Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. МСК: основные аспекты биологии 14
1.1.1. История открытия МСК 14
1.1.2. Терминология 14
1.1.3. Критерии МСК 15
1.1.4. Источники МСК 16
1.1.5. Методы выделения МСК 18
1.1.6. Условия культивирования МСК 19
1.1.7. Морфологическая, функциональная и биохимическая неоднородность популяции МСК 21
1.1.8. Антигенный фенотип и профиль экспрессии генов МСК 23
1.1.9. Возмолшые направления дифференцировки МСК. Явление пластичности 25
1.1.10. Перспективы практического использования МСК в современной медицине 26
1.2. Общая характеристика МСК из печени зародышей как транзиторного органа миелоидного кроветворения в эмбриогенезе 27
1.2.1. Роль МСК и их производных в создании кроветворного микроокружения. Миграционные свойства МСК 28
1.2.2. Предпосылки изучения МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте 31
1. 3. Молекулярно-генетические основы дифференцировки МСК ...34
1.3.1. Роль сигнальных белков и транскрипционных факторов в клеточной дифференцировке 34
1.3.2. Молекулярно-генетические аспекты остеогенной дифференцировки МСК 35
1.3.3. Молекулярно-генетические аспекты адипогенной 43
дифференцировки МСК 43
Глава 2. Материалы и методы 54
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Антигенный профиль МСК из печени зародышей и зрелого 63
костного мозга 63
3.1.1. Оценка экспрессии негативных маркеров МСК на разных сроках культивирования 63
3.1.2. Оценка экспрессии позитивных маркеров МСК на разных сроках культивирования 67
3.2. Молекулярно-генетические и морфологические аспекты остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане 74
3.2.1. Гистохимический и иммуноцитохимический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга 75
3.2.2. Сравнительный молекулярно-генетический анализ экспрессии генов, ответственных за реализацию остеогенеза в культурах МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга 95
3.3. Молекулярно-генетические и морфологические аспекты адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане 100
3.3.1. Гистохимический и иммуноцитохимический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого
костного мозга 100
3.3.2. Сравнительный молекулярно-генетический анализ экспрессии генов, ответственных за реализацию адипогенеза в культурах
МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга 107
Глава 4. Обсуждение результатов 112
4.1. Сравнительная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга 112
4.2. Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте 114
4.3. Молекулярно-генетический и морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте 120
Выводы 127
Список литературы
- Условия культивирования МСК
- Молекулярно-генетические основы дифференцировки МСК
- Оценка экспрессии позитивных маркеров МСК на разных сроках культивирования
- Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте
Введение к работе
Актуальность проблемы. Познание механизмов регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, несомненно, остается одним из основополагающих направлений в биологии развития, интенсивно и плодотворно изучаемых как на клеточном, так и на субклеточном уровнях с привлечением самых разнообразных подходов и методов. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) являются одной из часто используемых экспериментальных моделей для изучения морфогенетических процессов в связи с несложностью их выделения, культивирования, высокой пролиферативной активностью и широкими потенциями к дифференцировке. Неоспоримые преимущества названной модели также заключаются в том, что она позволяет изучать процессы клеточной пролиферации и дифференцировки на молекулярно-генетическом уровне, что особенно актуально сейчас, когда внимание исследователей сместилось с изучения морфологических аспектов клеточного развития на события, происходящие на уровне гена.
В настоящее время МСК рассматриваются как мультипотентные тка-неспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, по своим потенциям к дифференцировке близкие к клеткам эмбриональной мезенхимы. МСК способны осуществлять направленную дифференцировку в определенные типы клеток соединительной ткани, такие как остеобласты, хондробласты, адипоциты и стромальные клетки, создающие кроветворное микроокружение (Owen, 1988; Owen, Friedenstein 1988; Dominici et al., 2006). По общему признанию, основы экспериментального изучения и клинического применения МСК были заложены отечественным исследователем А. Я. Фриденштейном в 60-х гг. XX столетия (Friedenstein et al., 1966, 1968).
МСК обнаружены в различных органах и тканях половозрелого организма (Meirelles et al., 2006), тем не менее, основным источником этих клеток
на протяжении всего постнатального онтогенеза считается костный мозг (Bianco et al., 2001; Pittenger, Marshak, 2001; Pittenger, 2008). МСК также найдены в составе кроветворной стромы эмбриональных органов гемопоэза, в частности, в печени зародышей (Charbord et al., 2002; Mendes et al., 2005). Присутствие МСК в составе стромы кроветворных органов в разные периоды онтогенеза тесным образом связано с исключительной ролью этих клеток и их производных в формировании и поддержании кроветворного микроокружения, так называемой "ниши" кроветворной стволовой клетки (КСК) (Metcalf, Moore, 1971; Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005).
Сравнительный анализ МСК различной органной принадлежности важен для получения глубокого и всестороннего представления о биологии этих клеток в целом. Мы полагаем, что наиболее подходящим критерием для проведения подобного сравнительного исследования является функциональная близость МСК. Это определило выбор органов-источников данных клеток, которыми стали печень зародышей и зрелый костный мозг, т.к. МСК в составе этих органов выполняют сходную функцию, участвуя в организации кроветворного микроокружения в разные периоды онтогенеза. Мы полагаем также, что изучение МСК из разных кроветворных источников в сравнительном аспекте позволит не только охарактеризовать исследуемые клеточные популяции с необходимой полнотой и определенностью, но и предоставит возможность судить об их идентичности, как это показано для кроветворных стволовых клеток (КСК). Известно, что в онтогенезе процесс кроветворения последовательно развертывается в разных органах. Согласно современной концепции миграционной теории, КСК, впервые возникнув в желточном мешке и области аорта-гонадо-мезонефроса, последовательно заселяют тран-зиторные и дефинитивные кроветворные органы по мере формирования в них соответствующего микроокружения (Metcalf, Moore, 1971; Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005). Нами не исключается наличие подобной последовательной миграции из одних временно существующих кроветвор-
ных органов в другие в процессе индивидуального развития и для МСК, чему есть ряд экспериментальных подтверждений (Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005).
Однако, рассматривая МСК как важный компонент кроветворного микроокружения, необходимо учитывать, что сами МСК должны находиться под влиянием специфических локальных внутриорганных факторов. Следовательно, несмотря на возможную гистогенетическую близость МСК из различных кроветворных источников, возможно также наличие некоторых фе-нотипических и функциональных особенностей между этими клетками. Планируя проведение сравнительного изучения МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга, мы допускали, что такие различия реально существуют.
Рассмотрение весьма немногочисленной литературы, посвященной сравнительной характеристике МСК из указанных источников, косвенно подтвердило наши предположения. Показано, что МСК из печени зародышей обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с костномозговыми МСК (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), а также, по некоторым данным, несут на своей поверхности маркеры эмбриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog (Guillot et al., 2007), что хорошо укладывается в современные представления о биологических свойствах клеток эмбрионального происхождения. Вместе с тем, сведения о дифференцировочных потенциях МСК в составе печени зародышей остаются неполными и противоречивыми. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остео-генном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), тогда как другими исследователями наличие таких множественных потенций ставится под сомнение (in't Anker et al., 2003a; Fromigue et al., 2008).
Таким образом, всесторонний подход к решению этих проблем требует глубокого изучения фенотипических и функциональных особенностей МСК в составе печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане с помощью комплексного экспериментального подхода, предусматривающего проведение исследований на молекулярно-генетическом уровне.
Мы остановили свой выбор на дифференцировке МСК в двух направлениях: остеогенном и адипогенном. Эти направления дифференцировки приводят, в конечном счете, к развитию двух типов клеток - остеобластов и ади-поцитов, чьи функции in vivo достаточно разобщены. Остеогенные клетки причисляются к механоцитам, выполняющим прежде всего опорную функцию вместе с продуцируемым ими межклеточным веществом, тогда как ади-поцитам приписывается преимущественно энергетическая и трофическая функции. Несмотря на такую функциональную разобщенность, есть все основания предполагать, что остеобласты и адипоциты происходят от общего бипотентного предшественника в составе популяции МСК (Richard et al, 1996; Gimble et al., 1996; Nuttall, Gimble, 2000). К этому следует добавить, что клетки обоих типов объединяет выполняемая ими исключительно важная функция - секреторная, благодаря которой они играют незаменимую роль в формировании и поддержании кроветворного микроокружения (Tavassoli, 1974; Zhang et al., 2003; Haylock, Nilsson, 2006; Benayahu et al., 2007).
Цель и задачи исследования. Все вышесказанное позволило наметить основную цель диссертационной работы - сравнительный молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео-генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга крыс. Для достижения цели исследования были сформулированы следующие задачи:
Охарактеризовать изучаемые клеточные популяции с позиции общепринятых критериев МСК по экспрессии специфических поверхностных антигенов CD73, CD90, CD 105.
Изучить динамику экспрессии указанных маркеров на разных сроках культивирования.
Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование остеогенных потенций МСК из двух источников.
Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры остеогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.
Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование адипогенных потенций МСК из двух источников.
Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры адипогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.
Научная новизна. На экспериментальной модели - культуре МСК из печени зародышей крыс, впервые проведена комплексная оценка антигенного профиля и динамики экспрессии специфических маркеров МСК в ходе культивирования в сравнении с таковыми из зрелого костного мозга. Показано, что исследованные клеточные популяции обладают сходным иммунофе-нотипом, а именно экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD 105. Выявлено, что по мере увеличения сроков культивирования МСК из обоих источников наблюдается снижение экспрессии таких маркеров как CD73 и CD105.
Впервые проведен подробный иммунофенотипический и гистохимический анализ остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей в сравнении с таковыми МСК из костного мозга половозрелых крыс. В
сходных экспериментальных условиях МСК из печени зародышей обладают менее выраженными потенциями к адипогенезу и не способны к завершению остеогенной дифференцировки, а именно к формированию зрелых остеобластов и минерализованного межклеточного матрикса, в отличие от выраженных адипо- и остеогенных потенций МСК из зрелого костного мозга.
Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии ряда генов, кодирующих маркеры остеогенной и адипогенной дифференцировок, на разных сроках культивирования МСК из обоих источников в соответствующих индукционных средах. Выявлено, что МСК из печени зародышей характеризуются более низкой экспрессией генов, вовлеченных в реализацию как остеогенной, так и адипогенной программ дифференцировок, по сравнению с МСК из зрелого костного мозга.
Теоретическое и практическое значение. Для решения поставленных в работе задач реализован комплексный подход, позволивший в сходных экспериментальных условиях сравнить МСК из транзиторного (печень зародышей) и дефинитивного (зрелый костный мозг) органов миелоидного кроветворения. Подобный сравнительный анализ представляет общебиологиче-скиЙ интерес, поскольку позволяет получить более целостное представление о системе МСК. Кроме того, полученные сведения позволяют судить о фено-типическом сходстве МСК из двух источников, но не их идентичности, проявляющейся в различной степени реализации той или иной программы дифференцировки в сравнимых условиях культивирования. Неодинаковые инду-цибельные свойства МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга могут быть связаны с разной органной принадлежностью этих клеток, в частности, с влиянием специфических локальных внутриорганных факторов.
Проведенное сравнительное изучение МСК из печени зародышей в сравнении с таковыми из зрелого костного мозга имеет также важное практическое значение. Результаты исследования могут быть использованы при
чтении курса лекций по биологии развития и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.
В заключение автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям, д.б.н. В.И. Старостину и к.б.н. А.С. Микаеляну, оказавшим неоценимую помощь в организации экспериментальных исследований, принявшим непосредственное участие в их проведении и теоретическом анализе. Автор искренне признателен д.б.н. Р.Д. Зиновьевой за ценные критические высказывания и консультации. Автор также выражает благодарность сотрудникам лабораторий Гистогенеза и Молекулярно-генетических проблем онтогенеза за помощь в организации экспериментов и обсуждении полученных результатов.
Условия культивирования МСК
Условия культивирования, таюке как и методы выделения МСК, крайне вариабельны. Вместе с тем, существует несколько факторов, которые необходимо учитывать при ведении культуры этих клеток, а именно:
Во-первых, это процентное содержание сыворотки, которое, как правило, варьирует в пределах от 2 до 20%. Сыворотка сама по себе, а таюке ее процентное содержание в культуральной среде оказывает влияние на проли-феративную активность клеток и на их чувствительность к ряду ростовых факторов и других цитокинов (Masters, Stacey, 2007).
Во-вторых, это физические и химические характеристики поверхности культурального флакона, которые влияют не только на адгезию клеток, но также на их морфологию, пролиферативную активность, дифференцировоч-ный потенциал, а таюке способствуют селекции определенных субпопуляций МСК (Salasznyk et al., 2004; Klees et al., 2005). В большинстве протоколов используется специальное белковое покрытие культуральной поверхности (например, фибронектин, желатин или коллаген) для усиления клеточной адгезии, а также для имитации ex vivo некоторых аспектов внеклеточного микроокружения, характерного для этих клеток in vivo (Wagner, Но, 2007).
В-третьих, срок культивирования МСК оказывает существенное влияние на рост и дифференцировочный потенциал клеток. В клинических целях требуется значительное число МСК с широкими потенциями к дифференци-ровке и стабильным фенотипом, в результате чего возникает необходимость наращивания клеточной массы путем длительного культивирования МСК in vitro. Однако, по некоторым данным, при длительном пассировании (более 10 пассажей) МСК может наблюдаться феномен клеточного старения, получившего название феномен Хейфлика (Bonab et al., 2006). Одним из его признаков является репликативное старение МСК, которое выражается в снижении пролиферативной активности клеток и заканчивается полной остановкой роста (Pittenger et al., 1999; Kassem et al., 1997; Stenderup et al., 2003). Как быстро наступит репликативное старение МСК, во многом зависит от источника клеток. Например, МСК человека способны претерпевать 40-50 удвоений популяции (Stenderup et al., 2003), тогда как МСК мыши - более 100 удвоений (Meirelles, Nardi, 2003). Следует отметить, что пролиферативный потенциал МСК снижается с увеличением возраста донора клеток (D Ippolito et al., 1999; Stenderup et al., 2003; Baxter et al., 2004). При длительном культивировании также происходит утрата потенций МСК к некоторым дифференци-ровкам (Bruder et al., 1997; DiGirolamo et al., 1999; Muraglia et al., 2000; Кожевникова и др., 2008). Репликативное старение, главным образом, связано со снижением ферментативной активности теломеразы, регулирующей длину теломерных участков хромосомы (Wright, Shay, 2002; Sharpless, DePinho, 2007). Зная, что лимитирующим фактором для теломеразной активности является экспрессия гена TERT (Zimmermann, 2003), был предложен новый подход для преодоления феномена Хэйфлика за счет иммортализации МСК этим геном. "Теломеризация" клеток является перспективным подходом генной терапии не только для получения необходимого количества клеток для их практического использования, но и для сохранения МСК потенциала к дифференцировкам in vitro и in vivo (Abdallah et al., 2005; Simonsen et al., 2002; Liu et al., 2004). Вместе с тем, нестабильность генома и возможная последующая клеточная трансформация, как результаты высокой активности теломеразы, являются одними из существенных недостатков этого подхода (Burns et al., 2005).
Отсутствие общепринятых протоколов выделения МСК, стандартизированных условий культивирования, а также разнообразие источников этих клеток оказывают существенное влияние на их морфологическую характеристику и дифференцировочный потенциал. В процессе культивирования МСК могут иметь место: (1) изначальная селекция клеток в составе гетерогенных субпопуляций, в частности, по адгезивным свойствам; (2) предпочтительная пролиферация определенных клеточных субпопуляций с различными потенциями к дифференцировкам, для которых созданные условия культивирования оптимальны; (3) изменение клеточного фенотипа и функциональных характеристик МСК в результате влияния условий in vitro (Wagner, Но, 2007). Указанные причины гетерогенности МСК, возможно, не являются единственными. Анализ имеющейся литературы позволил выделить три основных типа гетерогенности популяции МСК, а именно:
Морфологическая гетерогенность. Начиная с начальных этапов культивирования, в составе популяции МСК присутствуют клетки, различающиеся по своим морфологическим признакам (например, по форме клеток), степени адгезии к пластику, а также скорости пролиферации (Анохина, Бурав-кова, 2007). Еще в ранних публикациях, посвященных МСК, авторы различали, по крайней мере, два морфологических типа этих клеток: медленно делящиеся крупные распластанные клетки и быстро делящиеся веретеновидные (Mets, Verdonk, 1981). Позднее был открыт еще один тип клеток, получивших название "RS-клетки" (Colter et al., 2000; Prockop et al., 2001). Это крайне малочисленная субпопуляция мелких агранулярных клеток, способных к быстрой пролиферации. RS-клетки рассматриваются как ближайшие кандидаты на роль bona fide мезенхимных стволовых клеток. При дальнейшем пассировании популяция МСК становится более гомогенной и характеризуется преобладанием крупных распластанных клеток (Prockop et al., 2001).
Молекулярно-генетические основы дифференцировки МСК
Изучение МСК из печени зародышей, основного органа миелоидного кроветворения в пренатальном периоде, крайне актуально в связи с их более высокой пролиферативной активностью и предполагаемыми широкими потенциями к дифференцировке (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007). Всесторонний анализ фенотипических и функциональных характеристик печеночных МСК представляется нам возможным только при сравнении с аналогичными свойствами МСК из зрелого костного мозга в идентичных экспериментальных условиях. МСК в составе зрелого костного мозга и зародышевой печени выполняют одну исключительно важную функцию - создание и поддержание кроветворного микроокружения. При этом популяция МСК из зрелого костного мозга рассматривается нами в качестве контроля или "эталона", т.к. общеизвестно, что клетки этой популяции отвечают всем критериям МСК, а сам костный мозг является основным источником этих клеток. Подобную логику сравнения мы находим и у других исследователей (Panepucci et al., 2004; Koerner et al., 2006; Kern et al., 2006). Интерес к подобному сравнительному анализу возник недавно, благодаря чему существующие публикации малочисленны и содержат порой противоречивые сведения.
Пролиферативная активность МСК из печени зародышей изучена наиболее полно. По разным данным, печеночные МСК человека способны претерпевать от 26,1 до 28,4 удвоений популяции в течение 50 дней культивирования (Campagnoli et al., 2001; Guillot et al., 2007), тогда как МСК из зрелого костного мозга за этот же срок гораздо меньше - лишь 7.1 (Guillot et al., 2007). Это связано с более высоким уровнем экспрессии генов, ответственг ных за клеточную пролиферацию и процессы репарации ДІЖ, по сравнению с МСК из костного мозга (Gotherstrom et al., 2005). Вместе с тем, оценка антигенного профиля и дифференцировочных потенций МСК из печени зародышей до сих пор остается неоднозначной. Есть основания предполагать, что, несмотря на возможное гистогенетическое родство, МСК из указанных органов фенотипически и функционально неидентичны, как это показано для другого типа тканеспецифических стволовых клеток, а именно КСК (Kim et al., 2007). Такое различие для МСК разного кроветворного происхождения уже показано на основании изучения экспрессии ряда белков цитоскелета, внеклеточного матрикса, молекул клеточной адгезии и др. (Charbord et al., 2002; Gotherstrom et al., 2005; Chateauvieux et al., 2007; Guillot et al, 2007). Согласно этим данным, печеночные МСК плодов человека в меньшей степени экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости МНС I класса и не содержат антигены МНС II класса. Напротив, костномозговые МСК содержат внутриклеточные депозиты антигенов МНС II класса. Следовательно, МСК эмбрионального происхождения обладают большей иммунологической инертностью. Анализ профиля генной экспрессии показал, что МСК из печени зародышей менее коммитированы в том или ином направлении дифференцировки, т.к. содержат меньшее количество транскриптов, вовлеченных в терминальные этапы дифференцировки (Gotherstrom et al., 2003, 2005). Кроме того, по некоторым данным, МСК из печени зародышей несут на своей поверхности маркеры эмбриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog, тогда как в МСК из костного мозга эти маркеры не выявлены (Guillot et al., 2007). Следует, однако, отметить, что существуют исследования, доказывающие экспрессию перечисленных эмбриональных маркеров МСК половозрелого организма (Pochampally et al., 2004; Gotherstrom et al., 2005).
Относительно дифференцировочных потенций печеночных МСК, данные также довольно противоречивы. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007; Guillot et al., 2008), другими же исследователями наличие таких множественных потенций ставится под сомнение (in t Anker et al., 2003a; Fromigue et al., 2008). Интересно отметить, что в случае успешных попыток индуцировать печеночные МСК к дифференцировке в нескольких направлениях, в качестве источника клеток, как правило, использовалась печень зародышей человека. Это наблюдение, однако, имеет исключение, т.к. в одной из работ, посвященной, в том числе, изучению дифференцировочных потенций МСК из печени зародешй человека, были выявлены ослабленные остеогенные потенции этих клеток по сравнению с МСК из других эмбриональных органов - костного мозга, селезенки и легкого (in t Anker et al., 2003a). Напротив, авторы, использовавшие в качестве экспериментальной модели линии МСК из печени зародышей мыши, показали, что в сравнимых экспериментальных условиях эти клетки не способны к остеогенной дифференцировке, что выражалось в отсутствии этапа кальцификации внеклеточного матрикса (Fromigue et al., 2008). Вероятно, имеют место существенные межвидовые различия в дифференцировочных потенциях МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в разные периоды онтогенеза. Данное предположение косвенно подтверждается исследованиями, показавшими, что МСК из периферической крови лошади не способны к формированию хрящевой ткани, в отличие от костномозговых МСК (Koerner et al., 2006). В целом, полученные сведения литературы явно не достаточны для полного суждения о фенотипических и функциональных свойствах МСК из печени зародышей.
Оценка экспрессии позитивных маркеров МСК на разных сроках культивирования
Следующий этап работы был посвящен выявлению фенотипических маркеров CD90, CD73 и CD 105 на разных сроках культивирования МСК из КМ и ПЗ и анализу динамики экспрессии перечисленных маркеров в сравнительном аспекте с привлечением как иммуноцитохимического, так и молеку-лярно-генетического методов анализа.
Иммуноцитохимическое исследование. Иммунофенотип, характеризующий клетки как МСК, оценивали с использованием моноклональных антител к CD90 и CD73. К сожалению, антитела к поверхностному антигену CD 105 крысы отсутствуют в продаже.
Иммуноцитохимическое окрашивание первичных культур из КМ и ПЗ выявило экспрессию маркеров CD90 (рис. 6, рис. 8) и CD73 (рис. 7, рис. 9) как в клетках, формирующих колонии, так и в одиночных клетках вне колоний. Как представлено на рис. 6, помимо МСК, в пределах колоний располагалось значительное количество клеток, не содержащих указанные маркеры и, скорее всего, являющихся кроветворными. Рис. 6. Экспрессия поверхностного антигена CD90 в первичной культуре из КМ. Имму-нофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD90 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 488). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б ).
Экспрессия поверхностного антигена CD73 в первичной культуре из КМ. Имму-нофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD73 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 488). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б ).
Экспрессия поверхностного антигена CD90 в первичной культуре из ПЗ. Имму-нофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD90 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 488). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б ).
Экспрессия поверхностного антигена CD73 в первичной культуре из ПЗ. Имму-нофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD73 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 488). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б ). 1 Л1 +DAPI
Экспрессия поверхностных антигенов CD90 (а, б) и CD73 (в, г) в культуре МСК из зрелого КМ 3-го пассажа. Иммунофлуоресцентное мечение с использованием моно-клональных антител к CD90 и CD73 с максимумами спектра испускания в красной (Alexa 568) и зеленой (Alexa 488) областях соответственно, а", б", в", г" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б , в , г1). Рис. 11. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 (а, б) и CD73 (в, г) в культуре МСК из ПЗ 3-го пассажа. Иммунофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD90 и CD73 с максимумами спектра испускания в зеленой (Alexa 488) и красной (Alexa 568) областях соответственно, а", б", в", г" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б , в , г1).
Экспрессия поверхностного антигена CD90 в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) 11-го пассажа. Иммунофлуоресцентное мечение с использованием моноклонального антитела к CD90 с максимумами спектра испускания в красной (Alexa 568) и зеленой (Alexa 488) областях, а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б1).
Экспрессия поверхностного антигена CD73 отдельными клетками (указаны стрелками) в культуре МСК из ПЗ 9-го пассажа. Иммунофлуоресцентное мечение с использованием моноклональных антител к CD73 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 568). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а , б1). В начальные сроки культивирования (1-3 пассажи) практически все клетки популяции МСК из КМ положительно окрашивались на маркеры CD90 и CD73 (рис. 10). Маркер CD90 также выявлен почти во всех клетках популяции МСК из ПЗ (рис. 11, а, б). Вместе с тем, поверхностный антиген CD73 обнаружен лишь приблизительно в 60% клеток печеночного происхождения и лишь около 20% из них окрашивались на этот маркер интенсивно (рис. 11,е, г).
Анализ динамики экспрессии фенотипических маркеров МСК на протяжении длительного срока культивирования выявил, что на 8-11-ом пассажах практически все клетки культуры МСК из КМ и ПЗ экспрессировали маркер CD90 (рис. 12), что хорошо согласуется с данными ПЦР-анализа (рис. 14).
Экспрессия CD73 в культурах печеночных МСК 8-11-го пассажей сохранялась лишь в отдельных клетках, составляющих минорную субпопуляцию среди CD74 -клеток (рис. 13), что также находится в полном соответствии с данными ПЦР-анализа (рис. 14).
Молекулярно-генетическое исследование. В настоящем разделе представлены данные ПЦР-анализа по экспрессии генов фенотипических маркеров МСК CD 105, CD90, CD73 в обеих исследованных культурах с использованием соответствующих специфических праймеров.
Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте
Морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из ПЗ и КМ 2-3 пассажей проводился на 10-16 сут инкубации клеток в адипогенной среде, когда были полностью сформированы группы зрелых адипоцитов. Для выявления в клетках нейтральных жиров обе культуры МСК окрашивали смесью суданов III и IV или жировым красным О.
В рамках сравнительного исследования адипогенных потенций МСК их двух источников также проведен иммуноцитохимический анализ экспрессии маркеров ранних и поздних этапов адипогенеза, а именно PPAR8 и ALBP соответственно.
Адипогепез в культуре МСК из КМ. Гистохимическое окрашивание культуры МСК из КМ на липидные включения выявило как одиночные жировые клетки, так и кластеры, состоящие из нескольких адипоцитов. Эти клетки характеризовались множественными жировыми каплями и, следовательно, относились к мультилокулярным адипоцитам. Вместе с тем, при трансплантации костного мозга в виде тканевых фрагментов под капсулу почки новообразующиеся в процессе регенерации трансплантатов жировые клетки всегда имели вид унилокулярных адипоцитов, т.е. возможно являлись более зрелыми (неопубликованные данные).
С использованием фазово-контрастного инвертированного микроскопа уже на 3—4 сут культивирования МСК из КМ в индукционной среде выявлены первые дифференцированные адипоциты с неодинаковым количеством липидных включений (данные не приведены). Форма адипоцитов варьирова ла от овальной до веретиновидной. К 10-12 сут эксперимента в опытной культуре МСК из КМ уже окончательно сформированы группы дифференцированных адипоцитов, где их численность достигала относительно высоких значений (рис. 41, б, г, ё).
В контрольных культурах МСК из КМ дифференцированные адипоциты не выявлены (рис. 41, а, в, д), хотя единичные клетки с морфологией фиб-робластов содержали в цитоплазме мелкие суданофильные включения (данные не приведены).
При культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде в течение 14-21 сут возможно появление спонтанной дифференциров-ки клеток в адипогенном направлении (рис. 42, а, б). Кроме того, формирование зрелых адипоцитов наблюдалось в стандартной остеогенной среде (рис. 42, в, г). В последнем случае, жировые клетки выявлялись в непосредственной близости от очагов остеогенеза (рис. 42, г).
Мультилокулярные адипоциты при культивировании МСК из КМ 4-го (а, б) и 2-го (в, г) пассажей в стандартной ростовой среде (а, б) и в остеогенной среде (в, г) на 18-е (в) и 21-е (г) сут эксперимента. Стрелками указан очаг остеогенеза (красная стрелка) и зрелые адипоциты (желтые стрелки), а, б - фазово-контрастная микроскопия; в - окраска Суданом III и IV с докрашиванием ядер гематоксилином; г - окраска гематоксилин-эозином.
Иммуноцитохимическое окрашивание с использованием антител к PPAR5 выявило ядерную локализацию этого фактора транскрипции как в контрольной (рис. 43, а), так и в опытной культурах МСК из КМ (рис. 43, б). В контроле уровень экспрессии PPAR6 был несколько ниже.
Экспрессия фактора транскрипции PPAR5 в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 10-е сут культивирования в контрольной (а) и опытной (б) средах. Иммунофлуоресцент-ное мечение с использованием поликлональных антител к PPAR5 с максимумом спектра испускания в зеленой области (Alexa 488). а", б" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а\ б ).
Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии маркера зрелых адипоци-тов ALBP в культурах МСК из КМ показал, что на поздних этапах культивирования в адипогеннои среде происходит заметное увеличение содержания этого белка в цитоплазме клеток (рис. 46, б), тогда как в клетках контроля уровень экспрессии ALBP оставалось достаточно низким на протяжении всего срока культивирования (рис. 46, а).
Важно отметить, что белок ALBP обнаружен не только в цитоплазме, но и в ядрах клеток. Ядерная локализация ALBP, как правило, была более выраженной в клетках контроля и на ранних этапах культивирования МСК из КМ в стандартной индукционной среде.
Адипогенез в культуре МСК из ПЗ. В культуре МСК из ПЗ первые клетки с жировыми включениями обнаруживались на 11-12 сут культивирования в индукционной среде (данные не приведены), а первые группы зрелых адипоцитов - на 14-16 сут (рис. 45, а-г). Морфологически эти группы были заметно обособлены от остальных клеток, сохраняющих фибробласто-подобную морфологию и не содержащих липидные включения. Последние также обнаруживались и среди адипоцитов внутри группы (рис. 45, б, в, г). Интересно отметить, что ни в одной из исследованных культур МСК из ПЗ не выявлена спонтанная адипогенная дифференцировка.
