метаболой (Курганов и Любарев, 1991).
Физиологический смысл организации ферментов в метаболон состоит в повышении скорости метаболического процесса вследствие уменьшения времени диффузии интермедиатов к активным центрам ферментов (Шноль и др., 1979; Welch, 1977a,b), в компартментализации процесса, препятствующего нежелательному вовлечению интермедиата в другие метаболические пути (Фридрих, 1986), а также в возможности управления метаболическим путем, представленным организованным комплексом, как единым целым (Kurganov, 1987ab). Рідея о том, что фермент-ферментные взаимодействия возможны не только между компонентами хорошо охарактеризованных мультиферментных комплексов и конъюга-тов, но также и между так называемыми "растворимыми" индивидуальными ферментами в последнее время получила широкое распространение. Операционное определение "растворимые ферменты" означает только то, что эти ферменты могут быть экстрагированы из клетки водными растворами в виде отдельных единиц, сохраняющих каталитическую активность. Относительная легкость выделения и кристаллизации сделала эти белки популярными объектами исследований, и большая часть наших сведений о структуре и функциях ферментов получена именно при изучении растворимых ферментов.
В живой клетке существуют два главных компартмента, где локализованы "растворимые" ферменты: цитоплазма и митохондриальный матрикс. В обоих оргаисллах концентрация ферментов довольно высока (Hess and Boiteux, 1972: Srere, 1967). Вопрос заключается в следующем: содержат ли эти органеллы случайные смеси макромолекул (и среди них ферменты), как предполагается в большинстве учебников биохимии, или же эги компартменты обладают некоей тонкой, но физиологически важной суборганизацией, исчезающей при разрушении клетки.
Большую часть растворимых ферментов цитоплазмы составляют ферменты, участвующие в гликолизе. В дрожжевой клетке, например, на ферменты гликолиза приходні ся около 65% всего растворимого белка (Hess et al., 1969). В литературе описано несколько примеров фермент-ферментных взаимодействий между ферментами гликолиза (Ovadi, Keleti, 1978; Ovadi et al., 1978; Grazi, Trombetta, 1980; Patthy, Vas, 1978; Batke et al., 1980; MacGregor et al., 1980; Pontremoli et al., 1978; Pontremoli et al., 1979; Kochetov et al., 1970). Вместе с тем необходимо отметить, что имеющиеся данные о взаимодействии ферментов гликолиза друг с другом немногочисленны и зачастую противоречивы (Фридрих, 1986). У млекопитающих и дрожжей известно лишь небольшое число гликолитических ферментов, образующих комплексы. У Е. coli, напротив, по-видимому. существует мультифсрментный комплекс, включающий все ферменты гликолиза. Этот комплекс способен превращать глюкозу в пируват, т.е. представляет собой частицу, содержащую полный набор ферментов данного метаболического пути (Ottaway, 1979; Gorringe, Moses, 1980).
