Введение к работе
Актуальность проблемы. Митохондрии часто называют локомотивом клетки. Хотя их роль в образовании АТР посредством окислительного фосфорилирования имеет решающее значение, они выполняют в клетке и другие важные функции, в том числе в катаболическом и анаболическом метаболизме, поддержании гомеостаза Са , образовании активных форм кислорода (АФК), клеточной сигнализации и апоптозе. Предполагается, что окисление биополимеров АФК играет ведущую роль в старении организма [Harman, 1956]. Митохондриальные активные формы кислорода и окислительные повреждения митохондрий, вызванные ими, являются причиной различных патологий, включая диабет, сердечно-сосудистые расстройства, инфаркт, инсульт, нейродегенеративные и другие возрастные заболевания. Неудивительно, что исследователями неоднократно предпринимались попытки замедлить старение с помощью антиоксидантов.
Наиболее успешным с этой точки зрения оказалось использование MitoQ — положительно заряженного (следовательно, транспортирующегося исключительно в митохондрии) липофильного катиона трифенилфосфония, соединенного С10-алифатической цепью с убихиноном, компонентом электронтранспортной цепи митохондрий, обладающего антиоксидантной активностью (см. обзор [Murphy et al., 2007] и ссылки в нем). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты имеют существенные преимущества перед другими антиоксидантами, поскольку они транспортируются в клетки и митохондрии в соответствии с величиной мембранного потенциала, генерируемого соответственно на цитоплазматической и митохондриальной мембранах, благодаря чему их концентрация в митохондриях могут увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет использовать их в низких, нетоксичных, наномолярных и субмикролярных концентрациях. Более того, липофильные антиоксиданты, накапливаясь в липидном бислое внутренней митохондриальной мембраны, могут восстанавливаться (регенерироваться) компонентами дыхательной цепи, что обеспечивает их многократное функционирование. В.П. Скулачёв (см. обзоры [Скулачёв, 2007; Skulachev et al., 2009] и ссылки в них) предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на потенциально более мощный природный антиоксидант пластохинон, функционирующий в фотосинтетической цепи переноса электронов в условиях повышенной концентрации кислорода и увеличенной продукции АФК.
В рамках руководимого В.П. Скулачёвым проекта были синтезированы различные производные пластохинона (под общим названием SkQ, где Sk означает проникающий катион, a Q - пластохинон). «Skulachev's ion» - термин, введенный Д. Грином [Green, 1974]. Показано, что катионные производные пластохинона свободно проникают через бислойные липидные мембраны с образованием диффузионного потенциала расчетной величины. В ряде биологических моделей показано преимущество использования ионов Скулачёва (SkQs) по сравнению с MitoQ, поскольку, как первоначально и предполагалось В.П. Скулачёвым, у SkQs интервал концентраций, в которых
антиоксидантная активность преобладает над прооксидантной, был существенно шире, чем у MitoQ. Наиболее простой и в то же время адекватной моделью для изучения механизма действия SkQs остаются митохондрии. При этом прочно сопряженные митохондрии дрожжей имеют некоторые преимущества по сравнению с митохондриями животных, поскольку они практически лишены эндогенного дыхания, что позволяет исследовать скорости окисления индивидуальных субстратов окисления, и, как мы показали [Kovaleva et al., 2009], не имеют Са /Рн-зависимых пор, что облегчает интерпретацию полученных данных.
АФК могут вызывать не только различные патологии, о которых мы упомянули выше, но и апоптоз. Апоптоз - это генетически запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток.
Для дрожжей в настоящее время показаны многочисленные случаи гибели клеток по механизму апоптоза под действием разных внешних стимулов и внутриклеточных дефектов [Ковалева и др., 2010]. Выявлен ряд апоптотических факторов (метакаспаза-1 (Ycalp), AIF, AMID, Dnmlp, Rho5, GTPa3bi), некоторые из которых (цитохром с, эндонуклеаза G, белок, подобный протеазе HtrA- HtrA2) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве, и выход которых при повреждении внешней мембраны должен означать начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос о том, каким образом осуществляется выход апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий, до недавнего времени не имел ответа. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов из межмембранного пространства. Первый включает в себя активацию, конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и димеризацию проапоптотического белка Вах, члена семейства белков Вс1-2, в результате чего образуется пора [Sheridan et al., 2008; Yamaguchi et al., 2008]. Другим механизмом выхода апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране [Kovaleva et al., 2009]. Дрожжи лишены белков семейства Вс1-2, а информация об индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий крайне скудна и противоречива. Ранее [Kovaleva et al., 2009] в нашей лаборатории было показано, что митохондрии дрожжей аэробного типа обмена Yarrowia lipolytica и Dipodascus magnusii лишены Са /Рн-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры и поры, индуцируемой одновременным добавлением относительно низких концентраций жирных кислот и Са . Однако не все возможности индукции неспецифических пор были исследованы.
Поэтому нами были поставлены следующие цели работы: 1. Исследовать влияние мембранотропных катионов на энергетические параметры митохондрий дрожжей Y. lipolytica;
2. Завершить исследование индукции неспецифической проницаемости в митохондриях дрожжей Y. lipolytica.
В соответствии с целями работы были поставлены следующие задачи:
Выявить антиоксидантное, разобщающее, прооксидантное, ингибирующее и детергентное действие мембранотропных катионов с локализованным и делокализованным зарядами на дыхание и мембранный потенциал митохондрий Y. lipolytica, а также способность мембранотропных катионов усиливать разобщающее действие жирных кислот;
Исследовать возможность индукции неспецифической проницаемости в условиях анаэробиоза;
Исследовать возможность превращения АТР-зависимого К -канала в неспецифическую пору.
Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование влияния ионов Скулачёва (SkQs) на дрожжевые митохондрии. Показано, что в относительно низких концентрациях SkQs не повреждают целостность митохондриальной мембраны, не шунтируют перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий, обладают антиоксидантной и разобщающей активностью, снижают мембранный потенциал. В более высоких концентрациях SkQs ингибируют дыхание в состоянии 3, оказывают прооксидантное, в еще более высоких - детергентное действие. Впервые показано, что только мембранотропные катионы с делокализованным зарядом усиливают транспорт гидрофобных карбоксилатов, в том числе жирных кислот. Обнаружена энергизация митохондрий дрожжей Y. lipolytica в условиях анаэробиоза за счет гидролиза АТР. Найдено, что Са (в присутствии Са ионофораЕТН129) даже в условиях анаэробиоза не индуцирует повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipolytica. Найдено, что в условиях окислительного стресса при действии прооксидантов, особенно при использовании SkQs в концентрациях, вызывающих прооксидантный эффект, АТР-зависимый К -канал митохондрий дрожжей Y. lipolytica превращается в неспецифическую пору.
Практическое значение работы. Данные, полученные при изучении SkQs, используются для оптимизации условий при заживлении ран, а также для лечения патологий митохондриального происхождения, вызванных окислительным стрессом, в частности «возрастных» болезней (катаракта, ретинопатия, макулодистрофия, глаукома, диабет, остеопороз и некоторые другие) (доклинические испытания). Особенно перспективным представляется использование полученных нами данных об усилении ионами Скулачёва разобщающего действия карбоксилатов и других гидрофобных анионов при лечении ожирения. Попытки лечения ожирения с помощью классического разобщителя 2,4-динитрофенола (DNF) неоднократно предпринимались в прошлом (начиная с 40-х годов), однако признавались неудачными из-за заметного токсического действия DNF, добавляемого в высоких концентрациях. При совместном использовании катионного SkQ и анионного DNF появляется возможность многократно уменьшить действующие концентрации DNF.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (2006, Москва); Европейских Биоэнергетических Конференциях (ЕВЕС) (2006, Москва; 2010, Варшава); Конгрессах FEBS (2007, Вена; 2008, Афины; 2009, Прага); 24-й Международной конференции «Yeast Transport and Energetics» (2006, Прага); 2-м Съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России» (2008, Москва); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике, а также 8 тезисов докладов на конференциях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 180 страницах печатного текста, содержит 110 рисунков и 4 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (385 источников, в том числе 349 на иностранных языках).
