Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. Фушщии гипофизотропных гормонов гипоталамуса .10
2. Гипоталамическая регуляция репродуктивной функции 13
2.1. Роль гипоталамуса и люлиберина в гипотала,-мо-гипофизарной системе 13
2.2. Локализация люлиберина в гипоталамусе 17
2.3. Регуляция содержания и секреции люлиберина в гипоталамусе 21
2.3.1. Участие половых стероидных гормонов и ЛГ в регуляции содержания люлиберина в гипоталамусе 22
2.3.2. Катехолатжны и ацетилхолин в регуляции содержания люлиберина в гипоталамусе 24
2.3.3. Опиоидные пептиды в гипоталамо-гипофизарной системе 25
2.4. Биосинтез и деградация люлиберина в гипо таламусе 27
3. Внегипоталаглическая локализация и экстрагипо- таламические функции гипоталамических гормонов .35
Материалы и методы 40
I. Радиоиммунологический метод определения люли берина 40
1.1. Получение антисыворотки к люлиберину 40
1.2. Получение люлиберина 40
1.3. Определение удельной радиоактивности люлиберина 42
1.4. Определение рабочего разведения антисыворотки 42
1.5. Анализ люлиберина в гипоталамусе 44
1.6. Анализ люлиберина в висцеральных органах 46
2. Получение биологического материала для определения люлиберина в гипоталамусе 48
2.1. Животные 48
2.2. Получение фрагментов гипоталамуса 49
2.3. Контроль интактности аркуатных ядер во фрагментах гипоталамуса 49
2.4. Экстракция люлиберина из фрагментов гипотала муса для радиоиммунологического анализа 50
3. Определение иммуноре активного люлиберина в висцеральных органах 50
3.1. Получение экстрактов висцеральных органов и подготовка образцов к анализу 50
3.2. Хроматография экстрактов висцеральных органов 52
4. Ферментативная инактивация люлиберина в висце ральных органах 53
4.1. Получение гомогенатов ткани для определения пептидазной активности 53
4.2. Методы определения пептидазной активности .54
4.3. Определение ингибирования деградации люлиберина факторами пептидной приро
ды 59
4.4. Определение оптимума рН ферментативной деградации [125т] люлиберина 59
4.5. Определение активности пептидазы сердца в зависимости от ионного состава среды 59
4.6. Условия хроматографии и диализа гомогената сердца 59
4.7. Определение ингибирующего эффекта люлиберина на деградацию люлиберина в присутствии ионов Са .60
4.8. Определение влияния ингибиторов протеаз на активность люлиберин-разрушающего фермента сердца 60
4.9. Определение молекулярной массы люлиберин-разрушающего ферлента из сердца 61
Результаты 62
1. Латерализация люлиберина в гипоталамусе 62
2. Люлиберин в висцеральных органах крысы 75
3. Ферментативная инактивация люлиберина в висцеральных органах крысы 88
Заключение 106
Выводи 112
Список литературы 114
- Роль гипоталамуса и люлиберина в гипотала,-мо-гипофизарной системе
- Биосинтез и деградация люлиберина в гипо таламусе
- Получение экстрактов висцеральных органов и подготовка образцов к анализу
- Ферментативная инактивация люлиберина в висцеральных органах крысы
Введение к работе
В течение последнего десятилетия одним из наиболее перспективных направлений биохимии и физиологии стало изучение нового класса биологически активных соединений пептидной природы - нейропептидов. К этой группе относятся пептидные гормоны гипоталамуса, опиоидные пептиды, субстанция Р, нейротензин и другие. Нейро-пептиды локализованы в различных отделах ЦНС, некоторых периферических органах и отличаются высокой биологической активностью и полифункциональность.
Однако, как уже отмечалось, для большинства нейропептидов характерна полифункциональность, т.е. участие в самых разнообразных процессах жизнедеятельности организма. Не являются исключением и гипоталамические пептиды. Действительно, по последним данным, роль этих соединений не ограничена регуляцией тройных функций гипофиза, а места их локализации выходят за пределы не только гипоталамуса, но и центральной нервной системы (ЦНС). Высказывается предположение, что вне гипоталамуса "гипоталамические" могут выполнять функции и/или нейромодуляторов. Таким образом, возникает еще одно направление в изучении этих соединений - поиск их экстрагипофизарных функций, а также внегипоталамической локализации в организме.
Одним из представителей гипоталамических нейропептидов является люлиберин. Долгое время исследования этого соединения проводили в рамках изучения его классической гормональной функции -центральной регуляции репродуктивной системы на уровне контроля секреции и синтеза гипофизарных гонадотропинов - лютеинизирующе-го и фолликулостимулирующего гормонов. Соответственно, в этом аспекте изучали и локализацию люлиберина в гипоталамусе. Однако, несмотря на достаточно подробную информацию о распределении и функциональном значении люлиберина в различных зонах гипоталамуса, некоторые стороны этого вопроса остаются неисследованными.
Недавно были обнаружены нейральные связи между гипоталамусом и половыми железами, обеспечивающие, по всей видимости, центральную экстрагипофизарную регуляцию деятельности гонад. Возникает вопрос, не участвуют ли в нейральных связях гипоталамус - гонады нейроны гипоталамуса, содержащие люлиберин Если это действительно так, то односторонняя гонадоэктомия должна привести к преимущественному изменению содержания пептида только в одной половине гипоталамуса. Этот факт явится подтверждением предположения об участии гипоталамического люлиберина в системе нейралыгой регуляции деятельности гонад.
_7 Гипоталамус, однако, не является единственным местом локализации люлиберина. Имеются указания о наличии этого пептида и в других областях ЦНС, но в значительно меньших количествах, чем в гипоталамусе. Что касается распределения пептида вне ВДС, то этот вопрос практически не изучен. Вместе с тем, это становится актуальным в свете последних данных об экстрагипофизарных эффектах люлиберина на висцеральные органы. Недавно было обнаружено, что экзогенный люлиберин в опытах ш VITAO оказывает прямое действие на гонады, влияет на секрецию инсулина в поджелудочной железе, а также изменяет ряд физиологических и биохимических параметров деятельности сердца. Эти данные указывают н а то, что в висцеральных органах может присутствовать эндогенный люлиберин, выполняющий функцию нейромедиатора или нейромодулятора. Однако, наличие эндогенного люлиберина в висцеральных органах до настоящей работы не было показано. Положительное решение этого вопроса позволит поновому взглянуть на участие люлиберина в регуляции висцеральных органов и даст основание для изучения новой функции пептида как нейромедиатора или локально действующего гормона.
В висцеральных органах были также обнаружены ферменты, разрушающие люлиберин в опытах w v/тдо , но их функциональное значение остается неясным. Присутствие люлиберин-разрушающих ферментов в висцеральных органах было бы оправданным при наличии в этих органах эндогенного люлиберина: эти ферменты могли бы принимать участие в расщеплении пептида, выполняющего функцию нейромедиатора. Таким образом, два этих вопроса - наличие люлиберина и ферментов его деградации - являются принципиальными для понимания биологической роли этого пептида в висцеральных органах.
С учетом изложенных соображений, целью настоящей работы является изучение особенностей локализации и функциональной ро -8 ли люлиберина, не связанных с его гормональным действием.
В первой части настоящего исследования была поставлена задача изучения распределения люлиберина в левых и правых половинах гипоталамуса у интактных и подвергнутых односторонней кастрации самцов крыс. Показано, что содержание люлиберина в левых и правых половинах гипоталамуса интактных крыс различается, причем, степень и направление асимметрии зависят от линии лабораторных животных: для крыс линии Вистар характерно повышенное содержание люлиберина в правой половине гипоталамуса, а для беспородных крыс - в левой. Асимметрия люлиберина меняется при односторонней кастрации и стрессе. Удаление правого тестикула практически не изменяет распределения люлиберина между половинами гипоталамуса, а левосторонняя кастрация приводит к значительному снижению уровня пептида в правой половине. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что между левым и правым тестикулом и конт-ралатералышми половинами гипоталамуса существуют регуляторные ней-ральные взаимодействия, а изменение содержания люлиберина в левых и правых половинах гипоталамуса свидетельствуют об участии нейронов, содержащих люлиберин в этих взаимодействиях.
Вторая задача настоящей работы заключалась в определении эндогенного люлиберина в висцеральных органах - сердце, печени, почках, надпочечниках и кишечнике крысы. Нам удалось показать, что во всех перечисленных органах присутствует соединение, по иммунологическим и хроматографическим свойствам подобное гипотала-мическому люлиберину. Не исключено, что в регуляции деятельности висцеральных органов может принимать участие эндогенное люлиберин-подобное соединение, возможно, выполняющее функцию нейромедиато-ра и/или нейромодулятора.
Известно, что действие нейромедиаторов прекращается на си -9 наптическом уровне вследствие разрушения специаяьныгж регуляторними ферментами. Как уже отмечалось, в висцеральных органах присутствуют ферменты, разрушающие экзогенный люлиберин в опытах Ш viTR.0 # Исходя из наших данных о наличии люлиберина в висцеральных органах, можно предположить, что одной из функций этих ферментов является деградация эндогенного люлиберина, а также других нейромедиаторов пептидной природы. В следующем разделе настоящей работы предпринята попытка охарактеризовать биохимические свойства люлиберин-разрушакщих ферментов висцеральных органов, в частности, сердца и сравнить их с аналогичными ферментами гипоталамуса.
В процессе работы было установлено, что люлиберин-разру-шающие ферменты из сердца, печени и гипоталамуса крысы обладают одинаковой субстратной специфичностью и близкими значениями таких биохимических параметров как молекулярная масса, оптимум рН, чувствительность к ингибиторам и др. Для люлиберин-разрушающего фермента из сердца показана аллостерическая регуляция ионами Са , что свидетельствует о функциональной роли фермента в регуляции уровня люлиберина и других пептидов в этом органе.
Роль гипоталамуса и люлиберина в гипотала,-мо-гипофизарной системе
Гипоталамусу отводится важная роль в регуляции репродуктивной функции на уровне контроля секреции гонадотропних гормонов передней доли гипофиза. Одним из первых указаний на участие гипоталамуса в этом процессе является работа Мак-Кана с сотр. /169/, в которой было показано, что в опытах in VITRO экстракты гипоталамуса крысы способны стимулировать выброс лютеинизируто-щего гормона (ЛГ) из гипофиза. Несколько позже выяснилось, что ги-поталамический экстракт, действуя непосредственно на гипофиз, вызывает секрецию не только ЛГ, но и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) /151,219/. Обработка экстрактов протеолитическими фе;р-ментами приводила к потере биологической активности, что наводило на мысль о белковой или пептидной природе ЛГ- и ФСГ-стимули-рующих факторов /218/.
В начале 70-х годов две группы исследователей под руководством А.Шелли и Р.Гуилмина опубликовали результаты многолетних исследований по выделению и определению структуры гипофизотроп ных факторов, стимулирующих секрецию ЛГ и ФСГ, из гипоталамуса свиньи /34,41/ и овцы /56/. Оказалось, что гипофизотропные факторы свиньи и овцы являются декапептидами с модифицированными терминальными аминокислотами и имеют идентичную первичную структуру: pGlu-HisRp- SeR-lyR- Gly-Leu- Аяд-Ряо- Gly-NH . Так как в процессе очистки ни разу не удалось разделить ЛГ- и ФСГ- стимулирующие активности, а выделенный и синтезированный химическим путем пептид одинаково хорошо стимулировал секрецию как ЛГ, так и ФСГ, был сделан вывод, что контроль секреции двух гонадотропинов осуществляется одним и тем же фактором, получившим название люлиберин /216,217/. Для отражения универсальности действия гормона иногда употребляется название гонадотропин-ри-лизинг гормон (гонадолиберин).
Для млекопитающих люлиберин не видоспецифичен, поскольку одинаково хорошо стимулирует выброс ЛГ и овуляцию у человека, крыс, кроликов, мышей, хомяков и т.д. /215/. Фактор, сходный с люлиберином по физиологическим свойствам обнаружен также у птиц, амфибий, рептилий и рыб /32,45,73,129/. С применением ЖХВД, из гипоталамуса цыпленка удалось выделить пептид, сходный с люлиберином млекопитающих по целому ряду показателей и являющийся его структурным аналогом - Gin - люлиберином /123,130,131/. Структуры других люлиберин-подобных соединений пока не установлены.
Полная цепь событий, приводящая непосредственно к секреции ЛГ и ФСГ, достаточно сложна и полностью не изучена. Известно, что первшл этапом взаимодействия люлиберина и гипофиза является связывание гормона со специфическими рецепторами на поверхности тапофизарных клеток /17/. Установлено, что плазматические мембраны гипофиза содержат два типа мест связывания ліолиберина /62, 164, .240/. Первый тип имеет низкую связывающую способность, но высокое сродство к пептиду (IL... комплекса гормон-рецептор ІО ІУ1) . Для другого типа рецепторов характерна высокая связываю-щая способность при низком сродстве (К—., =10 - 10 М). Дру-гими словами, первый тип рецепторов является более специфичным для ліолиберина. Предполагается, что взаимодействие люлиберина с этим типом рецепторов инициирует запуск процессов, приводящих к секреции гонадотропинов. Следствием взаимодействия гормона и рецептора может быть активация аденилатциклазы, приводящая к повышению внутриклеточной концентрации 3:5 - АМФ - универсального посредника в передаче гормональных сигналов /243/. Действительно, имеются данные, что уровень 3:5 - АМФ в изолированных клетках гипофиза возрастает при инкубации с люлиберином /26,181/. Добавление в среду инкубации циклогексимида препятствует накоплению з :5 - АМФ, что свидетельствует об участии в этом процессе механизмов белкового синтеза /246/. Оказалось также, что в опытах //? VITBO 3:5 - АМФ непосредственно стимулирует секрецию ЛГ и ФСГ /154,179/. Ответ гипофизарных клеток на действие люлиберина происходит в два этапа: в течение первых двух часов концентрация 3:5 - АМФ не изменяется, а затем - резко увеличивается / 246/. С этими результатам! хорошо согласуются данные Коннинга с соавт. /141/, о том, что секреция ЛГ под действием люлиберина носит стадийный характер. На первой стации отмечается низкий уровень секреции ЛГ, который значительно увеличивается через два часа. Характерно, что максжіальнни выброс ЛГ совпадает по времени с увеличением концентрации 3:5 - АМФ. Первая фаза секреции блокируется этиленгликоль- тетраацетатом (ЭГТА), а вторая - ингибиторами белкового синтеза. Так как ЭГТА является специфическим комплексообразователем для 2+ ионов Са , предполагается, что кальций играет важную роль на начальных этапах передачи гормонального сигнала ЛГ-ЕГ. Действительно, под действием люлиберина изменяется проницаемость ионных каналов гипофизарных мембран /63/, приводящая к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са /264/. Механизм изменения проницаемости ионных каналов для Са в ответ на гормональный сигнал не изучен. Предполагается, что это сопряжено с фосфорилированием одного из мембранных фосфолипидов - фосфатидилинозитина /262/. В опытах in VITRO удалось показать, что при совместной инкубации люлиберина и г РJ ортофосфата с клетками гипофиза наблюдается включение метки в фосфатидилинозитин, но не в другие фосфолипиды /237/. Повышающаяся в результате это-го внутриклеточная концентрация ионов Са может служить сигналом для запуска ряда процессов, итогом которых является секреция гонадотропинов. Не исключено, что эффект Са опосредован через специфический кальций-связывающий белок - калмодулин. Конн с со-авт. /64/ показали, что пимозид - соединение, инактивирующее комплекс Са -калмодулин - ингибирует высвобождение Ж1 в культуре клеток гипофиза. Так как пимозид не изменяет ни емкость, ни количество гипофизарных рецепторов люлиберина, авторы предположили, что калмодулин является возможным интермедиатом в реализации действия ионов Са на секрецию ЛГ.
Биосинтез и деградация люлиберина в гипо таламусе
Содержание люлиберина в гипоталамусе зависит от соотношении скоростей нескольких процессов, в том числе, от скоростей его биосинтеза и деградации. Предполагается, что люлиберин синтезируется непосредственно в гипоталамусе. На это указывает не только его высокая концентрация в этом органе, но и включение меченых аминокислот в молекулу пептида как при их инкубации с изолированными гипоталамусами /118/, так и при внутрижелудочко-вом введении /139,144/. Для определения места биосинтеза люлиберина, Краузе с сотр. /144/ использовали [%j/.et/ и [_ HJ р#о введенные непосредственно в вентромедиальную преоптическую область с последующим количественным выделением меченого люлиберина из различных зон гипоталамуса с помощью ЖХВД. Обнаружено, что наивысшая интенсивность биосинтеза (по включению метки) наблюдается в СВ и медиобазальном гипоталамусе.
Что касается механизма биосинтеза люлиберина, то этот вопрос изучен далеко не полностью. Вообще, синтез низкомолекулярных пептидов может осуществляться по двум путям. Первый путь, по которому предполагается, например, образование тиролиберина заключается в нерибосомальном синтезе с участием АТФ-зависиглых ферментов, действие которых направлено на образование пептидных связей с последующей циклизацией остатка глютаминовой кислоты и аудированием пролина /25/. Предполагается участие таких ферментов и в синтезе люлиберина /25/.
Для люлиберина не исключается и другой путь биосинтеза -из высокомолекулярных предшественников, посттрансляционный про-цессинг которых ведет к образованию биологически активной молекулы, причем, предшественники синтезируются обычным рибосомаль-ным путем. На возможность такого пути биосинтеза люлиберина указывает ряд фактов. Во-первых, включение меченых аминокислот в молекулу люлиберина блокируется ингибиторами белкового синтеза /139/. Во-вторых, обнаружены различные по молекулярной массе соединения, обладающие сходными с люлиберином иммунологическими свойствами /129/. Из гипоталамуса крысы выделен пептид с молекулярной массой 28000, который, по всей вероятности, является про-гормоном люлиберина /68/. Предполагается, что предшественники люлиберина представляют собой олигопептиды с общей формулой пеп-тид-Х- Grly -люлиберин, где X - спаренные остатки аргинина и лизина /77,147/. Миллар с соавт. /172/ обнаружили, что при хроматографии экстрактов гипоталамуса на колонке с Сефадексом G- -25 разделяются три соединения, одинаковые по иммунологическим свойствам, но отличающиеся по хроматографической подвижности. Трип-тический гидролиз самого высокомолекулярного соединения приводил к увеличению тотальной иммунореактивности и появлению на хроматограмме более низкомолекулярного продукта. В свою очередь, триптическая обработка нового соединения вызывала появление некоторого количества иммунореактивного материала, эдкжрующегося в области элюции люлиберина. Эти результаты могут служить указанием на возможность биосинтеза люлиберина из высокомолекулярных предшественников, однако, однозначного мнения о способе биосинтеза люлиберина in vivo пока нет.
Одним из основных факторов, регулирующих уровень люлиберина в гипоталамусе, являются протеолитические ферменты. Практически сразу после открытия люлиберина и других гипоталамических рилизинг-гормонов, ряд авторов показали, что в цитозольной фракции гипоталамуса, гипофиза и некоторых других областей мозга содержатся ферменты, разрушающие люлиберин /92,94,97,137,138,162, 163/. Предполагается, что эти ферменты вовлечены в систему регуляции функциональной цепи гипоталамус - гипофиз - гонады как на уровне гипоталамуса (регуляция содержания люлиберина),так и на уровне гипофиза (удаление избыточного количества гормона).
Люлиберин-разрушающая активность локализована в основном в цитозольной фракции. Паркер с сотр. /194/ при изучении деградации люлиберина т VITHO субклеточными фракциями гипоталамуса крысы показали, что эндогенный пептид, локализованный в синап-тосомах, устойчив к энзиматическои деградации только при условии интактности синаптосомальной мембраны. С другой стороны, экзогенный люлиберин не гидролизуется интактными синаптооома м и мі-тохондриями, но быстро разрушается после лизиса синаптосом. На основании этих данных, авторы делают заключение, что люлиберин- разрушающие ферменты являются быстро солюбилизирующимися компонентами нейронов (а возможно, не только нейронов) и функция их в данном случае аналогична функции ферментов, разрушающих тра-диционные нейромедиаторы.
Ферментативная активность цитозоля очень высока. Так, при инкубации одного гипоталамуса с экзогенным люлиберином в течение 5 глин при 37С разрушается более 80% пептида /138/. Высокой про-теолитической активностью обладают также гипофиз, кора, гомогенати целого мозга /97,137,163/.
Изучение биохимических свойств лкишберин-разрушающих пеп-тидаз проводилось, в основном, с использованием грубых гипотала-мических, гипофизарных и мозговых экстрактов, что в первую очередь связано с трудностью выделения чистых ферментов из-за их высокой лабильности /155/. Однако, даже использование грубых экстрактов дало возможность получить ценную информацию о свойствах этих ферментов.
До недавнего времени свойства и природа люлиберин-разру-шающих ферментов оставались во многом неясными. Правда, еще в начале 70-х годов в мозге были .обнаружены ферменты, нативным субстратом которых являлись мозговые олигопептиды /242/. Общим свойством этих пептидаз оказалась способность к расщеплению синтетических производных п-нитроанилидов и 2-нафтиламидов L-аминокислот. Эти ферменты были классифицированы как "ариламида-зы". Предположив участие ариламидаз в деградации люлиберина, некоторые авторы использовали производные L-аминокислот в качестве субстратов ариламидаз, что давало возможность определять ферментативную активность в грубых экстрактах без предварительной очистки. Кул и Тауберт /149/ показали, что ариламидазы гипоталамуса являются нейтральными пептидазами с оптимумом рН в области 7.0 - 7.4 . ЭДТА практически полностью ингибирует фермент (или ферменты), а добавление двухвалентных катионов не только восстанавливает ферментативную активность, но в некоторых случаях вызывает ее увеличение. Показана татке инш тивация фермента п-хлор-меркурибензоатом и пуромищшом. При использовании в качестве субстрата Ь-Су& -нафтиламида ферменты активируются 2-меркаптоэтанолом. Деградация Ь-Cys -нафтиламида ингибировалась люлибе-рином с РСТ= 4.8ХЮ Mt что косвенно свидетельствует о возможности участия ариламидаз в деградации этого пептида.
Применение синтетических субстратов ариламидаз значительно облегчало изучение этих ферментов из-за относительной простоты определения ферментативной активности: используемые производные L -аминокислот являются окрашенными продуктами, что позволяло контролировать их деградацию спектрофотометрическими методами. Однако этот метод не мог дать ответы на некоторые принципиальные вопросы. Во-первых, было практически невозможно доказать, что именно ариламидазы принимают участие в деградации люлиберина in vivo . Данеє полученное авторами относительно низкое для про-теолитических ферментов значение Kj ариламидазной активности экзогенным люлиберином не дает оснований для такого заключения. Во-вторых, применяя этот метод нельзя определить продукты деградации нативного субстрата - люлиберина.
Получение экстрактов висцеральных органов и подготовка образцов к анализу
Для сравнения хроматографической подвижности иммунореактивного люлиберина сердца, печени, почек, а также синтетического люлиберина, экстракты указанных органов или синтетический люли бєрин хроматографировали на колонке с Сефадексом G- -25. для этого тлетанольные экстракты органов или синтетический люлиберин растворяли в ІМ уксусной кислоте и наносшш на колонку размером 1.2х 30 см с Сефадексом G--25, уравновешенную ІМ уксусной кислотой. Элюцию проводили этим же раствором со скоростью 7.5 мл/час. Объем фракций составлял I мл. В каждой фракции определяли оптическую плотность при 280 шл и содержание ліолиберина радиоиммунологическим методом.
При определении общего содержания люлиберина в пике после хроматографии оказалось, что потери гормона при этом составляют примерно 50$. В опытах использовали самок белых крыс линии Вистар массой 120-150 г. Для получения фракций, содержащих пептидазы, гипоталамус, сердце, печень и форменные элементы крови гомогенизировали в гомогенизаторе V/fZT/S -45 дважды по 2 мин при 40000 об/мин в 50 мМ Трис-HGI, рН=8.0 при 0С. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 5000 о и 60 мин при 105000 о (центрифуга Spmco L5-50). Полученные супернатанты использовали в качестве источника пеп-тидаз. Концентрация белка в гомогенатах, определенная по методу Лоури /156/, составляла 2-3 мг/мл. Для изучения влияния ионов металлов на активность ферментов, при получении гомогената использовали 50 мМ Трис-HCI, рН=8.0, содержащий 5 ммолей ЭДТА и 1.0 ммоль ЭГТА. Для определения пептидазной активности гомогенати инкубировали 30 мин при 37С с [_I25lJ люлиберином (30000-40000 имп/мин/ проба) в 50 мМ Трис-НС1 - 0.05% БСА, рН=8.0 _ Конечный объем пробы составлял 150 мкл. Реакцию останавливали кипячением в течение 2 мин или добавлением 300 мкл 70% метанола. Для определения степени деградации [j IJ люлиберина, продукты деградации отделяли от непрореагировавшего пептида с помощью специфической антисыворотки к люлиберину (метод I) или с использованием хроматографии в тонком слое ионообменника (метод 2). Метод I. После кипячения к пробам добавляли 200 мкл РИА-буфера, центрифугировали и к полученному супернатанту (200 мкл) добавляли 100 мкл антисыворотки к люлиберину в разведении 1/200. В специальных экспериментах показано, что этого количества антисыворотки достаточно для полного связывания иммунокомпетентного гормона (степень иммунокомпетентности [_- IJ люлиберина составляла 95% и снижалась до 70% при хранении меченого пептида в течение 2 мес). Одновременно с антисывороткой к пробам добавляли 100 мкл антисыворотки барана к ]-глобулину кролика (разведение 1/4) и 100 мкл нейтральной сыворотки кролика (разведение 1/60). Дальнейшую инкубацию и обработку проб проводили также, как и при РИА люлиберина (см. раздел 1.6. МАТЕРИАЛОВ И МЕТОДОВ). При расчетах учитывали, что процент связывания (степень иммунокомпетентности) пропорциональны количеству [- Ij люлиберина, не деградированному пептидазами. Метод 2. После добавления метанола, пробы центрифугировав, отбира .х 300 мкл супернатанта и высушивали под вакуумом. Остаток растворяли в 25 мкл 70% водного метанола и хроматогра-фировали на катионообменыой пластинке С-50 ( PIXION ) длиной 12 см в 200 мЫ ацетате аммония, pll=6.6 . После хроматографии пластинку разрезали на полоски длиной I см и определяли радиоактивность каждой полоски. Типичная картина распределения продуктов деградации представлена на рис.5. В ряде случаев продукты деградации разделяли на колонке с Сефадексом -25 (колонка размером 1.2x30 см, элюция 50 мМ Трис-HCI, рН=8.0 со скоростью 7.5 мл/час, объем фракций I мл) и определяли радиоактивность в каждой фракции (рис.6). При определении степени деградации г IJ люлиберина радиоиммунологическим и хроматографическими методами получаемые результаты количественно совпадают (рис.7). Во всех случаях ферментативную активность выражали как процент _ IJ люлиберина, расщепленного за 30 мин инкубации. Деградация [_- І] люлиберина гомогенатами гипоталамуса, сердца, печени и форменных элементов крови сопровождается появлением только одного радиоактивного продукта, отличающегося от меченого пептида по подвижности при тонкослойной хроматографии и гельфильтрации (рис. 5 и 6). Как видно из рисунков, меченый пептид остается на старте (или элюируется со свободным объемом) , а радиоактивный продукт деградации тлеет ,=0.5 . При увеличении времени инкубации меченого люлиберина с гомогенатом наблюдалось появление третьего пика радиоактивности с у - =1.0 (данные не приведены), что связано, очевидно, с дальнейшей деградацией образующихся соединений. Количество гомогената в пробе и время инкубации при определешш ферментативной активности подбирали таким образом, чтобы деградация [j IJ люлиберина была ограничена образованием только одного радиоактивного продукта.
Ферментативная инактивация люлиберина в висцеральных органах крысы
Во-вторых, использование в качестве экспериментальных животных самок крыс приводит к дополнительным элементам неопределенности, поскольку фаза полового цикла прямо связана с уровнем гипоталамического люлиберина и нельзя исключать, что распределение люлиберина может различаться в различные фазы цикла.
В-третьих, авторы использовали небольшое число экспериментальных животных (от 5 до 9), что снижает статистическую достоверность получаемых данных.
С учетом изложенных фактов, следует признать, что полученные в указанных работах результаты, не могут объективно отражать вопрос о распределении люлиберина между левыми и правыми полови-нами гипоталамуса. Действительно, в работе Мизунумы с соавт. /173/ показано симметричное распределение люлиберина в гипоталамусе. Герендаи с соавт. /83,84/ хотя и наблюдали повышенное содержание люлиберина в правой половине гипоталамуса, но в одной из работ /84/ приведены статистически недостоверные данные. Таким образом, ответ на вопрос о латерализации люлиберина в гипоталамусе до сих пор не получен.
В нашей работе перед разделением гипоталамуса срединное возвышение было удалено, а качество удаления проверено микроскопически (рис.4). После удаления срединного возвышения разделение гипоталамуса значительно облегчается, поскольку после такой операции открывается полость третьего желудочка, которая является естественной полостью, разделяющей гипоталамус на две половины. В полученных таким образом фрагментах гипоталамуса основная часть люлиберина локализована в аркуатных ядрах, которые при использованной методике остаются интактными. Использование нами самцов крыс позволило исключить влияние фазы полового цикла на уровень гипоталамического люлиберина, а относительно большое число животных в каждом экспершленте значительно повысили статистическую достоверность результатов.
Таким образом, в настоящей работе впервые достоверно показано, что люлиберин асимметрично распределен между левыми и правыми половинами гипоталамуса самцов крыс линии Вистар. Тот факт, что односторонняя кастрация приводит к неодинаковым изменениям уровня пептида в половинах гипоталамуса, контралатераль-ных удаленному органу, позволяет предполагать не только участие люлиберина в экстрагипофизарных нейральных связах между гонадами и гипоталамусом, но и асимметрию нейральных механизмов контроля функций левого и правого тестикулов.
Вопрос о функциональной асимметрии головного мозга давно привлекает внимание физиологов, морфологов и психологов. Однако, поиск биохимических основ этого феномена начался только в последние десятилетия. Первые указания на химическую асимметрию центральной нервной системы были получены при изучении полосатого тела (стриатума) - высшего подкоркового центра экстрапирамидной двигательной активности. С применением поведенческих тестов (ротационная модель, поведение в Т-образном лабиринте) установлено, что одностороннее повреждение нигроетриарных структур, вызывающее снижение концентрации дофамина (ДА) в зоне повреждения /142,250-253/, приводит к стимуляции амфетамин-стимулированного вращения животных в сторону, ипсилатеральную повреждению /89,90, 222/. Однако, Джерусси и Глик /II5-II7/ показали, что одностороннее вращение характерно и для интактных животных, в связи с чем, высказали предположение о существовании естественного дисбаланса ДА интактных крыс. Это предположение получило прямое подтверждение в работе Глика с сотр. /8/. После выявления преимущественного направления вращения животных, авторы определяли уровень ДА в левой и правой половинах стриатума. Оказалось, что содержание
ДА было выше в половине стриатума, контралатеральной направлению вращения. Сходные результаты получены и при изучении поведения животных в Т-образном лабиринте с определением стороны предпочтения /268/. Содержание ДА в этом случае также было выше в половине стриатума, контралатеральной стороне предпочтения.
функциональное значение асимметричного распределения ДА в нигростриарных структурах остается неясным. Имеются данные, что в ночное время у крыс наблюдается спонтанное вращение, причем, его направление коррелирует с направлением амфетамин-ин-дуцированного вращения в дневное время /87/. Этот факт может свидетельствовать о различной степени ассиметрии ДА в течение суток, то есть о зависимости подобной асимметрии от физиологического состояния организма. Брасс и Глик /52/ обнаружили, что интенсивность индуцированного вращения зависит от линии и пола экспериментальных животных. Так, самки крыс линии Спрег-Доули и Фишер обладают более интенсивным амфетамин-индуцированным вращением, чем самцы. У крыс линии Спрег-Доули самцы более чувствительны к апоморфину, а самцы и самки крыс линии Фишер одинаково чувствительны к этому соединению. Бекер с сотр. /50/ показали, что амфеташн-индуцированное вращение самок крыс линии Хольцман зависит от стадии полового цикла и максимально во время эструса. Существуют и некоторые другие корреляции между асимметрией ДА и физиологическими показателями. Так, направление кругового движения прямо связано с асимметрией разряда типа "волна-пик" в симметричных структурах зрительной коры крыс /177, 178/. Наконец, изменение баланса ДА в нигростриарных образованиях может быть причиной патологических состояний, например, паркинсонизма /106/. Однако, исследования в этой области находятся в стадии накопления фактов и полной картины явлений, связанных с асимметричным распределением ДА в мозговых структурах пока нет. Известно, что при участии ДА осуществляется центральная регуляция уровня гипоталамического ЛГ-ЕГ в зависимости от физиологического состояния животного, условий внешней среды и т.д. Не исключено, что асимметричное функционирование ДА-ергической системы характерно не только для ттгростриарных структур, но и для гипоталамуса. В этом случае асимметрия гипоталамического люлиберина может быть связана с асимметрией катехоламинергичес-кой системы регуляции уровня люлиберина в левых и правых половинах гипоталамуса. Конечно, это только предположение, однако, наши данные дают основание для целенаправленных исследований в этом направлении.
