Введение к работе
Актуальность работы. Липазы – это гетерогенные катализаторы, которые работают на поверхности раздела фаз. Они играют важнейшую роль в жизнедеятель-ности всей биоты и находят применение в различных отраслях промышленности, прежде всего пищевой, особенно в масложировой отрасли, фармацевтической, химической, кожевенной, текстильной, производстве моющих средств и медицине.
Потребность в липазах испытывает сельское хозяйство, особенно высокопродук-тивное животноводство для производства кормовых добавок. Находят применение липа-зы в области охраны окружающей среды, в частности, для очистки стоков мясной, масло-жировой промышленности, которые труднее всего подвергаются другим видам очистки.
Разумеется, различные области применения требуют наличия липолитических фер-ментов с различными свойствами, прежде всего по селективности, по степени чистоты, устойчивости к различным факторам – температура, рН, способность сохранять фермен-тативную активность длительное время, способность к иммобилизации на различных матрицах и т.д. Таким образом, необходим широкий спектр липолитических ферментов. К сожалению, в России в промышленном масштабе практически не производятся липолитические ферменты, хотя потребность в них велика и приходится закупать дорогие зарубежные ферментные препараты, что сдерживает их широкое применение. Одной из причин такого положения является особенность свойств нативных липаз. Это гетерогенный катализатор, требующий подбора сложных сред, в которых наиболее эффективно он будет работать. Субстрат должен быть доступным для катализатора, для этого нужны эмульгаторы, часто органические растворители, причем те, которые бы не ингибировали фермент. Нативные липазы обычно обладают низкой термостабиль-ностью, невысокими скоростями реакций в условиях, отличающихся от оптимальных, что требует практически во всех случаях разработку методов иммобилизации липолити-ческих ферментов.
Таким образом, поиск новых продуцентов липаз и создание на их основе липолити-ческих ферментных препаратов, обладающих различными свойствами по специфичнос-ти, устойчивости в различных средах, пригодных для решения разнообразного круга задач является одной из актуальных проблем биотехнологии. Разработка технологии промышленного получения липолитических ферментных препаратов требует решения целого комплекса серьезных экспериментальных задач на всех уровнях от лаборатории до производства.
Другая важная проблема, которая существует в пищевой промышленности – это модификация жиров с целью придания им определенных физико-химических и биологи-ческих свойств: нужной консистенции, пластичности, твердости, определенных техноло-гических свойств, прежде всего стабильности, повышение пищевой и биологической ценности. Достигается это обычно регулированием жирно-кислотного состава жиров. Существующие методы модификации жиров, физические и химические, имеют ряд ограничений и недостатков. Наиболее перспективным в этом отношении считается ферментативный катализ. Но для применения ферментативного катализа с целью модификации жиров нужен не только широкий ассортимент липолитических ферментов, но и знание их жирно-кислотной специфичности. Обе эти проблемы – расширение спектра липолитических ферментов и выявление жирно-кислотной специфичности известных и новых ферментных препаратов, являются важнейшими и актуальными проблемами в биотехнологии.
* В руководстве диссертационной работой принимала участие к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии Зиновьева М.Е.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от 28.02.2012 г.
Цель и задачи исследования. Исследование ферментативного гидролиза липидов различного происхождения в системе вода – масло в отсутствии химических эмуль-гаторов с использованием в качестве катализатора липазы из Candida rugosa (Type VII, производство Японии) и изучение условий проведения данного процесса.
Получение нового липолитического ферментного препарата на базе культуры дро-жжей Yarrowia (Сandida) lipolytica Y-3153 (АТСС 34088) и выявление его особенностей.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
-
Выявление особенностей ферментативного гидролиза преимущественно моно-кислотных растительных масел (касторовое и оливковое) и рыбьего жира ферментным препаратом Candida rugosa в системах без эмульгаторов.
-
Установление жирно-кислотной специфичности ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и перспективы применения этого ферментного препарата для получения индивидуальных жирных кислот.
-
Разработка состава питательной среды для повышения липолитической актив-ности дрожжей Yarrowia lipolytica с целью получения нового ферментного препарата – комплекса липаз, продуцируемых данным штаммом дрожжей.
-
Установление свойств липаз дрожжей Yarrowia lipolytica, возможности иммобилизации и способности к гидролизу и модификации жиров и выявление жирно-кислотной специфичности этого ферментного препарата.
Научная новизна. Впервые показано, что ферментный препарат из Candida rugosa может использоваться для гидролиза оливкового и касторового масел без применения эмульгатора, что облегчает последующее выделение жирных кислот (соответственно олеиновой и рицинолевой).
Впервые исследована жирно-кислотная специфичность ферментного препарата из Candida rugosa на примере гидролиза рыбьего жира и обнаружено, что фермент не способен гидролизовать ацильные остатки низкомолекулярных насыщенных жирных кислот до С13:0 и, напротив, проявляет высокую специфичность при гидролизе ацильных остатков пентадециловой (С15:0) и бегеновой кислот (С22:0), что делает его перспективным для получения этих дефицитных высших жирных кислот.
Разработан состав питательной среды для культивирования продуцента липазы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий при снижении затрат на сырьевые компо-ненты среды повысить липолитическую активность культуры в 3,2 раза по сравнению с средой, рекомендованной по паспортным данным.
Подобраны оптимальные условия для получения нового иммобилизованного препарата липазы на базе дрожжей Yarrowia lipolytica и показана его жирно-кислотная специфичность при гидролизе рыбьего жира.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы при получении олеиновой и рицинолевой кислот с использованием ферментативного гидролиза, протекающего при умеренных температурах, атмосферном давлении и в от-сутствии эмульгатора, что обеспечивает простоту аппаратурного оформления процесса.
Полученный новый ферментный препарат на базе продуцента Yarrowia lipolytica может служить основой для дальнейшей пилотной разработки отечественного препарата липазы. Показана его пригодность для модификации жиров.
Достоверность полученных результатов. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.
Апробация работы. Результаты работы доложены на: ХII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и наноматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 9 публикаций, из них: 4 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации и 5 тезисов.
Личный вклад автора. Автор проводила все экспериментальные работы по теме диссертации, принимала участие в обсуждении результатов работы, написании и оформлении статей.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (152 наименований источников). Работа изложена на 134 страницах текста, включает 24 таблицы и 30 рисунков.
