Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аэробное разложение ароматических соединений грам-отрицательными бактериями 16
2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов 18
2.1.2. Подготовительные этапы разложения моно-полигалогенированных фенолов, фенолгидроксилазы 19
2.1.3. Основные пути разложения (хлор)пирокатехинов 21
2.1.3.1. мета-? асщеш ение пирокатехинов 21
2.1.3.2. opwo-Расщепление (хлор)пирокатехинов 23
2.1.4. Гидроксигидрохиноновый путь расщепления 29
Глава 2. Генетические основы разложения ксенобиотиков микроорганизмами 34
Глава 3. Родококки как биодеструкторы ксенобиотиков 43
3. Методы и материалы 53
3.1. Организмы, методы их культивирования 53
3.2. Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у R. opacus lcp 54
3.3. Приготовление бесклеточных экстрактов 55
3.4. Определение активности ферментов 56
3.4.1. Спектрофотометрическое определение активности ферментов 56
3.4.2. Определение активности ферментов методом фтористого ядерно-магнитного резонанса 58
3.5. Анализ образующихся метаболитов методом ВЭЖХ 59
3.6. Анализ образующихся метаболитов методом УФ-спектроскопии 60
3.7. Нативный и SDS-электрофорез 60
3.8. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и аминокислотного состава 61
3.9. Очистка ферментов 61
3.9.1. Очистка ферментов из биомассы штамма R. opacus lcp, выращенной на бензоате 62
3.9.1.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 62
3.9.1.2. Муконатциклоизомераза 62
3.9.2. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 2- хлорфеноле 63
3.9.2.1. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 63
3.9.2.2. Хлормуконатциклоизомераза 63
3.9.2.3. Хлормуконолактондегалогеназа 63
3.9.2.4. Диенлактонгидролаза 64
3*9.3. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus Icp на 4-хлорфеноле. 65
3.9.3.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 65
3.9.3.2. Хлормуконатциклоизомераза 66
3.9.3.3. Диенлактонгидролаза 66
3.9.4. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus Icp на 4-метилбензоате 67
3.9.4.1. Пирокатехин диоксигеназа I 67
3.9.4.2. Пирокатехин диоксигеназа II 68
3.9.4.3. Муконатциклоизомераза 68
3.9.5. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodochrous 89
на феноле. 69
3.9.5.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 69
3.9.5.2. Муконатциклоизомераза 70
3.9.6. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodnii 135 на феноле 71
3.9.6.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 71
3.9.7. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. ruber Р25 на
различных ароматических субстратах. 72
3.9.7.1. Очистка и-гидроксибензоат гидроксилазы 72
3.9.7.2. Очистка протокатехоат диоксигеназы 73
3.9.7.3. Очистка ферментов из биомассы, выращенной на я-толуате 73 3.10.Влияние ЭДТА и я-ХМБ на активность ферментов 74
3.11. Определение кинетических характеристик ферментов 74
3.12. Кристаллизация белков из R. opacus Icp 75 3.12.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 75
3.12.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 75
3.12.3. Рентгено-структурный анализ кристаллов 75
4. Результаты и обсуждение 76
4.1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах 76
4.1.1. Морфологическая диссоциация R. opacus Icp при росте на (хлор)ароматических соединениях 81
4.2. Конверсия фторфенолов родококками 89
4.3. Ферменты обычного орто-путп, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus
Ісрнабензоате 100
4.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 100
4.3.2. Муконатциклоизомераза 102
4.4. Ферменты opmo-пути, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus Icp на 4-
метилбензоате (иора-толуате) 104
4.4.1. пирокатехин 1,2-диоксигеназа I 104
4.4.2. пирокатехин 1,2-диоксигеназа II 107
4.4.3. муконатциклоизомераза 108
4.5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus Icp на 4-хлорфеноле 112
4.5.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 113
4.5.2. Хлормуконатциклоизомераза 118
4.5.3. Диенлактонгидролаза 123
4.6. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus Icp на 2-хлорфеноле 129
4.6.1. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 132
4.6.2. Хлормуконатциклоизомераза 136
4.6.3. Хлормуконолактондегалогеназа 137
4.6.4. Диенлактонгидролаза 140
4.7. Доказательство функций ферментов 141
4.7.1. Клонирование генов, кодирующих ферменты превращения 3-хлорпирокатехина 141
4.7.2. ВЭЖХ и спектральный анализ превращения 2-хлормуконата С1сВ2, ClcF и ClcD2 146
4.8. Превращение 2-фтормуконатов и фтормуконолактонов 149
4.9. Ферменты штамма R. rhodochrous 89, выращенного на феноле 159
4.9.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 159
4.9.2. Муконатциклоизомераза 160
4.9.3. Превращение 2-хлормуконата 161
4.10. Ферменты штамма R. rhodnii 135, выращенного на феноле 162 4.10.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 162
4.11. Ферменты штамма R. opacus 1G, выращенного на феноле 163 4.11.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 163
4.12. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber Р25 165
4.12.1. Ферменты разложения 4-хлорбензоата 165
4.12.1.1. шрд-Гидроксибензоат гидроксилаза 165
4.12.1.2. Протокатехоат диоксигеназа 166 4:12.2. Ферменты разложения шра-гидроксибензоата 167 4.12.3. Ферменты разложения 4-метилбензоата (шра-толуата) 167
4.12.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 168
4.12.3.2. Муконатциклоизомераза 169
4.13. Кристаллизация ферментов 175
4.13.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 175
4.13.2. 3-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 176
4.14. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 178
4.14.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 178
4.14.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 180
4.14.3. Сравнение активных центров диоксигеназ 181
Заключение 192
Выводы 200
Список литературы 202
- Штаммы-деструкторы хлорфенолов
- Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у R. opacus lcp
- Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 2- хлорфеноле
- Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Живые организмы, в том числе микроорганизмы, подвергаясь воздействию различных условий среды и влиянию разнообразных факторов, включая пищевой рацион, температурный режим, уровень рН и солености, адаптировались к условиям окружающей среды. Изучение реакций основного метаболизма у бактерий показало, что за миллионы лет эволюции они приспособились к эффективному использованию природных соединений в качестве источника энергии, углерода, азота, серы и других, необходимых для жизнедеятельности, элементов и блоков. Совершенно иная ситуация возникла, когда в результате сельскохозяйственной и промышленной деятельности человека в окружающую среду стали попадать соединения и продукты их частичной трансформации, не имеющие аналогов или встречающиеся в природе в относительно небольших количествах, например, промышленные химикаты, фармакологические препараты и т.д., оказывающие влияние на все виды живой материи [Landber et al., 1977; Renberg et al., 1980] и вызывающие явный дисбаланс в уже установившихся отношениях. Поэтому изучение взаимодействия появившихся в биосфере соединений и ее биотической составляющей на примере модели «ксенобиотик-бактерия» является чрезвычайно интересным для понимания процессов, происходящих в настоящее время в окружающей среде, и прогноза возможных последствий. Бактерии являются ключевым звеном в углеродном цикле и в этой связи оценка их ответа на атаку ксенобиотиков является принципиальной для построения модели поведения ксенобиотиков в биосфере и в составлении прогнозов, касающихся как охраны окружающей среды, так и влияния ксенобиотиков на различные формы жизни. Данные исследования позволяют: 1) изучить вопрос о приспособляемости бактерий к меняющимся условиям среды; 2) оценить широту метаболического потенциала бактерий; 3) выявить механизмы перестройки метаболических процессов при смене источников питания; 4) выделить и изучить штаммы-деструкторы различных ксенобиотических соединений, что позволит успешно применять их в промышленности в очистных установках.
В современных подходах к рациональному природопользованию можно выделить несколько ключевых моментов:
создание безотходных технологий;
создание технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений;
3) создание технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду в результате практической деятельности человека.
Поскольку в настоящее время применение безотходных технологий ограничено, то наиболее актуальным представляется решение проблем, связанных с разработкой технологий обезвреживания токсичных веществ, уже попавших в окружающую среду. В частности, для решения данных задач в первую очередь необходимо иметь прогнозируемую модель поведения токсиканта в природе и его влияние на биотическую составляющую, в случае нашего исследования - бактерий рода Rhodococcus. В свою очередь, создание такой модели предполагает изучение ответа родококков на воздействие токсиканта на различных - генетическом, биохимическом, физиологическом, молекулярном - уровнях и включает: выделение активных штаммов-деструкторов, определение метаболических путей, по которым происходит процесс биодеструкции, выявление особенностей функционирования этих путей у микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, изучение структуры ферментов и выявление генетических детерминант, обеспечивающих биодеградативный потенциал, установление на молекулярном уровне структур, определяющих различия в субстратной специфичности гомологичных ферментов.
В силу особенностей метаболизма первоначально изучение разложения токсических соединений было проведено у грам-отрицательных бактерий, преимущественно у псевдомонад. Однако исследования грам-положительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а некоторые физиологические отличия, например, устойчивость к стрессовым воздействиям и способность к длительному, в отличии от псевдоманад, периоду метаболической активности, делают их интересным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте. Среди грам-положительных бактерий род Rhodococcus является одним из интереснейших объектов для изучения. Это определяется и широким распространением бактерий этого рода в почве, и сохранением метаболической активности в разных диапазонах температур, и способностью к выживанию в самых неблагоприятных условиях, и, самое главное, первые же исследования метаболического потенциала родококков показали, что эти бактерии могут разлагать широчайший круг абиотических соединений, что определило наш интерес к этой группе бактерий.
При выборе токсических соединений, используемых в качестве модели для изучения влияния на клетки, учитывалось как их распространение, так и оказываемый
токсический эффект. Нами были выбраны галогенированные, с одним-тремя заместителями, моноароматические производные бензоата и фенола. Галогенированные органические соединения широко используются в промышленности и сельском хозяйстве в качестве предшественников при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и дезинфектантов. Так, в одйой Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 000 тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al., 1987; Kitunen, 1990]. От 100 до 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбеливании, что привело к накоплению хлорфенольных соединений порядка микрограмм на литр воды и порядка миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы [Salkinoja-Salonen et al., 1981]. Исследования in vitro показали, что хлорфенолы могут разобщать окислительное фосфорилирование, нарушать микросомальную детоксификацию, влиять на синтез белков и РНК [Lundberg et al., 1980; Erlich et al., 1987; Priston et al., 1987]. Хлорфенолы склонны к О-метилированию с образованием хлоранизолов, димеризации и полимеризации и другим превращениям [Haggblom,1992; Banerni et al., 1993; Laine and Jorgensen, 1996]. Образующиеся продукты биотрансформации могут быть более токсичными, чем исходные соединения [Заборина с соавт.,1997; van Hylckama Vlieg et al., 2000].
Известно, что ни один из современных химических методов очистки (например, термальный) не дает полного избавления от хлорфенолов, кроме того, такие методы чрезвычайно дороги по сравнению с биологическими (для примера - электроннолучевой метод подготовки питьевой воды, который на данный момент считается одним из наиболее эффективных и надежных, требует энергетических затрат 5 кВт-ч/м3 при производительности 50 м /ч [Строкин, 2007]), сжигание хлорфенолов при недостаточно высокой температуре неизбежно приводит к образованию полихлордиоксинов, оказывающихся неизмеримо более токсичными для здоровья людей, а проведение данного процесса при необходимо-высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим. Кроме того, устойчивость хлорфенолов к электрохимической деструкции повышается в ряду: 2,4-дихлорфенол < 2,4,6-трихлорфенол < пентахлорфенол < 4-хлорфенол [Томилов с соавт., 2007] И только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные для здоровья людей и окружающей среды продукты разложения галогенированных фенолов. Этими предпосылками обосновывались выбор субстратов в начале работы и необходимость всестороннего изучения процессов разложения устойчивых соединений. Такой подход позволяет не
только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соединений, но также способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания путей и отдельных ферментов с заранее заданными, желаемыми свойствами.
1.2. Состояние вопроса
К началу настоящей работы было известно, что начальные этапы разложения разнообразных ароматических соединений микроорганизмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интермедиатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболическим путям, широко распространенным у микроорганизмов. Одним из наиболее часто встречаемых ключевых интермедиатов при разложении ароматических соединений является пирокатехин (1,2-дигидроксибензол), превращение которого в Р-кетоадипат по обычному орто-пут [Ornston, 1966] последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа, муконатциклоизомераза, муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза. Иная картина была обнаружена при изучении ферментов, индуцирующихся при росте микроорганизмов на галогенированных субстратах. Так, в биомассе Pseudomonas sp. ВІЗ, выращенной на 3-хлорбензоате, помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-путя, обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа [Dorn, ICnackmuss, 1978а; Schmidt et al., 1980]. Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в р-кетоадипат у Pseudomonas sp. ВІЗ осуществляют хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлактонгидролаза и малеилацетатредуктаза. Данный путь назвали модифицированным орто-путем [Schlomann, 1994]. Эти работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов. Дальнейшие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грам-отрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988]. Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного opmo-uym у грам-отрицательных бактерий, .организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности. Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее зачастую субстратная специфичность ферментов находится в прямой зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al., 1991a,c]. В таком случае различия в субстратной
специфичности аналогичных ферментов надо искать в структуре их активных центров. К началу '-нашей работы была изучена кристаллическая структура (хлор)муконатциклоизомераз и диенлактонгидролаз из грам-отрицательных бактерий и определены те аминокислоты, которые могут определять субстратную специфичность этих ферментов [Cheah et al., 1993]. Значительно позже была предпринята попытка методом сайт-направленного мутагенеза изменить субстратную специфичность (хлор)му-конатциклоизомераз у грам-отрицательных бактерий, однако однозначных результатов получено не было [Vollmer et al., 1998, Kaulmann et al., 2001]. Также ничего не известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз грам-отрицательных бактерий; остался открытым вопрос об основах различий субстратной специфичности хлорпирокатехаз. На момент начала нашей работы практически ничего не бьио известно о ферментах разложения хлорпирокатехипов у родококков, хотя и имелось ограниченное количество публикаций о способности родококков разлагать ароматические соединения [Janke et al., 1988a,b; Straube, 1987] и, учитывая высокую перспективность бактерий этой группы как дектрукторов устойчивых ксенобиотиков, можно было предположить, что родококки, несомненно, представляв интерес для исследователей с точки зрения изучения метаболических путей и ферментов биодеградации токсикантов.
1.3. Цель и задачи исследования
В связи с обозначенными предпосылками, целью работы явилось изучение организации биодеградативных путей бактерий рода Rhodococcus для выявления биохимических и молекулярных основ метаболической активности штаммов-деструкторов устойчивых поллютантов.
Для достижения поставленной цели было необходимо выполнение следующих задач:
Оценка способности бактерий рода Rhodococcus разлагать или трансформировать незамещенные и замещенные ароматические соединения.
Установление путей разложения ксенобиотиков наиболее активными штаммами родококков.
Оценка активности, выделение и характеристика ферментов, участвующих в разложении бензоата, 4-метил-, 4-хлорбензоата, фенола, 2-хлор- и 4-хлорфенола у родококков.
Сравнительный анализ структурных и каталитических особенностей ферментов, участвующих в разложении ксенобиотиков, у родококков.
Клонирование и секвенирование генов, кодирующих ферменты разложения хлорфенолов у родококков.
Кристаллизация хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и расшифровка трехмерной структуры ферментов.
Выявление факторов, определяющих различия субстратной специфичности интрадиольных диоксигеназ, раскрывающих кольцо o/ww-дигидроксибензолов.
1.4. Научная новизна
Проведен широкий поиск среди представителей грам-положительных бактерий рода Rhodococcus на способность разлагать галогенированные ароматические соединения и отобраны наиболее активные штаммы-деструкторы.
Изучены процессы разложения 2- и 4-хлорфенолов, бензоата, фенола, 4-метил-бензоата штаммами R.opacus lcp, R. ruber P25, R. rhodnii 135, R.rhodochrous 89.
Впервые выделены в гомогенном виде и охарактеризованы ферменты разложения
(замещенных)пирокатехинов - (хлор)пирокатехин 1,2-диоксигеназа,
(хлор)муконатциклоизомераза, хлормуконолактондегалогеназа, диенлактонгидролаза -из ряда штаммов рода Rhodococcus. Показано, что рост на ароматиеских субстратах сопровождался индукцией уникального набора ключевых ферментов, в первую очередь диоксигеназ. Мы описали три группы этих ферментов - пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-путп, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей, метилпирокатехин 1,2-диоксигеназы.
Исследовано разложение 3-хлорпирокатехина у Rhodococcus opacus lcp, обнаружен новый модифицированный орто-путь, аналоги которого до сих пор в литературе не описаны. Клонирован оперон, кодирующий ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного opmo-щтн у штамма R.opacus lcp.
Изучены свойства муконатциклоизомеразы обычного о/дао-пути штамма Rhodococcus rhodochrous 89 и установлено, что этот фермент отличается по субъединичному составу и свойствам от всех известных муконатциклоизомераз и занимает промежуточное положение между аналогичными ферментами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий.
Впервые изучено превращение 2-галомуконата (фтор-, хлор-) (хлор)муконатциклоизомеразами грам-положительных бактерий - реакция, которую можно считать определяющей при характеристике ферментов этого класса. Обнаружены их существенные отличия от ферментов из грам-отрицательных бактерий. Показано, что муконат- и хлормуконатциклоизомеразы из R.opacus lcp способны выбирать
.*
направление циклоизомеризации 2-хлормуконата, что приводит к образованию 5-галомуконолактона. Реакцию превращения 5-галомуконолактона в г/ис-диенлактон у R.opacus lcp при росте на 2-хлорфеноле катализирует новый фермент, хлормуконолактондегалогеназа, аналог которого отсутствует в модифицированных орто-иутях грам-отрицательных бактерий. Обнаружена необычная способность муконатциклоизомеразы из штамма Rhodococcus rhodochrous 89 осуществлять превращение 2-хлормуконата, 2-хлор- и 5-хлормуконолактона в i/wc-диенлактон, а не в его /яранс-изомер, что характерно для грам-отрицательных бактерий.
Впервые методом рентгено-структурного анализа расшифрована пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пут штамма R.opacus lcp на основании разработанного нами способа получения высокоочищенных препаратов этих ферментов и наличия их полной аминокислотной последовательности. Показано, что каждый фермент состоит из двух каталитических доменов и одного связующего центрального домена, содержащего две молекулы фосфолипидов. Установлено, что структура центральной части каталитических доменов сходна с таковой других интрадиольных диоксигеназ и содержит атом трехвалентного железа, пятикоординированный .двумя остатками гистидина, двумя остатками тирозина и гидроксилом воды. Обнаружены отличия от других диоксигеназ. В структуре активного центра идентифицирована молекула бензоата (у 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы) и бензогидроксамата (у 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы); вход в активный центр ;ХПК 1,2-ДО не имеет выраженного положительного потенциала. Получены доказательства в пользу того, что отличия субстратной специфичности 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО опосредуются разницей в аминокислотных остатках как в самом активном центре, так и в той части, которая отвечает за связывание фермента с субстратом: Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно), что меняет как стериометрию, так и заряд участков, в которых происходит правильное позиционирование заместителей в молекуле субстрата.
1.5. Практическая значимость
Проведенные нами исследования позволили создать коллекцию наиболее активных штаммов, способных разлагать устойчивые галогенированные поллютанты - хлор- и фторфенолы, хлорбензоаты, хлорбифенилы. При разложении 2- и 4-хлорфенолов получены штаммы, адаптированные к высоким концентрациям токсикантов и характеризующиеся высокой скоростью их разложения.
Ряд результатов - изучение особенностей процессов биодеструкции хлорфенолов штаммом R.opacus lcp; разработка способов интенсификации процесса разложения токсикантов в биореакторе; возможность на основании полученных данных по пространственной структуре молекул методом сайт-направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью - позволяет создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистка загрязненных территорий, а также оптимизировать процессы биоремедиации и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные ксенобиотики.
Материалы диссертационной работы были использованы в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ, организуемых Пущинским Научным Центром РАН, а также в лекциях для молодых ученых на Всероссийских конференциях.
1.6. Связь работы с крупными научными программами
Результаты, представленные в данной работе, были получены в ходе выполнения исследований, проведенных в рамках тем: приоритетные направления АН СССР 0203 «Микробная деградация пестицидов», проекта 4.4.4. «Разработка экологических критериев и оценка биологической безопасности при крупномасштабном использовании в природных условиях штаммов-деструкторов» (1992 г.), проектов программы ГНТП СССР/Министерства Науки РФ «Новейшие методы биоинженерии» (основное направление «Биотехнология защиты окружающей среды») 1993-1997; темы ИБФМ РАН «Разработка безопасных для окружающей среды индустриальных технологий для ремедиации индустриальных отходов и загрязненных нефтехимикатами мест с помощью вновь выделенных или созданных микроорганизмов» (№ гос. per. 01.86.0 009 314), «Новые микроорганизмы и ферментные пути для биоремедиации загрязненных сельскохозяйственных угодий» (№ гос. per. 01.86.0 009.296), «Исследование ферментных систем детоксикации устойчивых поллютантов» (№ 2.30.1.4), «Новые микроорганизмы и ферментные пути для биоремедиации загрязненных почв сельскохозяйственных районов, Каспийского моря и впадающих в него рек» (1999-2002), «Клеточные механизмы разложения неприродных и высокоустойчивых природных соединений эукариотическими (базидиомицеты) и прокариотическими (нокардиоподобными бактериями) микроорганизмами (№гос. per. 01.86.0 009 311) (2003), «Клеточные механизмы, разложения неприродных и высокоустойчивых природных соединений базидиомицетами и коринеподобными бактериями» (2004-2006) (№ гос. Per. 0120.0403401), РФФИ № 98-04-49393-а, № 05-04-49659, РФФИ-Наукоград 04-04-97266,
РФФИ-Урал № 07-04-97625, международных проектов и грантов: NATO Linkage Grant НТ 951032, NWO РФФИ-Нидерланды № 047.007.021; INCO Copernikus ERCIC15CT960103, INCO Copernikus ICA 1999-10046, DAAD (1992-1994, 2004), DFG N436 Rus 113/59/0, РФФИ-Германия ННИО_а № 99-04-04002.
1.7. Апробация работы
Результаты данной работы были представлены для обсуждения на международном конгрессе по химии пестицидов (Гамбург, Германия, 1990; Вашингтон, США, 1994), на втором всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991), третьем международном симпозиуме по биологии и биотехнологии псевдоманад (Триест, Италия, 1991), на ежегодных конференциях немецкого микробиологического общества (Лейпциг, Германия, 1993, Ганновер, Германия, 1994, Мюнхен, Германия, 2000), на 94-й конференции американского микробиологического общества (Лас Вегас, США, 1994), на конференции «Биотехнология защиты окружающей среды» (Пущино, 1994), на международном рабочем семинаре EERO «Энзиматические и генетические аспекты биотехнологии окружающей среды» (Пущино, 1995), на международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000), на конференции «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), на конференции «Подготовка специалистов-биотехнологов для предприятий и организаций России» (Пущино, 2004), на второй европейской конференции «Оксиферменты» (Неаполь, Италия, 2004), на международных конференциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005), INCOMID-2005 (Пермь, Россия, 2005) и «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск-Раков, Беларусь, 2006). А также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН (1998-2006).
Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории энзиматической деградации органических соединений, Лаборатории регуляции биохимических процессов, Лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов и Лаборатории микробной энзимологии.
По материалам диссертации опубликовано 49 работ, из них экспериментальных -25 и три обзора.
Благодарности. Автор выражает благодарность всем сотрудникам Лаборатории энзиматической деградации органических соединений, в разное время принимавшим
непосредственное участие в проведении данной работы, их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях.
Особую признательность и благодарность выражаю научному консультанту проф. Л.А.Головлевой - инициатору этой работы - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении этой работы, проф. Хансу-Йоахиму Кнакмуссу, чья готовность к сотрудничеству положила начало многим исследованиям, проф. Михаэлю Шлеману (Горная Академия, Фрайберг, Германия) за возможность проведения биохимических и генетических работ в его лаборатории, за многолетнее плодотворное сотрудничество и ~-ценные дискуссии, доктору Штефану Кашабеку (Горная Академия, Фрайберг, Германия) за синтез диенлактонов и муконолактонов и Г.Веберу (Фрауенхофер институт, Штуттгарт, Германия) за определение ИНг-концевых последовательностей белков. Выражаю искреннюю благодарность проф. Ивонне Ритьенс и доктору Жаку Ферворту (Сельско-хозяйственный университет, Вагенинген, Нидерланды) за помощь в освоении метода фтористого ЯМР и анализе результатов; доктору Вилему Ван Беркелю (Сельскохозяйственный университет, Вагенинген, Нидерланды) за плодотворную дискуссию и предоставление монооксигеназ; проф. Андреа Скоззаффава, проф. Фабрицио Бриганти и доктору Марте Феррароне за многолетнюю совместную работу и получение результатов по структуре диоксигеназ. Особо благодарю: лаборантов Г.И.Захарову и Н.Н.Земскую - за многолетнюю помощь в работе; сотрудников лаборатории культивирования микроорганизмов - за многолетнюю помощь е проведении ферментации; Б.П.Баскунова - за проведение масс-спектрометрических анализов. Благодарю Е.Г.Плотникову (ИГИЭМ, Пермь) за предоставление штаммов родококков и совместную работу по теме. С чувством глубокой благодарности вспоминаю к.б.н. О.В.Мальцеву.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 245 страницах, содержит 54 таблицы и 67 рисунков. Список литературы включает 495 наименований, из них 473 - публикации в иностранных журналах.
2. Обзор литературы
.« Глава 1. Аэробное разложение фенолов микроорганизмами
На протяжении последних десятилетий в окружающую среду попало большое количество чужеродных соединений, различающихся между собой по структуре и устойчивости к микробной атаке. Перенос генов между бактериями потенциально может оказывать влияние на процессы, протекающие в почве, в том числе биодеградацию органических соединений [Fulthorpe, Wyndham, 1991; Derore et al., 1994; Margesin, Schinner, 1997; Davison, 1999; Dejonghe et al., 2000; Droge et al., 2000; Springael et al., 2001]. Приобретение генов катаболизма может усиливать процесс «побочной» биодеградации в результате двух процессов: первое, увеличения разнообразия микроорганизмов, способны^ осуществлять, как минимум, частичную трансформацию веществ; второе, усложнение существующих путей таким образом, что процесс деградации будет происходить или более широко (неспецифические реакции) или более полно (минерализация) [Hickey et al., 2001]. Существует мнение, что гены катаболизма адаптированно эволюционировали в природе в результате различных генетических событий, что приводило к образованию семейства различных, но обладающих высоким родством последовательностей [Furukawa, 2000]. В результате микроорганизмы обладают настолько широким биодеградативным потенциалом, что практически для каждого токсиканта можно выделить штамм, способный его полностью минерализовать. В качестве одной из групп соединений, имеющих как природное, так и абиотическое происхождение, можно назвать ароматические соединения, несущие различное количество галогеновых заместителей в структуре кольца, в том числе и хлорфенолы. Ранее считалось, что в природе чаще встречаются микроорганизмы, способные минерализовать негалогенированные субстраты, в то время как галогенированные аналоги остаются интактными. Тем не менее, накопленные литературные данные свидетельствуют о широком распространении микроорганизмов, способных полностью разлагать и галогенированные соединения. При этом сохраняется тенденция, выявленная с началом широкомасштабного изучения путей биодеструкции микроорганизмов, а именно: все многообразие ароматических соединений в результате реакций начального метаболизма сводится к ограниченному числу ключевых интермедиатов, разложение которых происходит по достаточно устоявшимся путям. В качестве примера на рисунке 1 приведенні соединения, разложение которых приводит к образованию пирокатехина,
Бензол Фенол
Рисунок 1. Пирокатехин как центральный метаболит разложения ароматических соединений [Harwood & Parales, 1996]
одного из распространенных центральных интермедиатовдеградации ароматических
соединений [Harwood & Parales, 1996; Reineke, 1998]. Вторым ключевым метаболитом,
который невозможно не упомянуть в связи с проблемами загрязения земель в
результате сельскохозяйственной деятельности человека, является
(хлор)гидроксигидрохинон (ХГГХ), метаболит 2,4-Д и 2,4,5-Т и ряда других соединений. Микроорганизмы, превращающие 2,4-Д, выделены из сельскохозяйственных, промышленных и городских почв и осадков [Bhat et al., 1994; Chaudhry and Huang, 1988; Ka et al., 1994; Koiv et al., 1996; Suwa et al., 1996]. Часть из микроорганизмов реализует гидроксигидрохиноновый путь для разложения 2,4-Д, у других, в том числе наиболее хорошо изученного штамма R. eutropha JMP134,
17 л
разложение 2,4-Д происходит с образованием 3,5-дихлорпирокатехина и его последующим расщеплением в ор/яо-положении [Leveau et al., 1998, 1999; Laemmli et al., 2000]. Большинство бактерий, способных использовать 2,4-Д в качестве ростового субстрата, содержит гомологичные tfdA гены, кодирующие а-кетоглутарат зависимую 2,4-Д диоксигеназу, под действием tfdA гена 2,4-Д превращается в 2,4-ДХФ. Эти бактерии представляют собой быстро растущие роды Р и у Proteobacteria и относятся к классу I разлагающих 2,4-Д бактерий [Kamagata et al., 1997].
Хорошо изучены также пути разложения нафталина и бифенила, приводящие к образованию замещенных пирокатехинов, более подробно о них будет упомянуто дальше. В данной же главе мы рассмотрим основные пути аэробного разложения (хлор)фенолов бактериями.
Несмотря на то, что информация о существующих путях постоянно увеличивается, выясняются новые закономерности, обнаруживаются исключения, описываются новые пути, однако есть данные, полученные в результате последовательных исследований, которые можно считать «классическими», основные из них будут отражены в данном обзоре.
Суммируя сведения, касающиеся путей разложение хлорфенолов микроорганизмами, можно выделить несколько основных закономерностей данного процесса:
~~* в анаэробных условиях разложение хлорфенолов происходит посредством восстановительного дегалогенирования, которое, однако, не всегда приводит к полному разложению исходных субстратов [Mohn & Tiedjel992; Cole et al., 1994]; -^ в аэробных условиях моно- и дигалогенированные, редко тригалогенированные фенолы превращаются в соответствующие галопирокатехины, и в этом случае дегалогенирование происходит после раскрытия ароматического кольца пирокатехинов; —4 полигалогенированные фенолы в аэробных условиях сначала подвергаются окислительному дегалогенированию с образованием (хлор)гидроксигидрохинона с последующим раскрытием ароматического кольца [Haggblom, 1992].
2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов
Хлорфенолы подвергаются разложению как грам-положительными, так и грам-отрицательными бактериями. Среди протеобактерий наиболее полно исследовано разложение полихлорфенолов штаммами Azotobacter sp. GP1 [Deng-Yu et al., 1991], Burkholdeha cepacia AC 1100 [Garrec et al., 2001], Burkholderia pickettii [Takizawa et al.,
1995], Pseudomonas cepacia [Radjendirane et al., 1991]. Штамм Arthrobacter urefaciens CPR706 осуществляет превращение шра-замещенных фенолов [Bae et al., 1996]. В литературе описан ряд штаммов, способных разлагать моно- и дихлорированные фенолы: Pseudomonas pickettii LD1 [Fava et al., 1995], Arthrobacter sp. [Kramer & Kory, 1991], Ralstonia eutropha JMP134 [Valenzuela et al., 1997]. Rhodococcus chlorophenolicus и Streptomices rochei 303 способны разлагать широкий спектр хлорфенолов, от ди- до пентахлорфенолов [Apajalahti & Salkinoja-Salonen, 1986; Golovleva et al., 1992]. S. rochei 303 утилизирует самый широкий круг изомеров хлорфенолов: 2-, 3-хлор-, 2,4-, 2,6-, 2,3-, 2,5-, 3,4-, 3,5-дихлор-, 2,4,6-, 2,4,5-, 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6- трихлор-, 2,3,5,6-тетрахлор и пентахлорфенол, хотя длительное исследование метаболического потенциала бактерий привело к заключению, что, как правило, бактерии, разлагающие моно-, ди- и, значительно реже, тригалогенированные субстраты, не способны к полной деструкции полихлорированных аналогов, а штаммы, активные по отношению к полихлорированным субстратам, не способны к деградации моно- и дихлорированных соединений. Подтверждением этому являются следующие работы: коринеформная бактерия КС-3 могла расти на 2,4,6-трихлорфеноле, но была неактивна по отношению к ди- и монохлорированным фенолам [Chu & Kirsh, 1973]; штамм Flavobacterium sp. утилизирует только пентахлорфенол, но не ди- или три-замещенные хлорфенолы [Steiert et al., 1987]; Flavobacterium sp. ATCC 39723 разлагает пентахлорфенол [Lee & Xun, 1997]. Существуют данные о том, что штаммы, не растущие на галофенолах, < проявляю.'? способность к гидроксилированию моно-, ди- и тригалофенолов в орто-положении с образованием хлорпирокатехинов [Haggblom, 1992]. Rhodococcus sp. CG-1 и Mycobacterium sp. CG-2 могли разлагать 2,4-дихлор- и 2,4,6- трихлорфенолы в условиях кометаболизма в присутствии глюкозы [Haggblom et al., 1988].
2.1.2. Подготовительные этапы разложения моно-полигалогенированных фенолов, фенолгидроксилазы
Разложение ароматических соединений, в том числе и хлорфенолов, аэробными микроорганизмами часто начинается с гидроксилирования субстрата негемовыми железо-содержащими оксигеназами [Fetzner & Lingens, 1994]. Фенол гидроксилазы (ФГ)(КФ 1.14.13.7) относятся к классу монооксигеназ, гидроксилирующих
ароматическое кольцо субстрата в орто-попожеши. Монооксигеназы катализируют включение в ароматическое кольцо одного атома кислорода, второй атом восстанавливается до воды [Hayaishi, 1969]. К настоящему времени опубликовано
большое количество статей и несколько обзоров по структуре, физико-химическим и каталитическим свойствам ФГ [Powlowski & Shingler, 1994; Xu et al., 2001; Moonen et al., 2002]* Анализ литературных данных, касающихся структуры и действия ФГ, приводит к мысли о том, что, с одной стороны, эти ферменты могут служить примером способности микроорганизмов рекрутировать ферменты одного класса, что выражается в разнообразии, как минимум, состава этих ферментов, или, с другой стороны, об универсальности микробного мира, которая позволяет имеющиеся предшественники-системы, благодаря их сложности, адаптировать к выполнению какой-либо реакции, что в конечном этапе приводит к способности живой системы в целом утилизировать данный субстрат или детоксифицировать соединение. Суммируя имеющиеся данные, отметим, что среди ФГ обнаружены как однокомпонентные ферменты, так и мультикомпонентные. Среди однокомпонентных встречаются мономеры, гомодимеры, гомотетрамеры с молекулярной массой субъединицы 57-73 кДа, они содержат в своем составе FAD, взаимодействуют с NADH или NADPH и имеют широкую субстратную специфичность. я-Хлормеркурибензоат (пХМБ) инактивирует ферменты за счет модификации цистеинового остатка субстрат-связывающего центра. Мультикомпонентные ФГ содержат редуктазу, низкомолекулярный активаторный белок и гетеромультимерный (ctfif) оксигеназный компонент [Nordlund, 1990; Schirmer & Hillen, 1998]. Наличие активаторного белка в составе мультикомпонентных монооксигеназ отличает эти ферменты от изученных на сегодняшний день мультикомпонентных диоксигеназ. При оптимальной концентрации он стимулирует гидроксилирование, а при высокой-ингибирует [Schirmer & Hillen, 1998; Qian et al., 1997]. Мономерный редуктазный компонент ФГ (39 кДа) содержит FAD и [2Fe-2S] кластер ферредоксина растительного типа и выполняет те же функции, что и редуктазный компонент диоксигеназ [Powlowski & Shingler, 1994]. Механизм действия ФГ аналогичен действию других флавин-содержащих ароматических гидроксилаз и хорошо описан в литературе [Moonen et al., 2002; Detmer, К.; Massey, 1984; Massey, 1994]. В результате действия ФГ (хлор)фенолы превращаются в (хлор)пирокатехины, которые являются одними из центральных интермедиатов разложения многообразных ароматических соединений, и далее могут подвергаться превращению по нескольким путям.
2.1.3. Основные пути разложения (хлор)пирокатехинов
Незамещенный пирокатехин может подвергаться расщеплению между двумя гидроксильными группами с последующим превращением образующегося муконата по обычному орто-пути. В случае же расщепления между С2 и СЗ атомами углерода (же/ш-расщепление) образуется муконовый полуальдегид, который также подвергается дальнейшим превращениям (Рис.2) [Harayama & Rekik, 1989].
Основным путем аэробного разложения моно- и дихлорфенолов является модифицированный opmo-путъ, представленный 3-хлор- или 4-хлорпирокатехиновыми ветвями, в зависимости от того, какой хлорпирокатехин образуется в качестве ключевого интермедиата.
Хлорзамещенные пирокатехины, как правило, не разлагаются по мета-пути, т.к. пирокатехин 2,3-диоксигеназа инактивируется 3-хлорпирокатехином [Klecka, Gibson, 1981; Barrels et al., 1984], а ме/ш-расщепление 4-хлорпирокатехина является непродуктивным в связи с накоплением в культуральной среде, как предполагается, токсичного для клеток 5-хлор-2-гидроксимуконового полуальдегида [Reineke & Knackmuss, 1980; Wieser et al, 1994]. Однако, не так давно у штамма Pseudomonas putida GJ31 описана пирокатехин 2,3-диоксигеназа, расщепляющая как 3-метилпирокатехин, так и 3-хлорпирокатехин в положении 2,3- и, таким образом, инициирующая разложение этих субстратов по мета-пути [Kaschabek et al., 1998; Mars et al., 1997, 1999]. Штамм Comamonas testosteroni JH5 способен утилизировать смесь 4-хлорфенола и монометилфенолов [Hollender et al., 1994], разложение 4-ХФ данным штаммом проходит по мета-пути с 4-ХПК в качестве ключевого интермедиата [Hollender et al., 1997]. Опыты, проведенные для выяснения широты распространения генов, кодирующих хлорпирокатехин 2,3-диоксигеназы, у бактерий из почвенных колонок, где главным токсикантом являлся хлорбензол, показали наличие у них генов, показавших высокую степень сходства (97,8 и 99%) с хлорпирокатехин 2,3-диоксигешзой из P.putida GJ31 [Alfreider et al., 2003].
Описаны следующие пути расщепления пирокатехинов. 2.1.3.1. ліеиіа-Расщепление пирокатехинов
Микробное разложение таких ароматических соединений, как нафталин, дибензофуран, дибензо-п-диоксин, бензол, фенол, анилин, бифенил, толуол, салицилат происходит с образованием пирокатехина в качестве центрального интермедиата, который далее подвергается расщеплению кольца в jwewa-положении [Reineke, 1998](Рис 2).
дегидрогеназа
2-гидроксимуконового
полуальдегида ^>
r^V0H
I || пирокатехин
, Г~02 пирокатехин
и 2,3-диоксигеназа
(Г COO 2-гидроксимуконовый
полуальдегид
ОН
СОО"
00"
/
4-оксалокротонат
(енол)
4-оксалокротонат таутомераза
/СОСГ
(Xу
4-оксалокротонатч/^^ї"ОН (кето)
4-оксалокротонат J"^ декарбоксилаза qq
гидролаза 2-гидроксимуконового полуальдегида
нсоон
Н2С соо
2-оксопент-4-еноат
2-оксопент-4-еноат гидратаза
Н3С СОО"
4-гидрокси-2-оксовалериат
4-гидрокси-2-оксовалериат альдолаза
пируват + ацетальдегид Рисунок 2. место-Путь разложения пирокатехина [Smith, 1990].
Катализирует эту реакцию метапирокатехаза или пирокатехин 2,3-диоксигеназа (КФ 1.13.1.2). Этот фермент выделен из ряда псевдомонад [Nozaki et al., 1968; 1970; Nakai et al., 1983a; Kukor & Olsen, 1996]; клонированы кодирующие его гены [Nakai et al., 1983b;"Bartilson & Shingler, 1989; Duffner & Mflller, 1998; Kobayashi et al., 1995].
Метапирокатехаза получена в кристаллическом виде и изучены ее каталитические свойства [Nozaki et al., 1963; Kita et al., 1997]. Помимо пирокатехина фермент активен с 4-метилпирокатехином и протокатеховой кислотой, расщепление которых приводит к
образованию, соответственно, а-гидрокси-8-метилмуконового-є-полуальдегида и а-гидроксимуконового-Е-полуальдегида [Nozaki et al., 1970]. Фермент из P.putida mt-2 состоит из четырех идентичных субъединиц массой 32 кДа, каждая содержит атом Fe(II). Методами оптической абсорбции, кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма было показано, что в нативном ферменте Fe(II) является пятикоординированным [Mabrouk et al., 1991], однако дальнейшие исследования с помощью абсорбционной рентгеноспектроскопии показали, что железо является шестикоординированным и эта геометрия остается практически неизменной во всех изученных комплексах фермента с субстратом, субстратным аналогом и ингибитором [Bertini et al., 1994].
В целом, путь .мета-расщепления пирокатехина изучен более полно с генетических позиций, в составе оперонов для разложения бифенилов, толуола, ксилола, крезола и т.д. [Harayama et al., 1987; Keil et al., 1985; Kukor & Olsen, 1991; Moon et al., 1995; Saint et al., 1990; Parales et al., 2000; Sentchilo et al., 2000].
2.1.3.2. ор/яо-Расщепление (хлор)пирокатехинов
Классический орто-щтъ разложения пирокатехина, изображённый на рисунке
ЗА, обнаружен у многих микроорганизмов. Основными этапами этого пути являются:
расщепление кольца пирокатехина пирокатехин 1,2-диоксигеназой (ПК 1,2-ДО) (КФ
1.13.11.1), циклоизомеризация образующейся муконовой кислоты
муконатциклоизомеразой (МЦИ) (КФ 5.5.1.1); превращение муконолактона в еноллактон муконолактонизомеразой (МЛИ) (КФ 5.3.3.4) и образование из него Р-кето-адипата еноллактонгидролазой (ЕЛГ) (КФ 3.1.1.24). р-Кетоадипат является общим интермедиатом обычного и модифицированного орто-путей, а образующиеся из него интермедиа вступают в цикл трикарбоновых кислот. Таким образом, в результате происходит полное разложение исходного вещества.
Модифицированный орто-путь, точнее, его 3-хлорпирокатехиновая ветвь, описан для Pseudomonas sp. ВІЗ и Pseudomonas putida [для обзора см. Schlomann, 1994], разлагающих 3-хлорбензоат. Основные этапы и ферменты показаны на рисунке ЗБ. На первом этапе образуется 3-хлорпирокатехин (3-ХПК), который в результате расщепления хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназой (ХПК 1,2-ДО) превращается в 2-хлормуконат (2-ХМ). Циклоизомеризация 2-ХМ хлормуконатциклоизомеразой (ХМЦИ) приводит к образованию /иракс-диенлактона. Далее под действием
,он
пирокатехин
ПК1.2-ДО
Б он
3-хлорпирокатехин ХПК1.2-Д0
/COO' / COO"
Ск .СОО"
\^ соо-
муконат МЦИ
.COO'
муконолактон МЛИ
/
соо-
.0.
=0
еноллактон ЕЛГ
2-хлормуконат
хмци
СІ,
о.
-оос v=
5-хлормуконолактон
ХМЦИ
О.
'ООС
транс-диенлактон
длг
/ СОО'
/
СОО"
СОО'
^
малеилацетат
3-оксоадипат
\ \
Рисунок 3. Обычный орто-путь разложения пирокатехина (А) и модифицированный орто-путь разложения хлорпирокатехинов (Б).
диенлактонгидролазы (ДЛГ) трянс-диенлактон превращается в малеилацетат, который восстанавливается до р-кетоадипата малеилацетат редуктазой (MAP).
С первого взгляда на оба представленных на рисунке 3 пути видно, что в них функционируют пары ферментов (ПК 1,2-ДО-МЦИ и ХПК 1,2-ДО-ХМЦИ), катализирующие сходные реакции раскрытия ароматического кольца и его лактонизации. Вместе с тем, в оба пути входят ферменты, субстратная специфичность которых прлностью исключает их взаимозаменяемость (МЛИ-ЕЛГ и ДЛГ).
Ферменты этой ветви модифицированного орто-пут грам-отрицательных бактерий изучаются на протяжении нескольких десятилетий и к настоящему времени накоплен большой материал относительно физико-химических, каталитических свойств и субстратной специфичности этих ферментов. ХПК 1,2-ДО выделены в гомогенном виде из ряда грам-отрицательных бактерий, они представляют собой гомодимеры с молекулярной массой 57.5-64.0 кДа (ct2Fe или o^FeMn) с Fe в активном центре. Они обладают более широкой субстратной специфичностью по сравнению с ПК 1,2-ДО и проявляют наибольшую активность с метилзамещенными пирокатехинами. Отмечено, что скорость превращения хлорзамещенных пирокатехинов, образующихся из ростового субстрата, превышает скорость превращения других хлорпирокатехинов [van der Meer et al., 1991a; Kuhm et al., 1990].
ХМЦИ 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пут также изучены у ряда грам-отрицательных бактерий. ХМЦИ имеют молекулярную массу субъединицы порядка 40-42 кДа и являются гомооктамерами [Kuhm et al., 1990; Hammer et al., 1993; Helin et al., 1995]. ХМЦИ отличаются по субстратной специфичности и по эффективности катализа оптимальных субстратов как друг от друга, так и от муконатциклоизомераз (МЦИ) обычного орто-пут [Vollmer et al., 1999]. МЦИ обладают довольно узкой субстратной специфичностью, успешно трансформируя муконат и метилмуконаты и значительно хуже 3-хлор- и 2,4-дихлормуконаты [Vollmer et al., 1998].
Изначально предполагалось, что ХМЦИ осуществляют прежде всего циклоизомеризацию хлормуконатов с образованием хлормуконолактонов, а дегалогенирование последних с образованием транс- или г/иодиенлактона проходит как сопутствующий процесс [Schmidt & Knackmuss, 1980]. Однако, было показано, что ХМЦИ трансформируют 2-хлормуконат в смесь 2-хлормуконолактона (2-ХМЛ) и 5-
хлормуконолактона (5-ХМЛ), с предпочтительным образованием 5-ХМЛ, а на втором этапе катализируют дехлорирование 5-ХМЛ с образованием транс-днетактона [Vollmer et al., 1998; Vollmer & Schlomann, 1995] (Рис. 4). МЦИ из грам-отрицательных бактерий не способны осуществлять дехлорирования 5-ХМЛ, так что образования /яранс-диенлактона не происходит [Vollmer et al., 1994].
н ,N
2-хлормуконат
"ООС ^
2-хлормуконолактон Рисунок 4. Реакции трансформации 2-хлормуконата.
- Муконатциклоизомераза из грам-отрицательных бактерий.
- Хлормуконатциклоизомераза из P. putida рАС27 и R. eutropha pJP4.
ДЛГ, третий фермент модифицированного opmo-nym, катализирует превращение ятра//с-диенлактона (г/ис-изоформы в случае разложения 4-хлор- и 2,4-дихлорпирокатехина) в малеилацетат. ДЛГ вьщелены и охарактеризованы из нескольким источников [Schlomann, 1994]. ДЛГ представляют собой мономеры с Мг от 22 до 30 кДа. Они обладают различной субстратной специфичностью, имеют рН оптимумы в районе 7,6, ингибируются и-ХМБ в связи с наличием двух цистеиновых остатков в своем составе, и не ингибируются ЭДТА. Шлеманн предложил классификацию ДЛГ по субстратной специфичности, в соответствии с которой ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви из грам-отрицательных бактерий были отнесены к третьему типу [Schlomann, 1994]. Получены кристаллы ДЛГ из Pseudomonas sp. ВІЗ и изучен механизм катализа этого фермента [Pathak & Ollis, 1990; Cheah et al., 1993; Beveridge & Ollis, 1995].
Четвертым ферментом, общим для всех ветвей модифицированного ор/ио-пути, а также гидроксигидрохинонового пути, является МАР. У грибов MAP участвует в катаболизме таких соединений, как тирозин, гентизат, бензоат, 4-оксибензоат, протокатехоат, ваниллат, резорцин и фенол [Карасевич и Ивойлов, 1977; Buswell & Eriksson, 1979; Gaal & Neujahr, 1979; Sparnins et al., 1979; Anderson & Dagley, 1980;
Jones et al., 1995]. У бактерий MAP участвуют в разложении резорцина и 2,4-диоксибензоата через гидроксигидрохинон [Larway & Evans, 1965; Chapman & Ribbons, 1976; Stoiz & Knackmuss, 1993]. MAP участвует в превращении и более сложных соединений, таких как 2-гидроксидибензо-и-диоксин и 3-гидроксидибензофуран [Armengaud et al., 1999], или несущих необычные заместители, например, нитро- или сульфо-группы [Spain & Gibson, 1991; Feigel & Knackmuss, 1993; Jain et al., 1994; Rani & Lalithakumari, 1994], фтор- или хлор-атомы [Duxbury et al., 1970; Schlomann et al., 1990a; Latus et al., 1995; Zaborina et al., 1995; Daubaras et al., 1996; Miyauchi et al., 1999]. При восстановлении малеилацетатов, не имеющих галогенного заместителя во втором положении, потребляется только один моль NADH и не происходит дегалогенирования субстрата, в то время как для дегалогенирования и восстановления 2-замещенньгх малеилацетатов до 3-оксоадипата требуется два моля NADH [Seibert et al., 1993; Kaschabek & Reineke, 1995; Miiller et al., 1996]. Несмотря на то, что малеилацетат редуктазы" были выделены из микроорганизмов, использующих в качестве субстратов различные хлорароматические соединения [Seibert et al., 1993; Miiller et al., 1996; Травкин с соавт., 1999; Kaschabek & Reineke, 1993], ферменты обладают удивительным сходством. Они представляют собой гомодимеры с молекулярной массой 72-80 кДа, предпочитают NADH, хотя толерантны и к NADPH, восстанавливают широкий спектр замещенных малеилацетатов. Различия касаются только значений pi и рН оптимумов [Kaschabek & Reineke, 1993,1995; Miiller et al., 1996].
Долгое время оставался невыясненным вопрос о локализации генов, кодирующих MAP. Эту путаницу изначально определила ошибочная идентификация гена tfdF из R.eutropha JMP134 (pJP4) как кодирующего хлордиенлактон изомеразу [Don et al., 1985]. Однако, последующие исследования оперонов у pJP4, Pseudomonas putida рАС27, Pseudomonas sp. ВІЗ, Pseudomonas sp. pP51 путем их секвенирования, сравнения NH2-KOH4eBbix аминокислотных последовательностей белков с последовательностями, выведенными из нуклеотидного сиквенса, и экспрессией клонированных генов дали неопровержимые доказательства того, что эти опероны содержат ген, кодирующий МАР, в дополнение к генам, кодирующим остальные ферменты модифицированных орто-путея [Frantz & Chakrabarty, 1987; Perkin et al., 1990; Laemmli et al., 2000; van der Meer et al., 1991; Schell et al., 1994; Kasberg et al., 1995, 1997; Seibert et al., 1993; Plumier et al., 2002]. Гены, кодирующие MAP, входят также в состав оперонов для разложения 3-оксибензофурана и 2-оксидибензо-п-диоксина через гидрохинон [Armengaud et al., 1999], 2,4,5-Т [Daubaras et al., 1995,1996;
.4
Zaborina et al., 1998], пентахлорфенола [Cai & Xun, 2002]. В состав кластера генов разложения динитротолуола у Burkholderia cepacia R34 также входит ген, кодирующий MAP, который не играет какой-либо роли в разложении данного соединения [Johnson et al., 2002]. Последние исследования группы, возглавляемой проф. Шлеманном, показали, что штамм Ralstonia eutropha 335т (DSM 531Т), использующий 4-фторбензоат в качестве единственного источника углерода и энергии, содержит ген, mac А, кодирующий MAP, который является частью кластера генов, отличного от известных кластеров генов, кодирующих MAP, и включающий ген тасВ, кодирующий гипотетический мембранный транспортер, и macR, кодирующий регуляторный белок [Seibert et al., 2004].
Особенностями ферментов 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-иути является следующее:
ХПК 1,2-ДО характеризуется высокой константой специфичности с субстратами, имеющими заместители в мета-положешк.
ХМЦИ способна не только катализировать реакцию циклоизомеризации 2-хлормуконата, но также осуществляет дегалогенирование 5-ХМЛ;
В ходе реакции дегалогенирования 5-ХМЛ образуется /я/?д//с-диенлактон;
ДЛГ активна с трапс-п с ^і/с-изомерами диенлактона, хотя сродство фермента к транс-диенлактону выше, чем к ^wc-изомеру.
Разложение хлорароматических соединений по 4-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пут происходит в том случае, когда окисление ростового субстрата приводит к образованию 4-хлорпирокатехина (4-ХПК). 4-ХПК является интермедиатом при разложении или трансформации 3-й 4-хлорфенолов родококками [Janke et al., 1988a,b]. Расщепление ароматического кольца 4-ХПК ХПК 1,2-ДО приводит к образованию 3-хлормуконата. В результате циклоизомеризации ХМЦИ образуется г/мс-диенлактон, который служит субстратом для ДЛГ и приводит к образованию малеилацетата - общего интермедиата 3- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей. Функционирование этого пути у бактерий было установлено на основании идентификации интермедиатов, образующихся при катализе ферментами 3-хлорпирокатехиновой ветви интермедиатов 4-хлорпирокатехинового пути, и определения активности ферментов, индуцирующихся при росте R. eutropha JMP134 на 2,4-Д.
ХМЦИ 4-хлорпирокатехиновой ветви отличаются способностью эффективно превращать широкий спектр муконатов, отдавая предпочтение 2,4-дихлор- и 3-
хлормуконатам [Kuhm et al., 1990; Vollmer et al., 1999]. 3-Хлор-цис,цис-мукопат превращается ХМЦИ в tywc-диенлактон с освобождением иона хлора [Schmidt & Knackmuss, 1980], в то время как МЦИ трансформирует этот субстрат в антибиотик протоанемонин, также осуществляя при этом дехлорирование [Blasco et al., 1995]. Недавние исследования механизма дехлорирования 3-хлормуконата этими циклоизомеразами показали, что в процессе образования протоанемонина важную роль играет Lysl69 МЦИ, замена которого на аланин приводит к образованию цис-диенлактона [Kaulmann et al., 2001].
2.1.4. Гидроксигидрохиноновый путь расщепления
Гидроксигидрохинон (ГГХ) можно рассматривать как аналог пирокатехина, который несет дополнительную гидроксильную группу в пара-иояожеиші. Он является одним из центральных интермедиатов при разложении широкого ряда ароматических соединений грибами, дрожжами и бактериями. Как и у пирокатехина, ароматическое кольцо ГГХ может быть открыто двумя путями - через интрадиольное, либо через экстрадиольное расщепление [Chapmann & Ribbons, 1976], но поскольку работа Чапмана и Риббонс [Chapmann & Ribbons, 1976] остается единственной, в которой описано экстрадиольное расщепление ГГХ, мы останавимся только на пути интрадиольного расщепления ГГХ. Первые работы по образованию и последующему
.4
разложению ГГХ через интрадиольное расщепление клетками Pseudomonas, растущими на резорциноле, появились в 1965 г. [Larway & Evans, 1965]. Интермедиатами этого пути были малеилуксусная и 3-кетоадипиновая кислоты. Эти же ключевые метаболиты образуются в процессе opwo-расщепления пирокатехина, но, в отличие от пирокатехинового пути, в гидроксигидрохиноновом пути отсутствуют муконатциклоизомераза и диенлактонгидролаза.
Образование ГГХ обнаружено при расщеплении бациллами кольца ароматических эфиров [Crafford, 1978], при разложения и-гидроксибензойной кислоты Candida tropicalis [Карасевич и Ивойлов, 1977] и Candida parapsilosis [Middelhoven et al., 1992; van Berkel et al., 1994], представителями Debaryomyces [Ивойлов, 1979]. ГГХ являлся интермедкатом при разложении ванилата, бензоата, протокатехоата, фенола, резорцина, хинона и пирокатехина клетками и бесклеточным экстрактом Trichosporon cutaneum [Neujahr & Varga, 1970; Gaal & Neujahr, 1979; Andersen & Dagley, 1980; Sze & Dagley, 1984] и ванилата, 2,4-дихлорфенола, 2,4-динитротолуола, 2,7-дихлор-дибензо-/?-диоксина Phanerochaete chrysosporium [Rieble et al., 1994; Valli & Gold, 1991; Valli et al.,
1992]. ГГХ определен в качестве интермедиата при разложении 4-аминофенола штаммом" Burkholderia sp АК-5 [Takenaka et al., 2003], дибензо-р-диоксина и дибензофурана штаммом Sphingomonas sp. RW1 [Armengaud et al., 1999]. И, конечно же, существует огромное количество работ, связанных с разложением хлорированных фенолов с образованием (хлор)гидроксигидрохинонов (ХГГХ) в качестве интермедиатов. Такой интерес к путям разложения галогенированных фенолов неслучаен, так как многие из этих соединений получили широкое распространение в качестве биоцидов и консервантов. Ранее нами были перечислены штаммы, разлагающие (хлор)фенолы (см. раздел 2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов), добавим только, что среди штаммов, разлагающих полихлорфенолы с образованием ГГХ, также известны Rahtonia (Pseudomonas) pickettii DTP0609, утилизирующая 2,4,6-трихлорфенол [Kiyohara et al., 1992] и хорошо известная R. eutropha JMP 134 (pJP4), использующая в качестве ростового субстрата 2,4,5-трихлорфенол [Clement et al., 1995] (напомним, что 2,4-Д разлагается R. eutropha JMP 134 с образованием 3,5-дихлорпирокатехина).
Гидроксигидрохиноновый путь также описан для деградации феноксиалкановых кислот бактериями Burkholderia cepacia АСІ 100 [Chapmann et al., 1987] и N. simplex 3E [Козырева с соавт., 1992; Козырева и Головлева,1993; Козырева с соавт., 1993]. Разложение таких соединений начинается с превращения 2,4,5-Т или 2,4-Д в соответствующие хлорфенолы.
Оксигеназа (TftAB), ответственная за превращение 2,4,5-Т в 2,4,5-ТХФ и изученная у штамма Burkholderia cepacia АСІ 100 [Kilbane et al., 1982], является
,4
двухкомпбнентной, требует для активности как NADH, так и Ог [Xun & Wagnon, 1995]. Оптимальная активность фермента отмечалась в присутствии FAD и Fe2+. В процессе очистки 2,4,5-Т оксигеназы из клеточного экстракта выделялись две фракции (компонент А и компонент В), которые раздельно были неактивными, но после их смешивания активность восстанавливалась. Молекулярная масса компонента В равна 140 кДа, он состоит из двух 49-kDa а-субъединиц и двух 24-kDa |3-субъединиц. Реакция превращения 2,4-Д в 2,4-ДХФ в присутствии NADH и Ог этим ферментом очень похожа на реакцию превращения 2,4-Д в 2,4-ДХФ штаммом Ralstonia eutropha JMP 134 [Fukumori & Hausinger, 1993]. Но 2,4-Д а-кетоглутарат зависимая диоксигеназа из R. eutropha JMP 134 окисляет 2,4-Д примерно в 1000 раз быстрее, чем 2,4,5-Т-оксигеназа утилизирует 2,4,5-Т. Такая низкая скорость превращения 2,4,5-Т позволяет избегать
накопления очень токсичного 2,4,5-ТХФ в реакционной смеси и использовать его по мере появления.
На первом этапе аэробного разложения хлорфенолов с тремя-четырьмя заместителями, как правило, происходит гидроксилирование в пора-положении с образованием (хлор)гидрохинона, второе гидроксилирование приводит к образованию (хлор)гидроксигидрохинона ((Х)ГГХ. Данные этапы характерны для штаммов R. chlorophenolicus РСР-1, Rhodococcus sp. СР-2, М. fortuitum CG-2, Flavobacterium sp., разлагающих пентахлорфенолы [Haggblom, 1992; Daubaras et al., 1996; Uotila et al., 1992; Xun et al., 1992], Azotobacter sp. и Pseudomonas pickeltii DTP0602, разлагающих 2,4,6-трихлорфенол [Takizawa et al., 1995; Lee & Xun, 1997; Li et al., 1991; Wieser et al., 1997], S. rhochei 303 [Golovleva et al., 1992], Burkholderia cepacia AC1100 [Kiyohara et al., 1992] (Рис. 5). При этом В. cepacia АСІ 100 реализует путь деградации галофенолов через гидроксилирование в иоря-положении в случае, если там имеется заместитель [Tomasi et al., 1995].
,4 ОСН2СООН
CI fflABCD
ОН ОН
.ОН
"%
tftG
СІ 2,4,5-Т
5-хлоргидрокси-гидрохинон
ХГГХ1,2-ДО?\
\
/
СОО' СОО"
ОН гидроксигидрохинон
ГГХ1.2-ДО
малеилацетат
СОО"
СОО'
3-оксоадипат
т цтк
Рисунок 5. Возможные пути разложения 2,4,5-Т через гидроксигидрохинон.
.і
Как и 2,4,5-Т оксигеназа, хлорфенол 4-монооксигеназа первоначально была охарактеризована как двухкомпонентный фермент, поскольку в процессе очистки она разделялась на два компонента (компонент сА и компонент сВ) [Xun, 1996]. Поодиночке ни один из компонентов не разлагал 2,4,5-ТХФ, но их комбинирование востанавливало ферментативную активность. Было установлено, что нативный сА является мономером с молекулярным весом 22,000, а сВ является мономером в 58,000. Компонент сА использовал в качестве простетической группы FAD. Этот фермент также хорошо окислял ТеХФ до ТеХХ и 2,4-ТХФ до 2,5-ДХХ. Гены, кодирующие ферменты пути деградации 2,4,5-Т у АС1100, были клонированы и секвенированы [Zaborina et al., 1998]. Белок TftCD, катализирующий окисление 2,4,5-ТХФ до 2,5-дихлорхинона, был охарактеризован как двухкомпонентная флавинсодержащая монооксигеназа. Однако, последующее раздельное клонирование генов tftC и tftD, трансформация в E.coli для суперэкспрессии, выделение и характеристика продуктов показали, что TftD является отдельным ферментом, относящимся к группе РАОНг-утилизирующих монооксигеназ, а TftC является NADH-.FAD оксидоредуктазой [Gisit and Xun, 2003].
TftC относится к классу I NADH:FAD оксидоредуктаз, не имеющих связанного флавина в качестве простетической группы, однако по каталитическим свойствам он
отличается от флавинредуктаз из этой подгруппы. Так, аналогичный фермент,
*.
компонент 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы НраС из E.coli W, восстанавливает FMN быстрее, чем FAD, тогда как TftC предпочитает FAD, а не FMN [Galan et al., 2000]. Флавинредуктаза Fre из E.coli [Frieschi et al., 1995] востанавливает рибофлавин, FMN и FAD как с помощью NADH, так и NADPH. NADH:FAD оксидоредуктаза из Streptomyces viridifaciens восстанавливает как FAD, так и FMN с NADPH и NADH, с наивысшей скоростью, отмеченной для FAD [Parry & Li, 1997]. Несколько флавинредуктаз, выделенных из штаммов Vibrio, предпочитают FMN [Lei et al., 1994; Zennoetal., 1994].
TftD представляет собой мономер с молекулярной массой 57451 Да. Этот фермент очень сходен с другими РАОНг-утилизирующими монооксигеназами. Так, монооксигеназа 2,4,6-трихлорфенола из Ralstonia eutropha JMP 134 (ТсрА) является мономером с массой 60 кДа [Louie et al., 2002]. НраВ из E.coli W - гомодимер с субъединицами 59 кДа [Prieto & Garcia, 1994]. В то же время TftD отличается по субстратной специфичности от ТсрА из R. eutropha JMP 134. TftD разлагает 2,5-ДХХ, продукт окисления 2,4,6-ТХФ, в отличие от ТсрА из R. eutropha JMP 134, которая катализирует эту реакцию с образованием 6-ХГГХ [Xun & Webster, 2004]. Конечным
продуктом окисления 2,4,5-ТХФ TftD является 5-ХГГХ. Превращение 2,4,5-ТХФ в 2,5-ДХХ через образование хинона является первой стадией дехлорирования, вторая стадия - превращение 2,5-ДХХ в 5-ХГГХ. В отличие от описанной выше FADH2-утилизирующей монооксигеназы TftD, 2,6-ДХХ-хлоргидролаза из Flavobacterium sp. АТСС 39723 не требует ни FAD, ни NADH. И 2,6-ДХХ-хлоргидролаза, и TftD из В. cepacia АС 1100 катализируют превращение хлоргидрохинона, но, скорее всего, они относятся к различным типам ферментов.
Мы рассмотрели основные из описанных в литературе ферментов, в результате последовательного действия которых образуется хлоргидроксигидрохинон -центральный интермедиат рассматриваемых в этом разделе путей. Ключевым ферментом раскрытия ароматического кольца (Х)ГГХ в данном пути является (хлор)гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназа (ХГГХ 1,2-ДО), расщепляющая (Х)ГГХ с образованием (хлор)малеилацетата, общего интермедиата путей о/ляорасщепления ХПК и (Х)ГГХ. (Х)ГГХ 1,2-ДО были выделены и охарактеризованы из нескольких микроорганизмов. Это грам-отрицательные бактерии Burkholderia cepacia АСІ 100 [Daubaras et al., 1996-a], Azotobacter sp. GP1 [Latus et al.,1995], Ralstonia pikettii DT0602 [Hatta et al., 1999], Burkholderia sp. AK-5 [Takenaka, et al., 2003], грам-положительные бактерии (Streptomyces rochei 303 [Zaborina et al., 1995], Nocardioides simplex 3E [Соляникова с соавт., 1996], Arthrobacter sp. strain BA-5-17 [Murakami et al., 1999] и грибы {Trichosporon cutaneum [Sze, Dagley, 1984], Phanerochaete chrysosporiwn [Rieble et al., 1994]).^
В экспериментах по разложению резорцина штаммом Pseudomonas putida [Chapman & Ribbons, 1976a] были обнаружены различия между диоксигеназами, катализирующими интрадиольное расщепление кольца пирокатехина и гидроксигидрохинона. Белок не был выделен и охарактеризован, но поскольку один и тот же бесклеточный экстракт P. putida воздействовал на пирокатехин слабее, чем на быстро окисляемый гидроксигидрохинон, было сделано предположение, что белок отличается от пирокатехин 1,2-диоксигеназы.
Показано наличие гомологии (Х)ГГХ 1,2-ДО на аминокислотном уровне, сходство в субъединичном составе и массе. Однако ферменты из разных микроорганизмов различаются по субстратной специфичности. Так, из биомассы штамма М simplex ЗЕ, выращенной на 2,4-Д, выделена и охарактеризована ГГХ 1,2-ДО [Соляникова с соавт., 1996], проявляющая активность с ГГХ, однако после ионообменной хроматографии был обнаружен второй пик, проявляющий активность с
6-ХГГХ на том же уровне, что и с незамещенным ГГХ, что позволило сделать вывод о возможной индукции двух ферментов, адаптированных к разложению хлорированного и нехлорированного субстратов.
Молекулярная масса нативной ГГХ 1,2-ДО из Azotobacter sp GP1 равна 58 кДа, субъединицы - 34,25 кДа, т.е. фермент является гомодимером [Latus et al., 1995].
6-ХГГХ 1,2-ДО из S. rochei 303 представляет собой гомодимер, масса нативного фермента 61 кДа, субъединицы - 31 kDa. Фермент характеризуется очень узкой субстратной специфичностью: являются субстратами только ГГХ и 6-ХГГХ, нет активности с гидрохиноном, 2,6-дихлоргидрохиноном, 2,3,6-трихлоргидрохиноном, пирокатехином, 3-ХПК, 4-ХПК, пирогаллолом, 3,5,6-трихлоргидроксигидрохиноном.
Таким образом, в данной главе представлены основные пути аэробного разложения (хлор)фенолов у бактерий различных таксономических групп и центральные пути превращения образующихся при этом (хлор)пирокатехинов и (хлор)гидроксигидрохинонов. Среди центральных метаболитов, образующихся в ходе реакций подготовительного метаболизма других ароматических соединений, следует также отметить протокатеховую (ПКК), гентизиновую и гомогентизиновую кислоты. Путь деградации ПКК, а также описание оперонов разложения ароматических соединений и их распространение среди микроорганизмов будут даны в следующей главе.
Штаммы-деструкторы хлорфенолов
Разложение ароматических соединений, в том числе и хлорфенолов, аэробными микроорганизмами часто начинается с гидроксилирования субстрата негемовыми железо-содержащими оксигеназами [Fetzner & Lingens, 1994]. Фенол гидроксилазы (ФГ)(КФ 1.14.13.7) относятся к классу монооксигеназ, гидроксилирующих ароматическое кольцо субстрата в орто-попожеши. Монооксигеназы катализируют включение в ароматическое кольцо одного атома кислорода, второй атом восстанавливается до воды [Hayaishi, 1969]. К настоящему времени опубликовано
большое количество статей и несколько обзоров по структуре, физико-химическим и каталитическим свойствам ФГ [Powlowski & Shingler, 1994; Xu et al., 2001; Moonen et al., 2002] Анализ литературных данных, касающихся структуры и действия ФГ, приводит к мысли о том, что, с одной стороны, эти ферменты могут служить примером способности микроорганизмов рекрутировать ферменты одного класса, что выражается в разнообразии, как минимум, состава этих ферментов, или, с другой стороны, об универсальности микробного мира, которая позволяет имеющиеся предшественники-системы, благодаря их сложности, адаптировать к выполнению какой-либо реакции, что в конечном этапе приводит к способности живой системы в целом утилизировать данный субстрат или детоксифицировать соединение. Суммируя имеющиеся данные, отметим, что среди ФГ обнаружены как однокомпонентные ферменты, так и мультикомпонентные. Среди однокомпонентных встречаются мономеры, гомодимеры, гомотетрамеры с молекулярной массой субъединицы 57-73 кДа, они содержат в своем составе FAD, взаимодействуют с NADH или NADPH и имеют широкую субстратную специфичность. я-Хлормеркурибензоат (пХМБ) инактивирует ферменты за счет модификации цистеинового остатка субстрат-связывающего центра. Мультикомпонентные ФГ содержат редуктазу, низкомолекулярный активаторный белок и гетеромультимерный (ctfif) оксигеназный компонент [Nordlund, 1990; Schirmer & Hillen, 1998]. Наличие активаторного белка в составе мультикомпонентных монооксигеназ отличает эти ферменты от изученных на сегодняшний день мультикомпонентных диоксигеназ. При оптимальной концентрации он стимулирует гидроксилирование, а при высокой-ингибирует [Schirmer & Hillen, 1998; Qian et al., 1997]. Мономерный редуктазный компонент ФГ (39 кДа) содержит FAD и [2Fe-2S] кластер ферредоксина растительного типа и выполняет те же функции, что и редуктазный компонент диоксигеназ [Powlowski & Shingler, 1994]. Механизм действия ФГ аналогичен действию других флавин-содержащих ароматических гидроксилаз и хорошо описан в литературе [Moonen et al., 2002; Detmer, К.; Massey, 1984; Massey, 1994]. В результате действия ФГ (хлор)фенолы превращаются в (хлор)пирокатехины, которые являются одними из центральных интермедиатов разложения многообразных ароматических соединений, и далее могут подвергаться превращению по нескольким путям.
Незамещенный пирокатехин может подвергаться расщеплению между двумя гидроксильными группами с последующим превращением образующегося муконата по обычному орто-пути. В случае же расщепления между С2 и СЗ атомами углерода (же/ш-расщепление) образуется муконовый полуальдегид, который также подвергается дальнейшим превращениям (Рис.2) [Harayama & Rekik, 1989].
Основным путем аэробного разложения моно- и дихлорфенолов является модифицированный opmo-путъ, представленный 3-хлор- или 4-хлорпирокатехиновыми ветвями, в зависимости от того, какой хлорпирокатехин образуется в качестве ключевого интермедиата.
Хлорзамещенные пирокатехины, как правило, не разлагаются по мета-пути, т.к. пирокатехин 2,3-диоксигеназа инактивируется 3-хлорпирокатехином [Klecka, Gibson, 1981; Barrels et al., 1984], а ме/ш-расщепление 4-хлорпирокатехина является непродуктивным в связи с накоплением в культуральной среде, как предполагается, токсичного для клеток 5-хлор-2-гидроксимуконового полуальдегида [Reineke & Knackmuss, 1980; Wieser et al, 1994]. Однако, не так давно у штамма Pseudomonas putida GJ31 описана пирокатехин 2,3-диоксигеназа, расщепляющая как 3-метилпирокатехин, так и 3-хлорпирокатехин в положении 2,3- и, таким образом, инициирующая разложение этих субстратов по мета-пути [Kaschabek et al., 1998; Mars et al., 1997, 1999]. Штамм Comamonas testosteroni JH5 способен утилизировать смесь 4-хлорфенола и монометилфенолов [Hollender et al., 1994], разложение 4-ХФ данным штаммом проходит по мета-пути с 4-ХПК в качестве ключевого интермедиата [Hollender et al., 1997]. Опыты, проведенные для выяснения широты распространения генов, кодирующих хлорпирокатехин 2,3-диоксигеназы, у бактерий из почвенных колонок, где главным токсикантом являлся хлорбензол, показали наличие у них генов, показавших высокую степень сходства (97,8 и 99%) с хлорпирокатехин 2,3-диоксигешзой из P.putida GJ31 [Alfreider et al., 2003].
Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у R. opacus lcp
Rhodococcus opacus lcp, способный использовать бензоат, 4-хлорфенол (4ХФ), 2,4-дихлорфенол, бьш выделен из накопительной культуры, поддерживаемой в течение нескольких месяцев с 2,4-ДХФ [Горлатов с соав., 1989]. Вариант данного штамма, растущий на 2-хлорфеноле и 3-хлорбензоате, бьш получен после длительной адаптации к указанным субстратам [Моисеева с соавт., 1999].
Штаммы Rhodococcus из коллекции Е.Л. Головлева [Головлев, 1983]: - штамм Rhodococcus rhodochrous 89 выделен из песчаной почвы соснового леса в пойме реки Волга. - штамм Rhodococcus rhodnii 135 выделен из почвы, загрязненной нефтью, дизельным топливом и хлорфенолами, методом накопительных культур. - штамм Rhodococcus opacus 1G выделен методом накопительных культур из почв, загрязненных нефтью, недалеко от Самары. - штамм Rhodococcus ruber Р25, выделенный из почв, загрязненных галогенированными ароматическими соединениями (ОАО "Галоген", Пермь [Плотникова с соавт., 2006]). - штамм Pseudomonas putida 87, растущий на 3-хлорбензоате, бьш выделен методом накопительных культур [Грищенков с соавт., 1983]. - штамм Rhalstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) JMP 134, растущий на 2,4-Д [Pemberton et al., 1979].
Для культивирования родококков была использована минеральная среда следующего состава (г/л): Na2HP04 0.7; КН2Р04 0.5; NH4N03 0.75; MgS04 х 7Н20 0.2; MnS04 0.001; FeS04 0.02; дистиллированная вола до 1 л [Горлатов с соавт., 1989]. Для получения биомассы клеток, выращенных на бензоате натрия и феноле, культивирование штаммов проводили на качалке (200 об/мин) в колбах Эрленмейера с 200 мл среды. Субстраты, соответственно, вносили однократно, 3 мМ, или дробно, по 200 мг/л, до суммарной концентрации 2 г/л. Для получения биомассы клеток, выращенных на 4- и 2-хлорфенолах проводили периодическое культивирование штамма R: opacus lcp в 10-ти литровом биореакторе с объемом среды 7-7,5 литров. Субстраты вносили дробно по 50-150 мг/л, суммарная концентрация составляла 1-3 г/л. За ростом культур следили по снижению потребления кислорода и изменению значения рН. рН ростовой среды поддерживали на уровне 7.0-7.2 периодическими внесениями 0.1 MNaOH.
Для выделения ДНК R.opacus lcp выращивали при 30С в минеральной среде, рН 7.2 [Dorn et al., 1974] с двойной концентрацией фосфатного буфера, содержащей 20 г/л глицина и 2 г/л глюкозы. Штамм P. putida PRS2000 [Ornston, 1966] выращивали в той же среде, но без глицерина и глюкозы, но с 5 мМ бензоата натрия в качестве источника углерода и энергии. Exoli DH5 x была получена от GIBCO BRL. Ее выращивали на LB среде [Sambrook et al., 1989] с 100 цг/мл ампицилина при 37С с перемешиванием.
PBluescript II SK(+) является фагемидным производным pUC19 (P/aclacZ Apr;fl [+], ColEl производный) и получен от Stratagene. pROPO получен клонированием 0.33 кб продукта ПЦР с праймерами fw-om 1 и rev-oml с ДНК из R.opacus lcp в pBluescript II SK по EcoKV сайту. pROPl получен клонированием 9.5 кб Notl фрагмента ДНК R.opacus lcp в pBluescript II SK(+). Для проведения сиквенса были получены субклоны pROPl. 3.2. Клонирование генов катаболизма 3-хлорпирокатехина у R. opacus lcp
Гомогенную 3-ХПК 1,2-ДО (49 иг) обрабатывали трипсином, полученные полипептиды разделяли методом ВЭЖХ как описано ранее [Eulberg et al., 1998]. Выбранные полипептиды подвергали автоматическому секвенированию на приборе Applied Biosystems model 473А.
Геномную ДНК выделяли по стандартной процедуре [Eulberg et al., 1997]. Плазмидную ДНК из Exoli DH5a выделяли с помощью набора Pharmacia Flexiprep. Векторную ДНК, разрезанную одной рестриктазой, дефосфорилировали перед лигированием. Для клонирования продукта ПЦР Т-вектор готовили как описано
Марчуком с соавт. [Marchuk et al., 1991]. Фрагменты ДНК для лигирования или метки дигогсигенином выделяли из геля с использованием набора Easy Pure (Biozym). Компетентные клетки готовили из E.coli DH5a, последующую трансформацию проводили по методу Иное с соавт. [Inoue et al., 1990]. Наличие вставки ДНК определяли на чашках с LB, содержащей 0.13 мМ IPTG и 32 цг X-Gal, по цветовому признаку. Для проведения ПЦР использовали олигонуклеотиды, которые заказывали на основе определенной N-концевой последовательности 3-ХПК 1,2-ДО и одного из внутренних пептидов. Реакционная смесь (50ил) содержала 50 пмоль каждого праймера, 0.5 иг геномной темплатной ДНК, 25 цМ каждого из дезоксинуклеозид трифосфата, 1х ПЦР буфер (MBI Fermentas), 2.0 Ед Таг полимеразы(МВ1 Fermentas), 3 мМ MgCb. ПЦР проводили в следующих условиях: начальная денатурация (98С, 2 мин) до добавления полимеразы; 9 циклов со снижающейся температурой отжига (55-47С, 30 сек); полимеризация (72С, 1 мин), денатурация (98С, 45 сек), 20 циклов аннелинга при 45 С; 5 мин полимеризации в конце последнего цикла.
Продукт ПЦР изначально был лигирован в поли-Т EcoRY сайт pBluescript II SK(+) с образованием pROPO. Вставка pROPO была помечена дигогсигенином, для чего использовали DIG DNA Labeling и Detection Kit Nonradioactive (Boehringer,
Германия) . Процедуру ввода метки и гибридизации выполняли согласно прилагаемым инструкциям. Полученную пробу в дальнейшем использовали для идентификации фрагмента после проведения саузерн блота с 0.44 иг ДНК, разрезанной Notl, и нанесенной на 1% агарозный гель с ТАЕ (на литр; 4,48 г Tris, 1,14 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 0,5 М ЕДТА, рН 8 ). До переноса ДНК на Nybond N+ мембрану (Amersham) с диаметром пор 0,45им, гель инкубировали дважды в 0,25 М НС1 в течение 15 мин, затем в 1,5 М NaCl-0,5 М NaOH для денатурации. Из второго геля вырезали полосу, соответствующую по размеру давшей сигнал при гибридизации на мембране, ДНК элюировали и лигировали в pBluescript II SK(+). После трансформации лигированной смесью клеток Е. coli DH5a ме1 енные вставки pROPO использовали для идентификации нужных клонов при гибридизации колоний. Нуклеотидный сиквенс перекрывающихся последовательностей pROPl определяли, секвенируя субклоны в pBluescript II SK(+) с использованием набора для секвенирования с Т7 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) на приборе ALF Express II sequencer (Pharmacia). Анализ данных проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene, DNASTAR Inc Madison, Wis. BlastX использовали для сравнения полученных последовательностей, ClustalX 1.8 - для проведения множественных выравниваний
Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 2- хлорфеноле
Первые этапы очистки ДЛГ совпадали с очисткой ХМЛДГ. На этапе ионообменной хроматографии ДЛГ также не связывалась с носителем. (NH SC добавляли до 25% от насыщения и после центрифугирования при 20 000 g, 15 мин к супернатанту добавляли сульфат аммония до 40% от насыщения. Белок обессоливали и концентрировали ультрафильтрацией на ячейке (Amicon) с мембраной UM-10. (NH4)2S04 добавляли до 1,8 М и после центрифугирования при 20 000 g, 40 мин супернатант наносили на колонку с Butyl-Sepharose (объем 20 мл), предварительно уравновешенную 0,05 М Tris/HCl, рН 7,4 буфером (буфер В) с 1,8 М соли. Колонку промывали двумя объемами стартового буфера, белки элюировали снижающимся линейным градиентом сульфата аммония (1,8-0 М) в 200 мл стартового буфера. Скорость протока 0,8 мл/мин. Фракции, содержащие пик ДЛГ активности, собирали и концентрировали до 1,5 мл в ячейке с мембраной YM-10. После центрифугирования (14000g, 5"мин) препарат наносили на колонку с Superdex G-25, уравновешенную 0,05 М Tris/HCl, рН 9,0 (буфер С). Следующим этапом очистки была ионообменная хроматография на колонке MonoQ (1 мл), уравновешенной буфером С. Фермент наносили в пять приемов, элюцию вели линейным градиентом NaCl (0-0,2 М) в 20 мл стартового буфера, скорость протока 1 мл/мин. К объединенным фракциям добавляли (NHt S&t до конечной концентрации 1,8 М в буфере С и после центрифугирования наносили на колонку Resource Iso, уравновешенную буфером С с 1,8 М (NH SO,}. Белки элюировали линейным 1,8-0,9 М градиентом (NH SC в 20 мл стартового буфера при скорости 0,8 мл/мин. Фракции, содержащие пик ДЛГ активности, объединяли, диализовали против 0,05 М Tris/HCl буфера, рН 8,4 и использовали в работе. г/йс-Диенлактон использовали для определения активности ДЛГ во время очистки.
Бесклеточный экстракт наносили на колонку с DEAEoyopearl 650 М (2,6 х 40, объем носителя 160 мл), предварительно уравновешенную буфером Б. Белки элюировали линейным возрастающим градиентом 0-0,5 М NaCl в 1,6 л стартового буфера. Скорость протока 2 мл/мин. Фракции, содержащие ферментативную активность, концентрировали до 5 мл в ячейке для ультрафильтрации с мембраной РМ 10 и наносили на колонку для гель-фильтрации (2,6 х 100, объем носителя 450 мл), скорость протока 1 мл/мин. К объединенным фракциям добавляли до конечной концентрации 0,8 М и после центрифугирования (20 мин, 20 000 g, 4"С) наносили на колонку с Phenyl-Sepharose (1,6 х 20, объем носителя 32 мл), предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию вели снижающимся 0,8-0 М градиентом (NH4)2S04 в 500 мл стартового буфера, скорость протока - 1,5 мл/мин. Фракции, содержащие наивысшую активность 4-ХПК-ДО, объединяли, обессоливали путем концентрирования в ячейке с мембраной РМ 30 и наносили на колонку Mono Q HR 5/5, уравновешенную буфером Б. Белки элюировали ступенчатым градиентом NaCl в том же буфере (200 мл). Скорость протока - 1 мл/мин. Активные фракции объединяли и диализовали против буфера А. Этот препарат после диализа был использован для определения физико-химических и кинетических свойств фермента и определения ИНг-концевой аминокислотной последовательности.
Для получения больших количеств 4-ХПК-ДО для кристаллизации схему очистки модифицировали следующим образом: меняли последовательность этапов гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose (объем носителя и объем элюирующего буфера увеличивали, соответственно, до 180 и 2000 мл) и гель-фильтрации, для второй ионо-обменной хроматографии вместо MonoQ использовали Resource Q (6 мл), белок элюировали ступенчатым градиентом NaCl: 0-0,12 М в 15 мл, 0,12-0,3 М в 90 мл, 0,3-0,5 М в 30 мл стартового буфера. Последним этапом вводили стадию гидрофобной хроматографии на колонке Resource Iso (1 мл). Белки элюировали линейным снижающимся градиентом 1,6-0 М аммония сульфата в 25 мл стартового буфера. Для определения активности фермента во время очистки в качестве субстрата использовали пирокатехин.
Для очистки ХМЦИ бесклеточный экстракт наносили на колонку с Q-Sepharose Fast Flow (HR 16/10, объем 20 мл), предварительно уравновешенную буфером Б, несвязавшиеся белки удаляли тем же буфером, элюцию вели ступенчатым градиентом NaCI: 0-0,2 М в 40 мл, 0,2-0,4 М в 260 мл, 0,4-1,0 М в 40 мл. Наиболее активные фракции объединяли, добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 0.8 М и после центрифугирования (30 мин, 100 000 g, 4 С) надосадочную жидкость наносили на колонку Phenyl Sepharose Fast Flow (HR 16/10), объем 8 мл. Промывали буфером Б с 0,8 М (NH4)2S04 и элюировали линейным снижающимся градиентом 0,8-0 М (NH4)2SC 4 в 160 мл стартового буфера. Наиболее активные фракции объединяли, концентрировали в микроконцентраторах Amicon centricon 30 до объема 2 мл и наносили на колонку Superdex 200 prep-grade column (HiLoad 16/60, объем 120 мл), уравновешенную буфером Б с 0,2 М NaCI, скорость протока 1 мл/мин. Наиболее активные фракции объединяли, обессоливали на микроконцентраторе. Активность ХМЦИ во время очистки определяли с 2-хлормуконатом.
Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах
Для дальнейшей работы были использованы штаммы R. opacus lcp, R. rhodochrous 89, R. rhodnii 135, R. opacus 1G, R. ruber P25.
Штамм Rhodococcus opacus lcp использовал в качестве единственного источника углерода и энергии широкий набор ароматических соединений, в том числе 2,4-дихлорфенрл, фенол, бензоат, л-крезол, 4-хлорфенол. Динамика роста штамма R. opacus lcp в биореакторе на среде с 4-метилбензоатом в качестве единственного источника углерода и энергии показана на рисунке 12. Лаг-период был очень небольшой и составил несколько часов. Штамм достаточно быстро перешёл в экспоненциальную фазу роста. Оптическая плотность при 545 нм, при которой прекращали культивирование, была 2,2-2,4. Используя полулогарифмическую шкалу зависимости оптической плотности культуральной жидкости от времени культивирования, рассчитали удельную скорость роста штамма ц, она составила 0,12 ч"1. Время удвоения / / равнялось 5,8 ч.
На начальных этапах работы со штаммом R. opacus lcp было изучено влияние 4-хлорфенола на его ростовые характеристики. Культивирования проводили в колбах с минеральной средой, куда дробно вносили 4-ХФ. После засева и добавления 50 мг/л 4-ХФ лаг-фаза составляла от 20 до 25 часов. Последующее дробное внесение субстрата (по 100 мг/л) приводило к увеличению оптической плотности до 0,2-0,3 единиц при 560 нм (Рис. 13). При культивировании в колбах эти значения плотности были максимальными. Внесение 4-ХФ в концентрации выше 200 мг/л приводило к ингибированию роста культуры.
Длительное культивирование штамма на твердой и жидкой средах с 4-ХФ с многократными пересевами привело к значительному изменению характера роста на токсиканте. Так, в ходе культивирования R. opacus lcp в 10-ти литровом биореакторе обнаружено сокращение лаг-фазы до 5 часов, вся ферментация длилась около 47 часов, при этом оптическая плотность увеличивалась с 0,12 до 1,50 единиц, культура суммарно потребляла 4 г/л субстрата (рис. 13). Удельная скорость роста равнялась 0,11 ч", а время удвоения клеток - 6,3 ч. Расчеты, проведенные для нескольких ферментации, давали незначительные различия в данных ц=0,11-0,15 ч 1, td= 4,7-6,3 ч. Разложение 4-ХФ сопровождалось закислением среды, поэтому важным для оптимального роста клеток было поддержание рН на уровне 7,0-7,2. В этих условиях внесение 4-ХФ в концентрации до 200 мг/мл не приводило к ингибированию роста. Таким образом, нами была проведена адаптация культуры к новому субстрату и оптимизация условий культивирования R. opacus lcp на 4-ХФ (дробное внесение добавок, поддержание рН на определенном уровне, количество вносимых добавок), что позволило значительно увеличить выход биомассы.
В процессе культивирования R.opacus lcp была обнаружена морфологическая неоднородность состава популяции, что дало повод к изучению морфологического состава клеток при длительном культивировании на хлорированных фенолах. Исходным для работы был взят штамм R. opacus 1ср, долгое время поддерживаемый на 2-ХФ в качестве единственного источника углерода. Клетки этого штамма образуют на МПА колонии одинаковой гладкой формы (S1), имеющие розовую окраску с ровной и слегка блестящей поверхностью (Рис. 14Б). При длительном культивировании клеток этого исходного штамма на МПА через 10-15 пересевов происходило появление шероховатых форм (R) такого же розового цвета (табл. 3, рис. 14В), при этом на протяжении роста колоний происходило изменение формы их поверхности: вначале колонии имели форму маленьких неблестящих неровных колец, затем по мере роста происходило заполнение внутреннего пространства клеточной массой, а поверхность уже взрослой колонии все равно оставалась шероховатой с рядом извилин. При температуре культивирования 7С поверхность колоний приобретала более бугристую и складчатую структуру.
