Содержание к диссертации
Введение
Г л а в а I. Обзор литературы 9
1. Армназа, биологическое распространение и физико-химические свойства 9
2. Изоферменты аргиназы различных организмов и их физико-химические свойства 17
а) Изоферменты 17
б) Влияние некоторых активаторов и эффекторов на аргиназу 31
3. Обмен пролина в сравнительном аспекте 39
а) Биосинтез пролина из глутамата 40
б) Биосинтез пролина из орнитина 46
в) Биосинтез пролина из аргинина 50
Г л а в а II. Объект и методы исследований 53
Г л а в а III. Результаты исследований . 56
1. Аргиназа различных органов эмбриона, новорожденных, нормальных (контрольных), беременных и лактирующих крыс 56
2. Внутри локализация аргиназы в различных органах крыс 61
3. Ингибирование аминокислотагли аргиназной активности гомогенатов различных органов эмбриона, новорожденных, беременных и лактирующих крыс 65
4. Изоэнзимный спектр аргиназы молочной железы нормальных (контрольных), беременных и лактирующих крыс 72
5. Кинетические свойства (Кіп ,кі ) изоэнзимов аргиназы молочной железы нормальных (контрольных) , беременных и лактирующих крыс 77
6. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность изоэнзимов аргиназы молочной железы крыс 92
7. Влияние на активность изоэнзимов аргиназы молочной железы крыс 96
1. Биосинтез пролйяа в различных органах эмбриона, новорожденных, нормальных (контрольных), беременных и лактирующих крыс 98
2. Изоэнзимный спектр ферментов биосинтеза проли-на молочной железы нормальных (контрольных) и лактирующих крыс 106
3. Влияние некоторых эффекторов на процессы биосинтеза пролина в молочной железе лактирующих крыс 108
Заключение 111
Выводы 120
Литература 124
- Армназа, биологическое распространение и физико-химические свойства
- Биосинтез пролина из глутамата
- Внутри локализация аргиназы в различных органах крыс
- Влияние ионов двухвалентных металлов на активность изоэнзимов аргиназы молочной железы крыс
Введение к работе
Актуальность и обоснование темы. Актуальной проблемой современной биохимии является выяснение механизмов регуляции обмена веществ.
Овладение способами целенаправленной регуляции метаболизма клеток является необходимым условием в осуществлении научно обоснованных разработок прикладного значения.
В настоящее время является доказанным существенное значение изоферментов в механизмах регуляции обменных процессов. Физико-химические и кинетические свойства изофермента определяются его метаболической ролью. В последние годы широко обсуждаются вопросы метаболической роли сравнительно недавно открытых неуреотели-ческих изоэнзимов аргиназы. Установлено, что помимо уреотеличе-ской аргиназы, присутствующей лишь у уреотелических организмов и участвутсяцеи в механизме нейтрализации аммиака путем его вклкяения в биосинтез мочевины, существуют в природе также и неуреотеличе-ские изоферменты аргиназы с широким биологическим распространением, имеющие самостоятельные метаболические функции вне механизмов нейтрализации аммиака (Давтян, 1968; Давтян и др., 1968-1983).
В силу, главным образом, узкого охвата в исследованиях эво-люционно отдаленных организмов в настоящее время пока не установлены физико-химические критерии, определяющие характер (уреотели-ческий или неуреотелический) изоэнзимов аргиназы (Mora et ai. , І965(аЙ966; Исаченков, 1967; Давтян и др., 1967-1970). Недостаточны сведения и относительно метаболической роли неуреотеличе-ской аргиназы. Допускается, что фермент может лимитировать содержание в тканях ряда биологически активных соединений (цитрул-лин, аргинино-янтарная кислота, гуанидиновые соединения, фосфа-гены), а также контролировать биосинтез аргининбогатых фракций
~ 5 -
гистонов (Давтян, 1968). Имеются данные относительно возможно-сти функционирования неуреотелической аргиназы в ферментативных системах биосинтеза пролина, глутамата и полиаминов из аргинина. Наиболее убедительными являются данные, указывающие на существование в ряде организмов ( Neuraspora crassa % аэробные инфузории, дождевой червь, насекомые, молочная железа мышей и крыс) коррелятивной связи между активностью аргиназы и процессом биосинтеза пролина (Kesava Rao et al. , 1973; Агаджанян и Арутюнян, 1979; Vogel, Корас , 1959; Заробян И др., I976;Reddy, Campbell, 1969; Давтян, 1974; Давтян и др., 1976;pant, Kumar , 1978; Гас-спарян, 1982), В частности установлено, что при лактации в молочной железе мышей и крыс одновременно резко активируются аргиназа и ферменты биосинтеза пролина из орнитина с целью, очевидно, покрытия повышенных потребностей организма в пролине, главным образом, для биосинтеза белков молока (мерпат, Linzell, 1967; lip, Knox , 1972; Me zl, Knox , 1977). В самом деле, лак-тирующая молочная железа получает больше аргинина и меньше пролина из крови, чем имеется в молоке (Mepham, Linzell , 1966). Очевидно, повышение потребности в пролине является существенным в механизме индукции аргиназы также в бородавках (van Scott , 1951), папилломах (umana et al , 1962; Eogers , 1959),при заживлении термических ран (Еао et al. , 1980), регенерации дождевого червя (Давтян и др., 1982). Известно, что у насекомых пролин является основным энергетическим субстратом для осуществления летательных функций (sacktor, Childress , 1967). В соответствии с этим на стадии бабочек, а также на этапах интенсивного включения пролина в биосинтез белков у насекомых наблюдается резкое активирование аргиназы (веййу, Campbell , 1969; Ага-джанян, давтян, 1974; Давтян и др., 1976; Pant, Kumar , 1978).
Приведенные примеры хотя и являются убедительными, тем не менее нужны прямые доказательства. С этой точки зрения заслуживают внимания данные о неконкурентном ингибировании аргиназы опухоли молочной железы мышей ( Kesava Rao et al. , 1973), аэробных инфузорий (Заробян и др., 1976) и дождевого червя (Гасспа-рян, 1982) пролином, а также репрессии аргиназы аэробных инфузорий (Заробян, 1976) и индукции орнитинтрансаминазы (первого фер-мента пути биосинтеза пролина из орнитина) Saccharomyces cere visiae (Middelhoven , 1969) аргинином.
He вызывает сомнения, что в различные периоды индивидуального развития и при различных физиологических состояниях организма меняется потребность в пролине. В частности известно, что в срезах коркового слоя почек эмбриона пролин включается в протеин в 10 раз быстрее, чем у взрослых организмов (Baeriocher et al, 1972). При беременности в органах крыс соотношение активностей пролиноксидазы и П5К-редуктазы ( второго фермента пути биосинтеза пролина из орнитина) значительно меняется в пользу последнего (Kowalof f 1976). Можно полагать, что соответственно в тканях меняется и активность неуреотелической аргиназы, функционирующей в сторону биосинтеза пролина из аргинина. Следовательно, является оправданным и обоснованным изучение изо-ферментов аргиназы и ферментов биосинтеза пролина из орнитина в течение онтогенеза и при различных физиологических состояниях (беременность, лактация) крыс.
Предпринятые исследования имеют также и определенное прикладное значение для понимания и целенаправленного регулирования процессов роста и регенерации органов и тканей. В связи с этим заслуживает внимания более интенсивный биосинтез пролина и утилизация аргинина в гепатомах Морриса по сравнению с тканями хозяина (Peraino, Pitot , 1962) или многократное увеличение
активности ферментов биосинтеза пролина из орнитина в лимфоцитах при стимулировании роста последних фитогемм-агглютинином (vaiie et ai. , 1975).
Некоторые авторы полагают, что ингибирование аргиназы про-лином может играть важную роль в регулировании роста опухолей по принципу обратной связи (Kesava Rao et al., 1973),
Цель работы» Целью настоящей работы является сравнительное изучение аргиназы и ферментативного процесса биосинтеза пролина из орнитина в различных органах крыс в течение онтогенетического развития и при различных физиологических состояниях (беременность, лактация) крыс. Конкретно изучали следующие вопросы;
Исследование изменения активности, внутриклеточной локализации и физико-химических свойств (влияние аминокислот, ионов двухвалентных металлов)аргиназы в различных органах в течение онтогенетического развития, а также при беременности и лактации.
Исследование изменения активности ферментов биосинтеза пролина (орнитинтрансаминазы и П5К-редуктазы) в различных органах в течение онтогенетического развития, а также при беременности и лактации.
Исследование изоэнзимного спектра и некоторых регулятор-ных свойств (Km, Ki, влияние эффекторов) ферментов биосинтеза пролина (ОТА и П5К-редуктазы) в молочной железе зрелых, беременных и лактирующих крыс.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые выявлены закономерности динамики активностей аргиназы и ферментов биосинтеза пролина (ОТА и П5К-редуктазы) в различных органах крыс в течение индивидуального развития и при различных физиологических состояниях (беременность, лактация).Наиболее выражена корреляция между активностью аргиназы и процесса биосинтеза пролина в молочной железе в период лактации, когда указанные процессы подвергаются многократному активированию. Впервые определены осо-
" о —
бенности аргиназ различных органов по характеру и степени ингиби-рования различными аминокислотами.Б частности, для аргияазной активности почек и молочной железы является характерным ингибирова-ние пролином и d - ашноизомасляной кислотой. Доказано, что в органах с интенсивным процессом биосинтеза пролина (почки,мозг, мо-лочная железа) аргиназа эффективнее ингибируется пролином.Впервые изучен изоэнзимный спектр аргиназы и ферментов биосинтеза пролина в молочной железе .Установлено, что у контрольных животных в молочной железе содержится I высокомолекулярный изоэнзим аргиназы, а у лактиругощих - 3 различающихся по заряду высокомолекулярных и I. -низкомолекулярный изоэнзим. Выявлен ряд физико-химических свойств ( Km , кі , влияние двухвалентных металлов, ЇЇЖБ) изоэнзимов, ере-ди которых наиболее существенным является неконкурентное ингибиро-вание одного из изоферментов аргиназы пролином. Не вызывает сомнения, что один или несколько из обнаруженных в молочной железе крыс изоэнзимов функционируют в системе биосинтеза пролина. Установлено, что у контрольных и лактирующих крыс в молочной железе содержится один изоэнзим ОТА и два изоэнзима П5К-редуктазы, обладающих широкими регуляторными возможностями (НАД, Ада, пируват и і -ами-новалериановая кислота ингибируют, а АН и гидроксиламин активируют).
Результаты данной работы, очевидно, помогут при разработке способов целенаправленного регулирования процессов роста, пролиферации и регенерации органов и тканей,сопровождающихся интенсивным потреблением пролина (заживление ран, регенерация поврежденных органов, подавление роста папиллом, новообразований и др.).
Апробация работы. Материалы диссертации в виде отчетов ежегодно обсуждались на Ученом совете биологического факультета Ереванского государственного университета (1976-1983 г.г.).Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Эволюци-
онная биохимия и происхождение жизни", Ереван, 1978 г, и на Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград, 1979 г.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающей 255 наименований, из них отечественных 60.
Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц и 33 рисунка.
В обзоре литературы подробно изложены данные литературы о распространении аргиназы, изоэнзимном спектре, а также регуляторних свойствах фермента у различных организмов. Подробно излагаются вопросы биосинтеза и метаболизма пролина в сравнительном аспекте.
Армназа, биологическое распространение и физико-химические свойства
Аргиназная активность была открыта в 1904 г. в печеня млекопитающих ( Kossei, Daktn,I904, 1904а). Впоследствии было показано, что при перфузии изолированной печени физиологическим раствором, содержащим аргинин, последний расщепляется на мочевину и орнйтин (Edlbacher, Bohem, 1925). В 1932 г, после открытия орнитинового цикла мочевинообразования была установлена роль аргиназы в этом процессе (Krebs, Henseleit, 1932). В ранних классических сравнительно-биохимических исследованиях наличие аргиназы рассматривалось как абсолютный признак уреоте-лизма, так как фермент был обнаружен в печени уреотелических организмов. При этом было обнаружено существование корреляции между синтезом мочевины и активностью аргиназы (element! , 1914). Действительно, в печени уреотелических животных обнаруживается аргиназа с высокой активностью.
Однако, благодаря применению более современных методов исследования, в дальнейшем удалось показать, что аргиназа имеет очень широкое биологическое распространение и встречается не только в печени уреотелических животных, но и во многих тканях урикотелических и аммонотелйчеоких организмов, а также во вне-печеночных тканях уреотелических организмов, в которых не синтезируется мочевина. У уреотелических животных была выявлена выраженная аргиназная активность в почках, селезенке (Hunter , Dauphinnee, 1924; Edlbacher, Kothler, 1925), молочной железе (Folley, Greenbaum, 1945), коже (Greenstein et al. , 1941; Мардашов, Семин, 1948; Roberts, Frankel, 1949; Van Scott , 1951), сердечной мышце ( Menne et al., 1963), легочной ткани ( Lange, Kossmann, 1963), слизистой оболочке рубца крупного рогатого скота, а также в мозговой ткани как уреотелических (Sporn et al., 1959, 1959а; Katner et al.,1960; Davies et al.,. 1961; Давтян, 1968), так я многих неуреотелических животных (лягушка, курица, водяная и наземная черепахи) (paik et al., I960; Бунятян, Давтян, 1964, 1965; Buniatian, Davtian , 1966).
Показано, что в течение филогенетического развития в мозгу, в отличие от печени уреотелических животных, не наблюдается корреляции между аргиназной активностью и содержанием мочевины. Содержание мочевины высоко в мозгу новорожденных крыс и намного ниже у эмбриона и зрелой крысы. Активность же аргиназы очень высока в мозгу эмбриона, несколько падает у зрелой особи„ и еще ниже у новорожденных крыс (Давтян, 1967; Агаджанян, Арутюнян, 1979). По данным Бредли ( Bradley, 1973), удельная активность аргиназы печени мышей высока на 8-й день развития эмбриона, а на 12-й день она падает до минимума. Начиная с 12-го дня беременности, активность аргиназы снова постепенно возрастает, доходя до уровня взрослых мышей. Удельная активность фермента при этом увеличивается в 2000 раз.
Факты об отсутствии корреляции между активностью аргиназы и содержанием мочевины, а также наличие аргиназы в организмах и тканях, в которых отсутствует полный орнитиновый цикл, свидетельствуют о возможности самостоятельного существования аргиназы вне механизма обезвреживания аммиака.
Подобная закономерность установлена также другими авторами (Copalakrishna, Nagarajan, 1979). По их данным активность аргиназы в печени новорожденных крыс составляет 15$ от ее активности в печени взрослых особей. Активность аргиназы увеличивается в процессе развития крыс постепенно, активность орнитинтранскарбамилазы резко возрастает в первые пять дней развития, достигая 80$ от ее активности у взрослых крыс.
При исследований мозговой аргиназы крыс было выяснено, что хотя по оптимуму рН, специфичности к субстрату и активации ионами двухвалентных металлов она сходна с печеночной аргиназой крыс, существуют большие различия по ряду существенных свойств: молекулярный вес, аминокислотный состав и др. (Давтян, 1968).
Сравнение характеристик мозговой и печеночной аргиназ доказывает, что они коренным образом отличаются и отличия эти генетически детерминированы. На основании полученных данных сделан вывод,что мозговая аргиназа является самостоятельным индивидуальным ферментом, не имеющим ничего общего с эволюцией уреотеличе-ских организмов.
На основании вышеприведенных фактов и ряда собственных экспериментальных исследований, а также анализа многочисленных литературных данных, Бунятяном и Давтяном было выдвинуто и обосновано положение о существований в природе двух различных форм аргиназы: уреотелической, которая присутствует в печени лишь урео-телических животных и участвует в механизме нейтрализации аммиака, функционируя в орнитиновом цикле мочевинообразования, Й яе-уреотелической, которая не связана с механизмом нейтрализации аммиака и широко представлена почти во всех биологических объектах (Давтян, 1968, 1970; Бунятян, Давтян, 1970; Давтян и др., 1969, 1970).
С этого времени изо дня в день накапливается богатейший материал, позволяющий определить критерии, разграничивающие уреотелический и неуреотелический характер аргиназ и выяснить роль неуреотелической аргиназы в метаболизме клетки.
Допустимая самостоятельная метаболическая роль неуреотелической аргиназы предполагала присутствие этого фермента и у уреотелических организмов наряду с уреотелической аргиназой.
По мнению Давтяна я Бунятяна (1970) механизм формирования уреотелизма, очевидно, обусловлен интеграцией ферментов биосинтеза аргинина с индуцированной в условиях, необходимых для функционирования орнитинового цикла, уреотелической аргиназой, а не с существующей, очевидно, неуреотелической аргиназой.
Тамир и Ратнер ( Tamir, Eatner, 1963), обнаружив аргиназ-нуга активность в различных органах птиц, высказали мнение, что в подобных случаях, вероятно, аргиназа является остаточным, рудиментарным ферментом, имеющим уреотелический характер в прошлом и потерявшим свою роль на данном этапе. При этом авторы исходили из того, что аргиназы из различных объектов имеют близкие каталитические свойства, в частности, одинаковую субстратную специфичность, оптимум рН, активирование донами марганца.
Биосинтез пролина из глутамата
Первая реакция подобна описанной при синтезе глутамата и глутатиона. Конечный продукт этой реакции, пролин, ингийирует активность первого фермента. Реакция in vitro нуждается в присутствии имидазола.
Ингибиторами для реакции первого этапа у Е. coli служат также фруктозо-6-фосфат и АМФ ( Baich, 1970). Они проявляют неконкурентный тип ингибирования, а глутамат - конкурентный. Инги-бируется эта реакция (глутамилкиназа) сравнительно в меньшей степени глюкозо-6-фосфатом при его 0,01 М концентрации, а при более низкой концентрации ингибирования не происходит. Авторы предполагают, что пролинчувствительная глутамилкиназа кроме активного центра имеет еще два контрольных участка, один из которых связывается с глутаматом и АМФ, а другой - с пролином. Тем не менее, нелегко доказать место связи для фруктозо-6- осфата.
По мнению некоторых авторов ( Gamper, Moses, 1974) у Е. coll первый фермент является результатом агрегации двух белков, обладающих ферментативной активностью;.-На экстрактах ауксотрофных штаммов доказано наличие двух локусов, а именно, ПроА, ПроВ, ответственных за биосинтез этих двух ферментных белков. По их мнению, образуется промежуточное соединение - либо глута-милфосфат, либо глутамилэнзим. При разбавлении экстракта происходит диссоциация ферментного комплекса. Теми же авторами был получен в очищенном состоянии фермент, осуществляющий вторую реакцию - глутамилфосфатредуктаза. Этот фермент не ингибируется пролином. Пирролин-5-карбоксилатредуктаза, осуществляющая третью реакцию, не образует комплекса с остальными ферментами.
До вышеуказанных авторов Иошинага и др. ( Yoshinaga et al., 1967) сообщали о глутамилкиназной активности в экстрактах мутантов Brevibacterium flavum , сверхпродуцирующих пролин, и доказали, что активность этого фермента приводит к синтезу пролина. В этой же лабораторий ( Yoshinaga et al., 1975) хроматографиче-ски были выделены два пика киназной активности, один из которых участвует в глутаминсинтетазной реакции, другой, возможно, функционирует в сторону биосинтеза пролина. Однако выделить этот фермент авторам не удалось.
У диких штаммов p. aeruginosa выделена, частично очищена и охарактеризована ft -глутамилкиназа ( Krishna, Leisinger, 1979). Фермент очищен 85 раз, молекулярный вес его 84000. Фермент катализирует образование глутамилгидроксамата из глутамата и АТФ в присутствии ионов Mg или Mn . При этом происходит гидролиз АТФ с образованием АДФ и неорганического фосфата. Указанные катионы в концентрации 20 мМ ингибируют реакцию. Обнаружено, что ПХМБ и N-этилмалеимид в концентрации 0,125 мМ полностью ингибируют активность глутамилкиназы. Однако преинкуба-ция фермента с дитиотреитолом (0,25 мМ) частично снимает инги-бирующий эффект этих соединений. Показано, что пролин в концентрации 5 мМ ингибирует активность глутамилкиназы на 50%, а в концентраций ЗО мМ - практически полностью, причем, он является неконкурентным ингибитором фермента. A L -метионин-DL -сульоксимин ингибирует конкурентно.
Авторы установили также видовую специфичность по регуляции активности глутамилкиназы пролином. Так, штамм ауксотрофных по пролину мутантов P. aeruginosa РАо-879 лишен ft -глутамилкиназы, чувствительной к ингибироваяию пролином.
У S. cerevisiae ( Theuvenot, 1971) изучен путь биосинтеза пролина из глутамата. Глутамат у этих организмов превращается в глутамилфосфат, а последний - в ft -полуальдегид глутамино-вой кислоты. Для доказательства этого пути авторы получили мутанты, ауксотрофные по пролину, но не по глутамату. Анализ регуляции активности данного фермента у мутантов и у клеток дикого типа, а также различная кинетика его температурной денатурации позволили автору заключить, что, по-видимому, существуют два различных фермента, катализирующих фосфорилирование глутамата.
Подробно исследованы также свойства ft -глутамилфосфатре-дуктазы и А -пирролин-5-карбоксилатредуктазы - второго и третьего ферментов пути биосинтеза пролина у p. aeruginosa ( Krishna et ai., 1979). Второй фермент пути биосинтеза пролина, катализирующий образование полуальдегида глутаминовой кислоты и ft -гшутамилфосфата, способен использовать в качестве кофакторов НАДН и НАДФН. Он был очищен из бесклеточных экстрактов p. aeruginosa приблизительно 150 раз. Очищенный фермент способен катализировать обратную реакцию и восстанавливать НАД4" и НАДФ+, используя в качестве субстрата пирролин-5-карбоновую + кислоту. Km для НАД - 0,36 мМ. Пирролин-5-карбоксилатредукта за была очищена 56 раз. Она использует в качестве кофактора НАДН или НАДФН, причем, первый является лучшим субстратом, чем второй. Значение Km для этого фермента 0,12 мМ с НАДФН и 0,09 мМ с НАДН. 3-ацетилпиридйНовый аналог НАД при концентрации 2 мМ ингибирует активность пирролин-5-карбоксилатредуктазы на 95$, кроме этого, этот фермент ингябяруется тиоНАД(Ф), ионами тяжелых металлов и реагентами на тиоловые группы. Показано также, что при росте P. aeruginosa РА0 . на среде с пролином активность и глутамилкиназы,и глутамилфосфатредуктазы была значительно ниже, чем у клеток, выращенных на среде с глутаматом. Репрессивное действие пролина на синтез пирролин-5-карбоксилат-редуктазы не обнаружено.
Синтез пролина из глутамата в митохондриях, выделенных из падальной мухи Aldrichlna grahami , изучен Вадано (Wadano , 1980). Показано, что митохондрии катализируют биосинтез С -пролина из С1 -глутамата. Процесс зависит исключительно от наличия АТФ, Mg+fl НАДФН и значительно менее чувствителен к недостатку НАДН. Активность биосинтеза пролина из глутамата в микросомах и растворимой фракции очень невелика. Меченый глута-мат превращается в пролин также и у личинок дрозофилы ( Eapport et al., 1979). Превращение ингибируется высокой концентрацией гидроксипролина. Это согласуется с более ранними исследованиями автора, согласно которым гидроксипролин понижает пул пролина ( Eapport, Yang, 1976).
Внутри локализация аргиназы в различных органах крыс
При этом процент ингибированйя аргиназы печени и почек эмбриона L- орни-тином, L- лизином, L- пролином и d - АМК значительно выше по сравнению с новорожденными крысами, тогда как в мозге ингибирование L- орнитином я о - АМК, наоборот, выше у новорожденных крыс. У последних, по сравнению с беременными и лактирующими крысами, аргиназа почек ингибируется всеми испытанными аминокислотами слабее. У беременных крыс, по сравнению с лактирующими, наблюдается более высокая степень ингибированйя аргиназы молочной железы всеми испытанными аминокислотами.
Во всех органах эмбриона, новорожденных, беременных и лакирующих крыс сильное ингибирующее влияние на активность аргиназы оказывают орнитин и лизин. Примечательно, что фермент почек более чувствителен к ингйбированию пролином, чем фермент печени. По-видимому, аргиназа почек функционирует в сторону биосинтеза пролина. Эти данные находятся в соответствии с результатами последующих серий наших исследований, согласно которым биосинтез пролина в почках и мозге протекает интенсивнее, чем в печени, и поддерживают точку зрения о существовании неуреотелического изо-энзима аргиназы, функционирующего в системе биосинтеза пролина ( Eeddy, Campbell , 1969; Давтян, Агаджанян, 1974).
Интересно также ингибирующее влияние d - аминомасляной и d - аминойзомасляной кислот на аргиназную активность. Более интересным, на наш взгляд, является ингибирование аргиназы d- аминойзомасляной кислотой, так как эта аминокислота в метаболическом отношении инертна. Она почти не ингибирует аргиназу печени и, наоборот, в высокой степени тормозит активность фермента в мозге, почках и молочной железе. Если еще учесть результаты, полученные Аустиком на печени цыплят ( Austic , 1973) и данные нашей лаборатории,касающиеся личинок и жуков фасолевой зерновки, согласно которым указанная аминокислота ингибирует активность П5К-редуктазы, то ингибирующее влияние с - амийоизомасляной КИСЛОТЫ на аргиназу, действующую в направлении биосинтеза пролива, приобретает определенный смысл. S - аминовалериановая кислота не оказывает ингибирующего влияния на аргиназу ни в одном из изученных органов, между тем ингибирование аргиназы этой аминокислотой установлено Костиловым и Лейкок у анаэробных бактерий С. botullinum ( Costilow , Laycock , 1969) и работами нашей лаборатории в гомогенате жуков фасолевой зерновки (Агаджа-нян и др., 1980).
Интересно ингибирование аргиназы разветвленными аминокислотами - валином, лейцином и изолейцином. Особенно высокая степень йнгибирования аргнназы L- валином л ь- изолейцином обнаружена в молочной железе беременных и лактирующих крыс. Эти результаты дополняют имеющиеся в литературе сообщения относительно йнгибирования этими аминокислотами аргиназной активности печени овец ( Kesava Еао et al. , 1973). При этом авторы допускают конку-рентный механизм йнгибирования пяти и шести/утлеродными скелетами этих аминокислот.
Обобщая результаты исследований данной серии, можем подчеркнуть, что аргйназы различных органов крыс отличаются по степени йнгибирования различными аминокислотами. В зависимости от этапа развития и физиологического состояния животного меняется степень йнгибирования аргиназной активности аминокислотами.Учитывая малую вероятность прижизненных модификаций ферментов, полученные данные, очевидно, можно объяснить наличием различных изоэнзимов аргиназы в органах крыс, спектр которых в количественном и качественном отношении меняется при развитии и различных функциональных состояниях организма. В частности, в отношении почек и, особенно, молочной железы факт резкого ингибирова аргиназной активности пропаном можно объяснить наличием и индукцией в этих органах неуреотеличеокой аргиназы, функционирующей в системе биосинтеза пролина.
Изоэнзимный спектр аргиназы молочной железы нормальных (контрольных), беременных и лактирующих крыс В обзоре литературы было приведено множество работ, доказывающих наличие различных изоэнзимов аргиназы. Представляет определенный интерес совместное присутствие в одном организме или даже в одной клетке изоэнзимов аргиназы с различными метаболическими функциями (Давтян и др., 1970; Заробян и др., 1976; Бар-сегян и др., 1977; Агаджанян и др., 1979; Гасспарян, 1983).
В новой серии экспериментов изучался изоэнзимный спектр аргиназы молочной железы контрольных, беременных и лактирующих крыс. С целью выявления изоэнзимов аргиназы надосадок гомогена-та молочной железы крыс (после центрифугирования при 2500Qx g в течение 30 минут) подвергали гельфильтрации на сефадексе & -150 (режим фильтрации описан в разделе "Объект и методы исследований").
Из рис.7 видно, что в молочной железе контрольных крыс обнаруживается один пик аргиназной активности. У беременных крыс на 20-й день в молочной железе резко повышается указанный пик, а также появляется новый пик аргиназной активности, фильтрующийся с низкомолекулярными белками. Активность вновь индуцированного низкомолекулярного пика значительно уступает активности высокомолекулярного, однако она выше активности единственного пика контрольных крыс.
Влияние ионов двухвалентных металлов на активность изоэнзимов аргиназы молочной железы крыс
Неконкурентный характер ингибирования аргиназы пролином установлен также у аэробных инфузорий ( Заробян и др., 1976), в печени и почках эмбриона кур ( Арутюнян и др., 1981, 1982), у дождевого червя ( Гасспарян, 1982), у гусениц (для I изоэнзима) и куколок (для единственного изоэнзима) фасолевой зерновки, в то время как для П изоэнзима аргиназы гусениц фасолевой зерновки (Агаджаняя, 1983), I и П изоэнзима аргиназы тутового шелкопряда (Давтян и др., 1976) и аргиназы опухоли молочной железы мышей ( Kesava Као et al. , 1974) пролин является конкурентным ингибитором.
Указанные аминокислоты не действуют на активность второго изофермента аргиназы молочной железы крыс, что свидетельствует о различной роли изоэнзимов аргиназы в обмене аргинина. Подобные результаты были получены сотрудниками нашей лаборатории и в отношении обнаруженных двух изоэнзимов аргиназы у дрожжей рода Candida (Габриелян и др., 1977).
Среди испытанных аминокислот наивысшей ингибирующей способностью обладает орнитин. Сравнительно низкая степень ингибирования характерна для пролина. В различные дни лактации Кідля всех изученных аминокислот остается относительно постоянной: для орнитияа - в пределах 1,0 1,7; для L- лизина - 2,0 2,5; для L - пролина - 8,Of 10,0, а для ь- валина - 3,0 4,6 мМ.
Следует отметить, что обнаруженные нами значения Еі для орнитина несколько ниже, по сравнению с данными литературы, согласно которым Ei печеночной аргиназы крыс для орнитина составляет 5 мМ ( Glass , Knox , 1973). По данным этих же авторов Ki печеночной аргиназы для d - аминомасляной кислоты -8 мМ, a Ki фермента молочной железы - 8 и 12 мМ для лизина и о - аминомасляной кислоты, соответственно. Для сравнения отметим, что КІ шести аминокислот-ингибиторов аргиназы печени овцы составляют:для лизина - 2,2; орнитина - 4,4; лейцина-изолейци-на - 2,9; валина - 5,3 и для пролина - 10 мМ ( Mora et al. , 1965).
По данным Хунтера и Даунса (Hunter , Dawns f 1945) кз аргиназы печени быка для орнитина - 4,1, а для лизина - 4,8 мМ, по Кэмблу ( Campbell f 1966) этот показатель у аргиназы печени быка и крыс для орнитина и лизина равен 4,34 и 2,37 мМ, соответственно, у фермента печени кур - 75 мМ для лизина и 90 мМ для орнитина (Саруханян, Давтян, 1973); у дождевого червя для лизина - 2,546,3 мМ (Eeddy , Campbell , 1969) И 1,12 мМ (Гас-спарян, 1983), у аэробных инфузорий для пролина - 8,6+10,0 мМ (Заробян и др., 1976), у I изоэнзима гусениц тутового шелкопряда для пролина - 3,5; орнитина - 0,5; лизина - 0,8 мМ (Давтян и др., 1976), у лягушек до метаморфоза для орнитина - 6; лизина -7 мМ, после метаморфоза - 4 и 9 мМ, соответственно (Барсегян, 1980), в опухолях молочной железы для пролина - 26,1 мМ ( Ее _ sava Еао et al. , 1974).
Таким образом, активность высокомолекулярного пика аргиназы молочной железы крыс регулируется испытанными аминокислотами, причем значения Кі находятся в пределах, соответствующих аргиназ различного происхождения. Представляет определенный интерес факт неконкурентного ингибирования аргиназы пролином, что является существенным дополнением к списку немногочисленных аргиназ, аллостерически регулируемых пролином,
Известно, что ионы двухвалентных металлов являются эффекторами аргиназы. Показано, что наилучшим активатором для большинства аргиназ различного происхождения являются ионы марганца. При мп - дефицитной диете обнаружено понижение активности печеночной аргиназы крыс ( Boyer et al, , 1942) и мышей ( Shils McCollum , 1943). Исследования ряда авторов ( Coke et al. , 1951; Cabello et al. , 1951) показали, что, по всей вероятности, изменение содержания мп в диете отражается на активности фермента независимо от количества апофермента. Имеется также ряд исследований по влиянию других ионов двухвалентных металлов на активность аргиназ различного происхождения. Так, имеются сообщения, что дрожжевая аргиназа лучше активируется Ре2+ ( Middelhoven , 1969), аргиназа Bacillus subtilis -Go t Na-Kamura et al. , 1973), морских ПОЛИХЄТ - Mg +( ( Malley et ai. , 1974). Это говорит о том, что двухвалентные катионы типа Ре + ,Со + и Ni +способны образовывать комплексы с молекулами аргиназы, создавая тем самым благоприятные условия для образования комплекса аргиназа-аргинин ( Paiacios et al. , 1969). По данным Давтяна и сотр. (Давтян и др., 1970) Ni +и Fe +не активируют аргиназу почек птиц, а Мп +и Со +активируют примерно в 10 раз. Таким образом, активирование аргиназы ионами двухвалентных металлов зависит от происхождения фермента.
