Содержание к диссертации
Введение
Современные представления о спорах грибов, их прорастании и изменениях в процессе хранения 7
1. Покоящиеся клетки (споры) в цикле развития грибов 7
2. Типы споруляции клеток 11
3. Два вида покоя клеток в цикле развития грибов 12
4. Химический состав покоящихся клеток грибов
4.1. Содержание воды 15
4.2. Особенности липидного состава покоящихся клеток грибов 16
4.3. Состав углеводородов покоящихся клеток грибов 20
Современные представления о прорастании спор грибов.
Роль ингибиторов и стимуляторов, контролирующих выход клеток из состояния покоя 26
1. Прорастание спор грибов 26
2. Изменения в химическом составе спор в процессе хранения 32
Экспериментальная часть 36
Глава 1. Материалы и методы исследования 36
Глава 2. Особенности экзогенного покоя и процесса прорастания конидий А. niger 45
2.1. Морфология конидий А. niger з
2.2 Особенности прорастания конидий А. niger 45
2.3. Влияние физико-химических факторов на прорастание конидий .48
2.3.1. Влияние кислотности среды и длительности хранения спор 48
2.3.2. Влияние температуры 48
2.3.3. Термостабильность спор 48
2.3.4. Влияние источников углерода и азота 50
2.3.5. Влияние токсических веществ 52
2.3.6. Влияние антиоксидантов и жирных клеток 52
2.4. Химический состав (липидный и углеводный) покоящихся конидий А. niger 53
2.5. Влияние температуры на химический состав конидий А. niger 58
Глава 3. Изменения в липидном и углеводном составе конидий А. niger в процессе прорастания 58
Глава 4. Изучение изменений в липидном и углеводном составе конидий в процессе хранения и установление химических критериев, определяющих всхожесть спор 66
Глава 5. Практические рекомендации, вытекающие из результатов исследований 71
Глава 6. Обсуждение результатов 78
Выводы 87
Список литературы
- Два вида покоя клеток в цикле развития грибов
- Изменения в химическом составе спор в процессе хранения
- физико-химических факторов на прорастание конидий
- Практические рекомендации, вытекающие из результатов исследований
Два вида покоя клеток в цикле развития грибов
Под термином «спора» у грибов понимается высоко специализированная клетка, представляющая собой итог бесполого или полового процесса. Поэтому в широком смысле спору грибов рассматривают как «начало и конец развития этих организмов [Weber, Hess, 1975.]. Процесс спорообразования можно рассматривать как определённую стратегию многих организмов (растений, животных, микроорганизмов), позволяющую сохранить геномный материал (genomic safe house) [Osherov, May, 2001]. Этот процесс вызывают \/ целый ряд неблагоприятных факторов : голодание, охлаждение, нагревание, химические реагенты, в том числе яды, свет, радиация и др. Среди этих физико-химических факторов наиболее распространенным является голодание.
Предполагают, что биологические клетки существовали на земле около трёх миллиардов лет назад и, вероятно, отличались значительной простой как структурной, так и функциональной. Возможно, такая клетка напоминала современных анаэробных бактерий [Saier, Jacobson, 1984 ], размножалась бинарным делением и была способна к недифференцированному росту при благоприятных условиях окружающей среды.
Первая клетка, способна/к дифференциации, имела циклический меха- низм, способный воспроизводить покоящиеся клетки. Это были гаплоидные споры, менее чувствительные к экстремальным окружающим условиям, чем вегетативные клетки. Вероятно, для этих целей был создан новый механизм или были использованы перестройки имеющегося геномного аппарата, но любой из этих путей обеспечивал клетке способность переходить в «покоящуюся» стадию - спору. Образование таких клеток достаточно распространено в природе. Спорообразование свойственно больщинству васкулярных растений, например, таких как папоротники и мхи. Образовывать такие же клетки способны как эукариотные, так и прокариотные микроорганизмы, в J частности грибы, одноклеточные почвенные амебы, относимые к «слизистым плесеням», а также Eubacteria [Osherov, May, 2001]
Почти все грибы, за исключением нескольких стерильных видов, образуют споры. Большинство видов образуют половые споры (зигоспоры, ас-коспоры, базидиоспоры) и бесполые (артроспоры, редулоспоры, конидии, зиготы , хламидоспоры, бластоспоры, и другие..). Например, мукоровые грибы образуют, как правило, два типа спор - спорангиоспоры ( бесполые) и зигоспоры (половые), а ржавчинные грибы - даже пять типов спор [Trione et.al., 1966]. Бесполые споры Mucorales также отличаются многообразием, например, споры Dicranophora fulva бывают двух типов - мелкие эллипсоидальные и более крупные [Dobbs,1936], у Blakeslea trispora встречаются спорангиоспоры двух типов: образующиеся в спорангиолях (СС) и стилоспоран-гиях (СТ), которые практически неразличимы морфологически, но отличаются по своему химическому составу [Терешина , Феофилова, 1995]. У Fusar-iшп oxysporus обнаружено три типа покоящихся клеток : макро-, микроконидии и хламидоспоры [Билай,1977].Втожевремя у бактерий эндоспоры свойственны всего 121 виду Bacillus и Clostridium, причем все они образуют только один тип спор. Однако в последние годы у других прокариотов обнаружено еще несколько типов покоящихся клеток: экзоспоры, цисты, акинеты, бделлоцисты, микоспоры и другие.
Различие между бактериальными и грибными спорами проявляется и в том, что последние более разнообразны морфологически и имеют более крупные размеры (от 5 до 200 мкм ), в то время как бактериальные споры внешне выглядят более однородными и размеры их колеблятся от 0,5 до 10 мкм [Weber, Hess, 1975].
Споры в жизненном цикле грибов кроме основной функции - завершения процесса бесполой и половой репродукции - выполняют еще две : обес 9 печивают виду способность выживать при наступлении неблагоприятных условий и способствуют распространению вида во внешнем ареале.
У грибов споры, предназначенные для распространения вида, находятся обычно в состоянии экзогенного покоя и такие споры называют пропага-тивными [Курсанов, 1940]. Наиболее типичный пример таких спор - конидии Eurotiales. Второй тип грибных спор предназначен для сохранения вида в течение более долгого времени и эти споры находятся в состоянии эндогенного покоя (Dauersporen). Это, например, многие зигоспоры Mucorales, бази-диоспоры Basidiomycetes. Эти две категории грибных спор существенно различаются по морфологии, способности к прорастанию, по численности образующихся спор, сохранению всхожести. Основные отличия наблюдаются в биохимическом составе (см. ниже). Здесь интересно отметить, что функция спор - распространение вида - не так давно считалось привилегией грибных спор, но не спор прокариот. Споруляцию бактерий рассматривали не как процесс репродукции, а только как ответ клетки на неблагоприятные внешние воздействия, заставляющие ее изменять цикл своего развития. Однако, еще в 1985 г. у Anaerobacter polyendospores в материнской клетке обнаружили до 5 спор, и эндогенное спорообразование у бактерий стали также рассматривать, как процесс размножения [Duda et.al., 1987].
Споры грибов , как отмечалось выше, морфологически более разнообразны, чем бактериальные. Они, как преобладающий тип могут быть сферическими или элипсоидальными, но часть спор может иметь специфическую орнаментацию, звездообразную, игольчатую и палочковидную форму и выпуклую или вогнутую поверхность. Большинство грибных спор имеют черную окраску, хотя встречаются споры розовые, оранжевые и коричневые [Weber, Hess, 1975].
Изменения в химическом составе спор в процессе хранения
Процесс прорастания спор при поверхностном культивировании на глюкозо-пептонной среде занимает 6-8 часов. Первые 4-5 часов споре свойствен сферический рост, который называют стадией I или набуханием, при этом спора увеличивается в диаметре в 3-4 раза (рис. 4 ). Стадия II в процессе прорастания занимает следующие 3-4 часа. В это время происходит образование проростковой трубочки, которая имеет характерный для грибов апикальный рост. Для исследуемого гриба типично образование одной проростковой трубочки. Иногда возникают 2 проростковых трубочки, расположен ти
Гребневидные выросты на поверхности конидий А. niger (х 9000) ных в одной плоскости (рис. 4 ). Такое расположение обусловлено, видимо, тем, что для спор Aspergillus характерно наличие не проростковой поры, а кругового экваториального кольца прорастания [Hawker, Madelin, 1976]. Нужно отметить, что процесс прорастания у А. niger протекает несинхронно - на рис. 4 видны обе стадии прорастания одновременно.
При глубинном культивировании наблюдаются некоторые отличия в процессе прорастания. В жидкой среде Блюменталя-Роземана I фаза прорастания (набухание) продолжается 4-6 часов, а проростковые трубочки появляются несинхронно в течение следующих 4-5 часов. При этом возникают комочки по 5-Ю конидий, в которых образование проростковых трубочек происходит быстрее, чем у отдельно лежащих конидий. Ветвление гиф начинается к 12 часам роста и наблюдается процесс образования шаровидных колоний - пеллетов.
Для выяснения вопроса о типе покоя (экзогенном или эндогенном) СС высевали в жидкие среды, содержащие: (1) бидистиллированную воду, (2) 0,2% глюкозы, (3) 0,2% пептона, (4) 0,2% (NH4)2S04, (5) по 0,2% глюкозы и пептона, (6) по 0,2% глюкозы и (NR SC . Через 2 суток культивирования на средах 1 и 4 наблюдали только набухшие споры, тогда как на средах 2 и 3 видны споры с проростковыми трубочками различной длины, т.е в данном случае процесс прорастания уже закончен. Только на средах, содержащих источники азота и углерода (5 и 6) сформировался ветвящийся мицелий.
Изложенные выше данные показывают, что триггером, способствующим выходу из состояния покоя конидий А. niger, служит вода, т.е. в данном случае покой спор является экзогенным, что характерно для многих аспер-гиллов.
Развитие плесневых грибов в дистиллированной воде отличается большим разнообразием - от единичных проростков (например, для А. niger 24) до образования спорулирующего мицелия ( для А. niger 472, Fusarium momliforme 637, Alternaria tenuis 635, Trichothecium roseum 531 и др.) [Тата-ренко, Терпикова, 1960]. Существует мнение, что конидии дейтеромицетов являются модифицированной вегетативной клеткой, так как они способны, как и гифы, образовывать конидиеносцы, конидии и хламидоспоры [Мап-genot, Reisinger, 1976]. В бидистиллированной воде многие представители этих грибов (А. niger, Penicillium digitatum, Helminthosporium spiciferum и др.) способны к микроциклическому конидиеобразованию, когда проростковая трубочка превращается в конидиеносец с конидиями.
В случае изучаемого штамма А. niger в воде наблюдается только I стадия прорастания, переход ко второй стадии прорастания происходит только в присутствии источника азота или углерода, для формирования ветвящегося мицелия требуется уже присутствие Сахаров и азотсодержащих веществ.
Особенности прорастания штамма А. niger могут быть связаны с химическим составом покоящихся конидий, что может быть обсуждено после изложения приведенных ниже данных о действии на этот процесс ряда физико-химических факторов.
Изучение влияния кислотности среды на процесс прорастания спор А. niger проводили на 3-х партиях спор, различающихся сроком хранения. Споры партий П 25-06-98 и П 22-06-98 хранились в течение 1,5 лет, всхожесть их не превышает 60% и оптимальной для прорастания является рН от 3 до 5. Интересно, что "свежеполученные" споры (партия 52-11-99, срок хранения 3 месяца) способны прорастать в более широком диапазоне рН - от 3 до 6,5 (рис. 6).
Температурный оптимум прорастания установили, выращивая споры на глюкозо-пептонной среде при 18-20, 26-2S, 32-34 и 36-38С. Интенсивность прорастания была соответственно 1,3, 26, 57 и 51%, из чего следует, что оптимальным является температурный интервал 32-34С.
Споры A. niger термостабильны в узком пределе -до 45С, уже при 50С половина спор теряет способность к прорастанию (рис. 7). Интересным фактом представляется устойчивость фракции спор менее 0,5% к прогреванию: при 98С единичные споры сохраняли способность к прорастанию. В связи с этим интересно отметить существенную разницу в устойчивости к температуре в сухом состоянии и в присутствии воды. Одинаковое количество проросших спор (12%) наблюдается после выдерживания сухих спор в течение 20 суток при 50С и 20 минут при 50С в воде. Интересно, что жесткая температурная обработка водной суспензии и сухих спор в автоклаве при 121 С в течение 1 часа не приводила к полной потере всхожести - единичные споры с большой задержкой по времени все же прорастали. Эти данные а также разница вдвое при прорастании спор при 26 и 32 С свидетельствуют о большой гетерогенности спор по отношению к температуре
Из представленных в таблице 1 результатов по влиянию источников углерода и азота следует, что на фосфатно-цитратном буфере практически все сахара (кроме фруктозы и 2-дезокси-В-глюкозы) увеличивают количество проросших спор в 1,5-2,5 раза, тогда как на бидистиллированной воде только глюкоза, инозит и D-глюкозамин стимулируют прорастание, а другие сахара оказывают ингибирующее действие. Аналог глюкозы - неметаболизи-руемая 2-дезокси-В-глюкоза - полностью ингибирует процесс прорастания на обоих средах. Необычным фактом является стимуляция в 3-5 раза количества проросших спор азотсодержащими веществами, которая отчетливо выражена на фосфатно-цитратном буфере и сохраняется на бидистилляте. Полученные данные показывают, что стимулирующим действием обладают глюкоза, D-глюкозамин, мезо-инозит, L-пролин, пептон. Интересно отметить, что L-пролин и D-глюкозамин практически одинаково стимулируют прорастание конидий А. niger в концентрации 0,1-2,0% (8,6х10"5-1,7х10" М).
физико-химических факторов на прорастание конидий
С Белгородского завода АО «Цитробел» были получены образцы посевного материала (конидий), сходные по условиям хранения и отличающиеся различной степенью всхожести. Было проанализировано 9 образцов из партий спор, используемых на заводе.
Сравнение данных о химическом составе покоящихся конидий, способных к прорастанию (СП) и потерявших "всхожесть" (ПВ), показало, что они различаются по составу фосфолипидов (рис. 8). ПВ конидии содержат значительно меньше ФХ, в большинстве образцов этот фосфолипид содержится в следовых количествах, однако одновременно происходит резкое увеличение содержания ФЭА. Определенные отличия наблюдаются и в составе НЛ: происходит снижение уровня ТАГ и значительное увеличение уровня ДГ. Интерес представляет высокий уровень СЖК, содержание которых у СП конидий увеличивается только ко II стадии, когда процесс прорастания уже практически завершается и дальнейшая регуляция роста мицелия контролируется системой стеринов и гиббереллинов [Феофилова с соавт., 1991]. способные к прорастанию (97% жизнеспособных конидий). Определенные изменения можно отметить и в составе углеводов цито золя СП и ПВ конидий. У последних практически отсутствует глицерин, уве личено содержание арабита и уменьшается количество маннита - Ес ли у конидий, способных активно прорастать, основным углеводом является маннит, составляющий до 40% от суммы Сахаров, то у конидий с нулевой всхожестью преобладает другой сахароспирт - арабит и практически нет глицерина. При этом уровень трегалозы остается практически без. изменений.
Нас интересовало, сохранятся ли указанные выше изменения в составе Сахаров для других видов аскомицетных грибов. С этой целью исследовали изменения в составе углеводов в процессе хранения А. japonicus. В опытах использовали споры, полученные с сусло-агаровой среды, высушенные лио-фильно и хранящиеся как указано в главе 2 для А. niger. Изменения в составе углеводов в процессе хранения конидий аспергилла представлено в табл. 11. Показано, что наиболее заметные изменения отмечаются в содержании маннита, арабита и трегалозы. В конидиях, не утративших в течение 52 дней всхожесть, среди сахароспиртов преобладает маннит, происходит заметное уменьшение уровня арабита (почти в 6 раз) и возрастает содержание трегалозы. Таким образом и в процессе хранения жизнеспособных спор наблюдается отмеченная выше закономерность - основные изменения отмечаются в уровне маннита и арабита, причем содержание арабита резко снижается,
Изменения углеводного состава (% от суммы сахароз) ци-тозоля в процессе хранения конидий А. japonicus.
В связи с имеющимися в литературе данными о том, что споры у низших грибов не содержат полиолов [Феофилова с соавт. 1991], можно было ожидать, что в процессе хранения таких спор наблюдаются иные закономерности. С этой целью были исследованы спорангиоспоры Т(+) и Т(-) штаммов Blakeslea trispora, которые в настоящее время активно используются в биотехнологических производствах.
Мы обратили внимание на тот факт, что споры В. trispora быстро теряют жизнеспособность после 30-40 суток хранения на косом слое питательного агара. В то же время конидии А. japonicus и А. niger сохраняют практически 100% -ную всхожесть в течение года и более.
Из представленных на рис. 10 а,б данных следует, что споры, полученные из спорангиолей (С-споры) (+) и (-) штаммов В. trispora обнаруживают во время хранения на косяках одну и ту же закономерность: уровень глюкозы возрастает, а количество трегалозы снижается. Некоторые отличия отмечены у (+) С-спор , у которых к концу хранения содержание трегалозы выше, чем глюкозы, несмотря на то, что уровень первой снижается в процессе хранения. Наиболее активное накопление глюкозы и снижение трегалозы отмечается для (-) С-спор В. trispora.
Если сопоставить полученные данные с имеющимися сведениями о физиологической функции углеводов цитозоля , а именно с тем фактом, что устойчивость к внешним воздействиям определяется наличием высокого уровня трегалозы и, возможно, сахароспиртов, то можно сделать следующие выводы.
В отличие от аскомицетных грибов споры изученных зигомицетов Ми-corales находятся в "активном" состоянии, о чем свидетельствует постоянно понижающийся при хранении уровень углевода "покоя" - трегалозы и увеличение количества глюкозы - метаболита, соответствующего активной жизнедеятельности. Именно с этим фактом может быть связано наблюдение, что споры Д japonica, А. coerulea и В. trispora не остаются жизнеспособными длительное время при хранении на косяках в отличие от аскомицетов. Если сопоставить полученные данные с имеющимися сведениями о физиологической функции углеводов цитозоля [Tan, Moore, 1994; Терешина с соавт., то 1996], а именно с тем фактом, что устойчивость к внешним воздействиям определяется наличием высокого уровня трегалозы и, возможно, сахароспир-тов, то можно сделать следующие выводы. Спорангиоспоры мукоровых грибов в соответствующих условиях хранения не находятся в состоянии покоя, в отличие от конидий аскомицетов. У последних при хранении содержание трегалозы повышается по мере хранения, что свидетельствует об отсутствии активной жизнедеятельности и свойственно покоящимся спорам. Вероятно именно с этим связан тот факт, что конидии аскомицетных грибов длительное время при хранении на косяках не теряют способности к прорастанию. В связи с этим интересно, что по мере подсыхания агарового косячка уровень трегалозы в конидиях А. niger увеличивается.
Таким образом, впервые показано, что для сохранения жизнеспособности спор существенное значение имеет состав углеводов цитозоля. Для аскомицетных грибов сохранение способности к прорастанию определяется уровнем маннита и трегалозы и, возможно, маннит придает аспергиллам большую устойчивость при хранении по сравнению со спорами Mucorales. У последних есть только трегалоза, а нециклические полиолы отсутствуют. В связи с этим можно предположить, что именно появление в процессе эволюции сахароспиртов у Ascomycota обеспечило большую стабильность мембран и увеличило способность к выживанию.
Практические рекомендации, вытекающие из результатов исследований
Одним из направлений современной биотехнологии является изучение условий получения, хранения и поддержания в активном состоянии спорового посевного материала. В основе развития этого направления биотехнологии лежит достаточно обширный практический материал, свидетельствующий о том, что от качества используемых для ферментации спор зависит весь биотехнологический процесс и даже стоимость конечного продукта [Hoch, 1996].
В настоящее время в биотехнологии имеется несколько направлений в методах «отбора» спор для приготовления посевного материала.
Известно, что грибы способны давать несколько типов спор и это наблюдение также используется в современной биотехнологии. Например, му-коровый гриб Blakeslea trispora образует два типа спорангиоспор: образующиеся в спорангиолях (I) и в стилоспорангиях (II). Показано, что, используя как посевной материал I тип спор можно увеличить выход Р-каротина, если преобладает II тип - соответственно можно интенсифицировать выход лико-пина [Феофилова, 1997].
Вторым направлением является отбор спор по их величине. Известно, что споры грибов неоднородны по своим размерам и по способности образовывать при прорастании одну или несколько проростковых трубочек. Эти отличия также используются при подготовке спорового материала. Например, установлено, что конидии аспергиллов, используемых для приготовления "ферментированной" соевой пищи, отличаются по размерам и, если отбирать фракцию более мелких спор, то "ферментированная" пища не будет содержать микотоксинов [Trinci, 1994].
Наиболее перспективным направлением является способ подготовки посевного материала путем его направленного воспитания (Zuchtung), который особенно успешно применяется в Германии. Этот метод включает ряд физико-химических воздействий на споры и основан на стрессовом эффекте. При этом, предполагается, что полученные изменения в метаболизме спор передаются в мицелий, вырастающий из этих спор [Горнова с соавтор., 1991].
Однако, в любом современном биотехнологическом производстве в первую очередь, подготавливая споровый материал, решают вопрос о том, какой тип покоя свойствен покоящимся клеткам организма-продуцента. В данном случае определение типа покоя дает возможность разработать стратегию активизации и хранения спор. Так, если споры находятся в состоянии эндогенного, более глубокого покоя, то требуется сильное стрессовое воздействие наряду с оводнением покоящихся клеток, в частности действие ядовитых соединений или температурный шок [Cotter, 1981]. Например, эндогенно покоящиеся споры Phycomyces blakesleeanus для своего более быстрого пробуждения требуют температурную обработку при 50С в течение 3 минут, при этом мишенью термической активации является не только липидная часть биологических мембран, но основное значение имеют конформацион-ные изменения белков [Cauwelaert, Verbeke, 1979].
Учитывая приведенные выше литературные данные и задачи, поставленные в настоящей работе, первый шаг экспериментальных исследований состоял в определении типа покоя. С этой целью первоначально изучали морфологию процесса прорастания конидий А. niger. При этом было установлено, что: согласно данным сканирующей микроскопии конидии А. niger имеют несколько необычную «колесовидную» форму с поверхностными ободочными выпуклостями. процесс прорастания состоит из стадии набухания, появления про-ростковой трубочки и ветвления мицелия. прорастание конидий происходит быстрее на твердой среде. конидии в принятых условиях культивирования прорастают несинхронно и чаще одной проростковой трубочкой. в процессе прорастания происходит образование «слипающихся» конидий (комков), в которых наблюдается более быстрое прораста 80 ние, что, вероятно обусловлено усиленной способностью к аггрега-ции. Последнее связывают с тем, что некоторая часть спор выделяет специальные стимуляторы, возможно гиббереллины [Masco, 1981; Феофилова с соавтор., 1991]. Установлено, что триггером прорастания конидий А. niger является би-дистиллированная вода, что свидетельствует о том, что конидии находятся в состоянии экзогенного покоя. Согласно принятому разделению типов покоя [Sussman, Halvorson, 1966] именно способность прорастать при добавлении только воды характерна для менее глубокого покоя - экзогенного. Однако в бидистиллированной воде происходит только I фаза прорастания конидий А. niger - набухание, при этом не требуется экзогенных источников углерода и азота, однако их внесение ускоряет прохождение I фазы. Показано, что конидии А. niger переходят во II фазу только при добавлении источников углерода и азота причем азотсодержащие соединения в 2-3 раза сильнее активируют процесс прорастания по сравнению с источниками углерода. При этом наибольшим стимулирующим эффектом обладает пептон и L-пролин, а из источников углерода - глюкоза и мезо-инозит Таким образом для конидий А Ш2ЄГ \,становлен новый вид экзогенного покоя ПРи КОТОРОМ в отличие от известных наблюдается значительно более сильная активация прорастания азотсодержащими веществами по сравнению с углеродсодержащими
Прорастание конидий не активируется температурным воздействием, что характерно для экзогенно покоящихся клеток. Конидии стабильны в узком интервале температур - до 45С. Среди конидий обнаружена фракция (менее 0,5%), способная сохранять жизнеспособность при обработке до 98С. Кроме того, встречаются отдельные, единичные конидии, которые сохраняют всхожесть после температурной обработке водной суспензии и сухих конидий при автоклавировании (121 С в течение 1 часа) и прорастают с небольшой задержкой во времени по сравнению с контрольными. Эти данные свидетельствуют о большой гетерогенности популяции и аномальном строении колоний, как одном из механизмов выживания особей [Пузырь с соавтор., 2001; Hoch, 1996, а, b].
Установлено, что оптимальной температурой прорастания является интервал 32-34С, а влияние кислотности среды связано с длительностью хранения конидий, при этом «свежеполученные» конидии прорастают в более широком интервале - от 3,0 до 6,5, что также характерно для экзогенно покоящихся клеток.
