Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Окислительный стресс 7
1.1, Источники АФК 8
1.2. Механизм действия АФК 9
1.3. Защитные системы против окислительного стресса 9
1.3.1. Антиоксидантные системы 9
Альтернативные переносчики электронов (терминальные оксидазы) 11
Образование изоформ ферментов 12
1.3.4. Системы, поддерживающие редокс-потенциал в клетке 13
1.3.5. Системы, восстанавливающие повреждения 20
1.3.6. Полиамины в защите клеток от окислительного стресса 21
1.4. Регуляция генной экспрессии антиоксидантных систем 22
Глава 2. Тепловой стресс 24
2.1. Белки теплового шока 25
2.2. Регуляция синтеза белков теплового шока 27
2.3. Убиквитин 28
2.4. Белки общего стрессорного ответа 29
2.5. Трегалоза ..30
2.6. Спирты, участвующие в защите клеток от теплового воздействия..32 Глава 3. Этанольный стресс 32
3.1. Влияние этанола на плазматическую мембрану 32
3.2. Метаболизм этанола 34
III. Экспериментальня часть
Глава 4. Материалы и методы исследования 36
4.1. Микроорганизмы и условия выращивания 36
4.2. Определение активности дыхания 36
4.3. Создание стрессовых условий 36
4.4. Определение выживаемости клеток 37
4.5. Определение влияния рН на выживаемость клеток 37
4.6. Экстракция и определение цАМФ 37
4.7. Получение бесклеточных экстрактов 37
4.8. Определение супероксиддисмутазы 38
4.9. Определение каталазы 38
4.10. Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 38
4.11. Определение глутатионредуктазы 38
4.12. Определение НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы 39
4.13. Определение белка 39
4.14. Ультратонкие срезы клеток 39
IV. Результаты и обсуждение
Глава 5. Адаптация Y. lipolytica к действию оксидантов 40
5.1. Выживаемость клеток в зависимости от действия оксидантов (Н202, менадиона и юглона) 40
5.2. Перекрёстная устойчивость Y. lipolytica к различным оксидантам 43
5.3. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica 44
Глава 6. Адаптация Y. lipolytica к действию температуры 46
6.1 Выживаемость Y. lipolytica после воздействия температуры 46
6.2. Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам 47
6.3 Влияние рН на термоустойчивость Y. lipolytica 49
6.4. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica в условиях теплового стресса 50
Глава 7. Адаптация Y. lipolytica к действию этанола 51
7.1 Выживаемость клеток после воздействия этанола 52
7.2 Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам 53
7.3 Активность антиоксидантных ферментов в условиях этанольного стресса 55
Глава 8. Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов 56
8.1 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного стресса 56
8.2 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях теплового стресса 57
8.3. Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на окислительный и тепловой стрессы 58
8.4 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях этанольного стресса 63
8.5 Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на действие этанола 64
Глава 9. Изменение динамики внутриклеточного пула цАМФ при воздействии оксидантов, температуры и этанола 65
Глава 10. Изучение изменений ультраструктуры клеток Y. lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов 69
ЮЛ. Ультраструктура клеток из различных фаз роста 69
10.2. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях окислительного стресса 71
10.3. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях теплового шока 72
10.4. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях этанольного стресса 74
V. Выводы 77
Vi. Список литературы
- Защитные системы против окислительного стресса
- Регуляция синтеза белков теплового шока
- Микроорганизмы и условия выращивания
- Выживаемость клеток в зависимости от действия оксидантов (Н202, менадиона и юглона)
Введение к работе
Актуальность проблемы 2
Состояние вопроса 3
Цель и задачи исследования 4
Научная новизна 5
Практическая значимость 5
Апробация работы 6
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Защитные системы против окислительного стресса
В аэробных условиях живые клетки, включая микроорганизмы, восстанавливают молекулярный кислород по 4-х электронному механизму с образованием воды. Неполное восстановление кислорода может приводить к образованию АФК. В результате одно-, двух- или трех электронного восстановления кислорода происходит образование О2", Н2О2 и ОІҐ (Stephen and Jamieson, 1996).
Митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и, поэтому содержат многочисленные редокс-переносчики и центры, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до супероксидного радикала, в основном, на уровне комплекса I, III (Goidot at al., 1993). Результаты экспериментов с субмитохондриальными частицами указывают на то, что в комплексе I центром, генерирующим АФК, может быть или собственно флавин, или его комплекс с радикалом НАД , а в комплексе III - генерация осуществляется при помощи Q-цикла (Андреев и др., 2005).
Источниками образования супероксидного радикала и Н2О2 у аэробных микроорганизмов могут быть также ферменты, локализованные в других компартментах клетки (Dalton et al., 1999). К ним относят НАД(Ф)Н-оксидазу, ксантиноксидазу, глюкозооксидазу, моноаминооксидазу, лактатоксидазу, этанолоксидазу, цитохром Р-450 и др. В свою очередь, супероксидный радикал при взаимодействии с другим радикалом, N0 , может образовывать еще более сильный биологический окислитель - пероксинитрит: (ONOOH): 02 + N0" - ONOOH (Stephen and Jamieson, 1996). Гидроксильный радикал (ОН ) может также образовываться в результате реакции Фентона из Н2О2 в присутствии ионов двухвалентного железа (Fe ):
Н202 + Fe2+ ОН + ОН1 + Fe3+
В образовании АФК определенная роль принадлежит тяжёлым металлам, в частности, меди. В ее присутствии отмечено разложение перекисей липидов до пероксильных и алкоксильных радикалов, участвующих в процессах перекислого окисления липидов. Медь также катализирует образование гидроксильного радикала из Н2О2 в реакции Габера-Вейса (Chen et al., 2002): Н202 + 02 - ОН" + ОН + о2
Одним из конечных продуктов данной реакции является высокореакционный синглетный кислород (Ог), который также может генерироваться в результате действия ультрафиолетового или радиационного облучения в реакции фотосенсибилизации (Stephen and Jamieson, 1996).
АФК являются высокотоксичными соединениями, способными убивать живые клетки. Механизм действия АФК обусловлен их способностью к окислению ДНК (Dalton at al., 1999), белков (Stephen and Jamieson, 1996) и липидов (Mutoh et al., 1995).
Основное повреждающее действие на ДНК оказывает гидроксильный радикал (ОН), который связывается в молекуле нуклеиновой кислоты с гуанином, образуя 8-гидроксигуанин (маркер окислительного стресса). Необходимо отметить, что 0{ и Н2О2 непосредственно не реагируют с ДНК, но могут быть источниками ОН" (Dalton et al., 1999).
При окислении липидов под действием АФК происходит образование жирных короткоцепочечных кислот, что приводит к нарушению структурной интеграции и повышению текучести мембраны (Mutoh et al., 1995). Некоторые конечные продукты окисления липидов, такие как эпоксиды и альдегиды, способны непосредственно повреждать ДНК и инактивировать белки (Murphy et al., 1998).
Повреждение белков под действием АФК включает окисление аминокислотных остатков гистидина, аргинина, лизина, пролина, цистеина и метионина, что увеличивает вероятность их протеолиза, снижая биологическую активность белков (Stephen and Jamieson, 1996).
Один из способов защиты клетки от АФК - увеличение уровня антиоксидантных ферментов: каталазы (Cohen et al., 1988), супероксиддисмутазы (Jamieson, 1995), глутатионпероксидазы (Inoue et al., 1993), глутатионредуктазы (Ohtake and Yabuuchi, 1991) и других. Определенное значение в детоксикации АФК имеют также хинон-редуктаза и цитохром с пероксидаза (Gibson and Large, 1985).
Каталаза катализирует диспропорционирование Н2О2 до НгО и Ог, защищая клетки от окислительного эффекта Н2О2. Известны два типа каталаз, филогенетически далёких друг от друга - монофункциональные каталазы, и бифункциональные каталазы -пероксидазы. При функционировании первых - донором электронов является Н2О2 (Км 2.5 - 6.5 мМ), во втором случае - различные органические соединения (Км 0.2 - 0.7 мМ): пирогаллол, диаминобензидин, диметоксибензидин, дианизидин, НАД(Ф)Н и др.
Каталаза обнаружена у всех аэробных организмов, у многих аэротолерантных бактерий родов Clostridium (Гаенко и др. 1985), Bacteroides (Gregory et al., 1997), Porphyromonas (Love and Redwin, 1994), Acetobacterium, Desulfotomaculum (Брюханов и др. 2002), Desulfovibrio (Dos Santos et al., 2000) и у некоторых архей родов Methanobrevibacter (Брюханов и др., 2002), Methanosarcina, Methanococcus (Bult et al., 1996). Пероксидаза широко распространена у растений и животных (Derek and Jamieson, 1998), за редким исключением у бактерий и архей (Брюханов и др., 2004).
У дрожжей S. cerevisiae обнаружено два типа каталаз: каталаза А и каталаза Т, кодируемые соответственно генами СТА1 и СТТ1 (Izawa et al., 1996). Каталазные гены являются ипдуцибельными. Мутантные штаммы дрожжей Ctalp и Cttlp, лишённые генов СТА1 и СТТ1, даже в стационарной фазе роста проявляют повышенную чувствительность к Н202 (Izawa et al., 1996).
Регуляция синтеза белков теплового шока
Различают два основных пути индукции экспрессии генов БТШ: специфический -в ответ на температурное воздействие, и общий - в ответ на другие стрессы (например, голодание; окислительный и осмотический стрессы; воздействие слабых органических кислот; высоких концентраций этанола и низких значений рН). Первый ответ микробной клетки индуцируется преимущественно повышением температуры и опосредован белок -транскрипционным активатором (heat shock factor, HSF) (Sakura and Takemori, 1993). HSF в виде гомотримера способен связываться с участком промотора гена белков теплового шока (коротким, консервативным элементом ДНК, heat shock element, HSE). Характерной особенностью HSE является наличие повторяющегося мотива из 5 нуклеотидов, который определяет взаимодействие HSF - HSE. У дрожжей таким образом регулируется экспрессия белков теплового шока 104 и 70 (Zahrihger et al., 1997).
Предполагают (Mager and De Kruijff, 1995), что HSF активируется путём самоактивации, с участием белка теплового шока 70 (Hsp70), а также в результате освобождения мембранного белка - термосенсора. В пользу первого способа свидетельствуют данные о том, что in vitro мономеры HSF под воздействием теплового стресса самостоятельно образуют гомотример, который связывается с HSE и инициирует экспрессию генов белков теплового шока. В ответ на тепловой стресс повышается активность HSF в 30-100 раз, которая сохраняется в течение 1 ч. Второй способ активации HSF, опосредованный Hsp70 (негативная регуляция HSF), объясняет временный характер ответа клеток на тепловой стресс. В начале ответа при появлении множества несвёрнутых белков, комплексы HSF- Hsp70 распадаются, видимо, из-за большого сродства Hsp70 к таким белкам, а освобождающиеся мономеры HSF ассоциируют с образованием функционально активных тримеров. Когда в процессе теплового стресса повышается уровень Hsp70 - комплекс восстанавливается, и образование тримеров HSF прекращается. Эта гипотеза подтверждается данными о том, что у про и -эукариот мутация в Hsp70 приводит к экспрессии генов БТШ при оптимальной температуре роста (Werner-Washburne et al., 1989). Третий способ предполагает снижение вязкости мембран, образование доменов с небислойной структурой, освобождение белка-термосенсора, его взаимодействие с HsF (Horvath et al., 1998).
Второй путь активации экспрессии БТШ опосредуется белком-регулятором Msn2/Mns4 (140 кДа), узнающим участок промотора гена, который называется STRE (stress response element) и имеет характерную последовательность нуклеотидов ССССТ (сокращённо СД") (Терешина, 2005). Таким способом у дрожжей S. cerevisiae осуществляется индукция экспрессии генов cttl (каталазы Т), trsl и trsl (1 и 2-й субъединиц трегалозосинтетазы). Регуляция активации генов через STRE имеет место при различных видах стресса и объясняет факт индукции синтеза БТШ и трегалозы при других стрессах, что указывает на универсальный характер данных соединений.
Кроме двух вышеописанных основных путей индукции генов БТШ обнаружены и другие способы регуляции. Так, у S. cerevisiae существуют два фактора Yapl и Yap2 транскрипции, регулирующих индукцию БТШ 30 (Hsp 30), но не через HSE и STRE, а по неизвестному пока пути. Кроме того, как описано выше (Schnell et al., 1992), Yapl участвует в регуляции синтеза антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы).
Увеличение уровня Hsp 30 происходит при действии повышенной температуры, оксидантов, обработки этанолом и слабыми органическими кислотами (например, сорбиновой кислотой). Поэтому Hsp 30 можно рассматривать как «белок общего ответа клетки на стресс» (Плакунов и др., 2004). Считают (Seymour and Piper, 1999), что увеличение количества Hsp 30 каким-то образом приводит к снижению текучести мембраны, регулируя её функцию при тепловом стрессе.
Механизм трансдукции с участием малых ГТФаз семейства RAS и цАМФ, по-видимому, также имеет место при негативной регуляции деятельности промоторов генов Hsp70, ssa3, ubll4, cttl, белка теплового шока 12 (De Virgilio et al., 1991). Активность STRE регулируется также Yapl и негативно регулируется цАМФ - зависимой протеинкиназой. Однако Yapl не влияет на путь HSE-HSF (Horvath et al., 1998).
Несмотря на общепринятое мнение об участии БТШ в формировании термоустойчивости, накапливаются данные о том, что, например, у дрожжей S. cerevisiae стресс-белки не играют определяющей роли в возникновении устойчивости клеток к повышенной температуре (Феофилова, 2003). Для выживания при высоких температурах у дрожжей основу защиты от стресса обеспечивает убиквитин. Было показано (Plesofsky-Vig and Brambl, 1990), что данный белок присоединяется к N-концу любого полипептида и делает его мишенью для разрушения протеазами. Это "метка смерти" для белков, при помощи которой происходит выбраковка поврежденных, недостроенных и функционально неактивных полипептидов. Убиквитин - полипептид с м.м. 8 кДа, состоящий из 76 аминокислот, участвующий в универсальной, нелизосомалыюй, АТФ зависимой деградации полипептидов у эукариотных организмов. Показано, что убиквитин активируется АТФ по карбокси-терминальному остатку глицина, затем связывается с є -лизиновой группой белка, предназначенного для разрушения, и в таком комплексе полипептид подвергается протеолизу. Ассоциированный с убиквитином белок разрушается в особых мультикомпонентных комплексах, называемых «протеасомами». Убиквитин не синтезируется в период вегетативного роста клетки при оптимальных температурных условиях, а интенсивно вырабатывается при повышении температуры, принимая активное участие в процессе адаптации клеток к тепловому воздействию. Убиквитин также может принимать участие и в других защитных механизмах, например, при споруляции клеток для поддержания жизнеспособности спор (Plesofsky-Vig and Brambl, 1990).
Предполагается (Fung et al., 1995) также, что температурная устойчивость клеток связана с малыми цитоплазматическими РНК (G8 РНК), которые необходимы для селективной трансляции мРНК в условиях стресса.
Микроорганизмы и условия выращивания
У прокариотных микроорганизмов (Е. coli) окисление этанола происходит при участии НАДФ+- зависимых алкогольдегидрогеназ. У эукариотиых микроорганизмов (типичных бродилыциков дрожжей S. cerevisiae) - при участии НАД+- зависимых алкогольдегидрогеназ (АДГ). Нетрадиционные дрожжи Y. lipolytica с аэробным типом обмена не способны вырабатывать этанол, но могут его использовать в качестве источника углерода при концентрации 3%. Более высокие концентрации этанола для Y lipolytica являются токсичными. У Y. lipolytica было обнаружено наличие одной НАД -зависимой и трёх НАДФ+ - зависимых алкогольдегидрогеназ. Следует отметить, что молекулярный вес НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы у Y. lipolytica намного больше (240 кДа), чем у классических дрожжей S. cerevisiae. С помощью гель электрофореза на клетках Y. lipolytica показано (Barth and Gaillardin, 1997), что НАДФ+ - зависимые алкогольдегидрогеназы различаются по субстратной специфичности. Их локализация зависит от фазы роста и источника углерода в среде.
Также было показано (Ильченко и др., 2005), что при выращивании дрожжей Y lipolytica на этаноле в концентрации 1 - 1.5% активность НАД+ - зависимой АДГ была очень низкой. Исследователи предположили участие в окислении этанола других ферментных систем, таких как алкогольоксидазы (АО, КФ 1.1.3.13). Фермент АО был дифференцирован на два - мембранный, окисляющий спирты С4 - С% и растворимый, окисляющий спирты Сі - С5 (Сингх, 1995). Отмечено, что максимальная индукция активности АО наблюдалась в первые часы культивирования дрожжей Y. lipolytica и только при высокой концентрации этанола (не менее 200 мМ). Это свидетельствует об ограниченном участии АО в окислении этанола до ацетальдегида. Авторы считают, что генерируемая при этом Н2О2 является основным субстратом для инициации пероксидазных реакций.
Окислительный метаболизм этанола в клетках эукариот включая млекопитающих, сопровождается образованием значительного количества органических перекисей, что приводит к перекисному окислению липидов (ПОЛ). Органические гидроперекиси разрушаются при участии каталазы (Gille et al., 1993). В клетках Y. lipolytica показано существование футильного цикла (Ильченко и др., 2005): катал аза Н2О2 + этанол ацетальдегид + НгО альдегидредуктаза Ацетальдегид + НАДН этанол + НАД+
Необходимым условием функционирования данного цикла является дополнительное количество ионов Fe. Приведённый выше футильный цикл, вероятно, представляет собой ещё одну потенциальную функцию пероксидазной реакции каталазы, которая состоит в регуляции окислительного метаболизма этанола. Предполагают (Ильченко и др., 2005), что функционирование подобного цикла позволяет нормализовать «работу» дыхательной цепи путём уменьшения потока НАДН на её НАДН -дегидрогеназный участок.
В течение долгого времени считалось, что адаптация микроорганизмов к различным стрессам обусловлена специализированными функциями клеток, позволяющими им выживать при различных неблагоприятных условиях. Однако стресс-реакции правильнее рассматривать в рамках нормального роста и метаболизма. Адаптация клеток к стрессу заключается главным образом в усилении активности тех механизмов, которые действуют при нормальном росте, т. е. при стрессе изменяются лишь соотношения различных активностей клеток. Для некоторых генетических систем это значительное изменение уровня экспрессии, тогда как для других относительно небольшое. Процесс адаптации дрожжей к стрессовым воздействиям на данный момент изучен в основном у S. cerevisiae и фрагментарно у С. albicans и N. crassa. В данной работе мы исследовали адаптацию дрожжей Y. lipolytica с аэробным типом обмена. Эти дрожжи представляют большой интерес для исследователей не только потому, что являются продуцентами многих практически ценных соединений (органических кислот, липаз, цитохрома с и др.). Они являются классической моделью для изучения энергетического обмена клетки: их митохондриальная дыхательная цепь содержит три пункта сопряжения, в чём сходна с дыхательной цепью животных клеток.
В работе изучались дрожжи Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2378 (syn. Yarrowia lipolytica Y-155), полученные из ВКМ ИБФМ им. Г.К. Выращивание дрожжей производили на солевой среде Ридер, содержащей (г/л): 10.0 - глюкозы, 3.0 - (Nl Sdt, 0.7 - MgS04, 0.4 - Ca(N03)2, 0.5 - NaCl, 2.0 - КН2Р04, 0.2 - %-ного дрожжевого экстракта (Difco), микроэлементы по Буркгольдеру, мг/мл: KI - 0.02, Na2B4C 7 - 0.01, MnSC 4 - 0.01, ZnS04 - 0.01, CuS04 5 H20 - 0.01, FeS04 -2 H20 - 0.05, NaMo04 - 0.01. Культивирование проводили при 29С в медицинских колбах объёмом 750 мл со 100 мл среды роста на качалке (200 об/мин). рН среды культивирования дрожжей поддерживали на уровне 5.5. Рост дрожжей оценивали по оптической плотности при длине волны 540 нМ. Хранение культуры осуществляли на твёрдой агаризованной среде указанного выше состава при 4С. Исследовались клетки из экспоненциальной (10-12 ч) и стационарной (24 ч) фаз роста.
Скорость потребления кислорода клетками измеряли на полярографе LP - 7 (Чехословакия) с помощью закрытого тефлоновой плёнкой платинового электрода типа Кларка. Конечный объём пробы составлял 2 мл, температура измерения 20-22С. Концентрацию растворённого в среде кислорода принимали равной 250 мкМ. Активность дыхания выражали в нмоль 02/(мин на 1 мг сухих клеток).
Условия окислительного стресса были смоделированы путём инкубирования клеток в присутствии Н2О2, или супероксид-генерирующих агентов: менадиона (2-метил-1,4-нафтохинон) и юглона (5-окси-1,4-нафтохинон); теплового стресса - путём инкубирования клеток при температуре 45С; этанольного стресса - путём инкубирования клеток в присутствии различных концентраций этанола.
Для адаптации клетки подвергали мягким стрессовым воздействиям: обработке малыми дозами оксидантов (Н2О2, менадиона, юглона), этанола, а также инкубации при 37С. Варьировали концентрацию стрессоров и время предобработки.
Выживаемость клеток в зависимости от действия оксидантов (Н202, менадиона и юглона)
Оказалось, что в клетках из стационарной фазы роста активность каталазы почти в 3 раза превышала таковую в клетках из экспоненциальной фазы роста. Уровень каталазы клеток из экспоненциальной фазы роста после адаптации (0.5 мМ Н2О2 и 50 мкМ менадионом, 60 мин) увеличивался соответственно в 3.3 и 4.2 раза и достигал 93 и 120 мкмоль/(мин на 1 мг белка). Эти величины соответствуют величине каталазной активности у Schiz. pombe после их адаптации к окислительному стрессу (Lee et al., 1995).
Активность СОД наиболее заметно (в 5 раз) возрастала при обработке клеток менадионом, тогда как после преинкубации с Н2О2 активность СОД увеличивалась всего в 1.5 раза. Уровень СОД в клетках Y. llpolytica из стационарной фазы роста был в 2 раза выше, по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что исходный уровень активности СОД у Y. llpolytica был заметно ниже, чем у Schiz. pombe (Lee et al., 1995) и С. albicans (Jamieson et al., 1996), что может объяснить отмеченную выше более высокую чувствительность Y. llpolytica к суперокид-генерирующим агентам.
Были также измерены активности ферментов, поддерживающих редокс-потенциал в клетке: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, обеспечивающей уровень восстановительных эквивалентов, и глутатионредуктазы, поддерживающей пул восстановленного глутатиона (Minard and McAlister-Henn, 2001). Показано (табл. 1), что уровень этих активностей у Y. lipolytica увеличивался как при переходе клеток из экспоненциальной в стационарную фазу роста, так и после их обработки нелетальными дозами оксидантов. При этом глутатионредуктазная активность клеток увеличивалась более чем в 2 раза, а глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная - в 1.5-2 раза, что согласуется с литературными данными (Lee et al., 1995). Так, у Schiz. pombe активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в клетках, иредобработанных менадионом, также увеличивалась в 1.9 раз. Следует отметить изначально более высокий уровень активности этого фермента у Y. lipolytica по сравнению с С. albicans (Jamieson et al., 1996) и Schiz. pombe (Lee et al., 1995).
Мы полагаем, что увеличение выживаемости Y. lipolytica в условиях окислительного стресса после адаптации может быть связано, в том числе, с увеличением активностей антиоксидантных ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы.
Молекулярные механизмы, регулирующие адаптивный ответ клеток на окислительный стресс, до конца не выяснены. Если принять во внимание, что один вид стресса способен индуцировать развитие устойчивости к другим стрессовым воздействиям, можно предположить наличие общего фактора, контролирующего запуск определённых защитных механизмов, посредством сигнальных пептидов или сигма-факторов.
Возникновение толерантности дрожжей к стресс-факторам может быть объяснено снятием негативного регуляторного эффекта (при функционировании RAS-cAMP-PKA пути) на экспрессию стрессовых генов, а также увеличением экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты (Jamieson, 1998; Rolland et al., 2002).
У S. cerevisiae описана индукция транскрипции генов каталазы под действием различных стрессовых воздействий, включая и окислительный стресс. Такая индукция опосредована специфически активируемыми последовательностями, называемыми STREs (stress response element) (Izawa et al., 1996; Marchler et al., 1993). Установлено, что транскрипция генов в определённых условиях регулируется как цАМФ - зависимыми, так и цАМФ - независимыми механизмами (Bissinger et al., 1989). Следовательно, можно полагать, что факторы, изменяющие в клетках уровень цАМФ, будут индуцировать развитие адаптивного ответа у Y. lipolytica.
Механизмы термоадаптации дрожжей в настоящее время изучены недостаточно. Поэтому новые сведения об устойчивости клеток к тепловому стрессу представляют большой интерес для исследователей.
На рис. 5 представлены данные, характеризующие чувствительность клеток различных фаз роста к тепловому воздействию. Видно, что при 45С выживаемость клеток из экспоненциальной фазы роста заметно снижалась: через 5 минут жизнеспособными оставалось 4 % клеток, через 10 мин - менее 0.1%. (кривая 1). В отличие от клеток из экспоненциальной фазы роста, клетки из стационарной были более устойчивы к тепловому воздействию, после инкубирования при 45С (30 мин) выживаемость У. lipolytica сохранялась на уровне 60% (кривая 2).
Изучалась возможность повышения термоустойчивости Y. lipolytica в результате мягкой тепловой предобработки. Условия предварительного теплового воздействия были выбраны эмпирически. На рис. 5 (кривая 3), видно, что инкубация клеток при 37С практически не оказывала влияния на их жизнеспособность, которая сохранялась на исходном уровне в течение 60 мин. Оказалось, что указанное тепловое воздействие приводило к заметному увеличению выживаемости (до 40%) при последующей инкубации клеток при 45С в течение 30 мин (кривая 4).
Ранее было показано (Sanchez et al., 1990), что мягкая тепловая (37С) предобработка S. cerevisiae индуцирует толерантность к последующему воздействию более высоких температур. Это явление известно как индуцированная термотолерантность или «тепловая закалка».
