Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время экстремофильные дрожжи Yarrov/ia lipolytica рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных биотехнологических объектов. Они выступают и в качестве удобной клеточной модели при исследованиях механизмов апоптоза и клеточной дифференцировки. Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, способна быстро расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая сточные воды, нефтяные парафины и ксенобиотики; обладает способностью к высокоэффективной секреции белков во внешнюю среду (до 10 г/л), что приближается к секреторному потенциалу метилотрофных дрожжей родов Pichia и Hansenula, она используется в качестве генетически исследованного и легко культивируемого аналога дрожжевого патогена человека и животных Candida albicans Перечисленные особенности привели к решению о необходимости расшифровки полной геномной последовательности Y. lipolytica. Эта работа была выполнена независимо двумя исследовательскими группами во Франции и США. Наличие доступной для анализа последовательности позволило использовать мощный и быстрый в использовании инструмент протеомики в качестве универсального средства для первичной идентификации белков, задействованных в реализации перечисленных важных особенностей Y. lipolytica. В частности, в 2007 г этим методом были идентифицированы некоторые белки Y. lipolytica. принимающие участие в диморфическом переходе. Однако, до настоящего времени эти исследования носят фрагментарный характер. Так в указанной работе 2007 г для облегчения выполнения эксперимента анализировались только водорастворимые клеточные белки, хотя важность компонентов мембран и клеточной стенки в процессе морфогенеза не вызывает сомнений.
Важной особенностью Y. lipolytica является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН - вплоть до 10.5. Механизмы рН-адаптации Y. lipolytica начали активно изучать с 1997 года, когда был открыт многофункциональный регулятор транскрипции Rim 101. Гомолог RimlOlp
- белок РасС из нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в
частности, из Aspergillus nidulans обусловливает рН-зависимое
переключение экспрессии генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая
влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. В качестве
маркера адаптации секреторной системы Y. lipolytica к изменению рН
внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2 и его продукт АЕР
- субтилизиноподобная сериновая протеаза, обеспечивающая
неспецифический протеолиз внеклеточных источников белка. АЕР
является наиболее массовым секретируемым белком большинства
штаммов Y. lipolytica, её ген послужил источником эндогенных элементов
секреторного сортинга рекомбинатных белков.
Существует также гипотеза о том, что адаптация Y. lipolytica к щелочным значениям рН обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, рН которой «7.3, работа этого механизма становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае Y. lipolytica происходит его смена на Ка+-зависимый симпорт.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений протеома Y. lipolytica, обусловливающих способность этого дрожжеподобного аскомицета к росту при щелочных значениях рН внешней среды.
В соответствии с этой целью решались следующие задачи:
1. С использованием методов обратной генетики изучить влияние рН
в сочетании с другими физиологическими факторами на регуляцию
экспрессии наиболее существенной части секретома Y. lipolytica -
комплекса щелочных протеаз XPR.
2. С использованием методов протеомики идентифицировать
наиболее массовые белки Y. lipolytica, накапливающиеся в культуре при
росте на средах со щелочным значением рН.
3. С использованием метода ПЦР в реальном времени исследовать
физиологические факторы, влияющие на экспрессию кандидатных генов
рН-адаптации.
Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии ранее не изученных генов щелочной протеазы Y. lipolytica помимо XPR2, в том числе, в ответ на изменения рН. На этом примере высказано предположение, что повышение рН снижает физиологическую чувствительность Y. lipolytica к ионам фосфата во внешней среде.
Идентифицировано 7 белков, содержание которых в клетках Y. lipolytica существенно возрастает относительно других при увеличении рН внешней среды с 4.0 до 8.5. Все они представляют собой компоненты митохондрий: ферменты матрикса, порины внешней мембраны, компоненты дыхательной цепи, белки защиты от окислительного стресса и шапероны. Таким образом, можно говорить о том, что адаптация Y. lipolytica к высоким значения рН внешней среды опосредуется интенсификацией работы митохондрий.
Практическая значимость работы. Биотехнологическая значимость работы обусловлена возможностью использования обнаруженных сильных индуцибельных промоторов Y. lipolytica для конструирования универсальных экспрессионных систем.
Идентифицированный нами промотор гена а-
кетоглутаратдегидрогеназы, по-видимому, является одним из самых сильных в клетках Y. lipolytica, растущих при высоких значениях рН среды. Это делает его перспективным элементом для разработки системы экспрессии гетерологичных генов в Y. lipdlytica. Природная
суперпродукция а-кетоглутаратдегидрогеназы может быть использована для получения а-кетоглутарата, промышленной очистки самого фермента, при разработке штаммов-продуцентов различных метаболитов, имеющих в качестве исходного соединения а-кетоглутарат или глутамат.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская конференция молодых учёных и II школа им. Н. М. Эммануэля. Москва, 2006; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008; Конференция, посвященная 90-летию Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. Москва 2009.
Диссертационная работа была доложена на заседании отдела нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» 15 июня 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных издания, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 10 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 191 источник.
