Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Клеточный состав щитовидной железы млекопитающих 10
2.1.1. Фолликулярные клетки щитовидной железы (тиреоциты) 11
2.1.2. С-клетки щитовидной железы 15
2.1.2.1. Морфология С-клеток 15
2.1.2.2. Взаимоотношения С-клеток с фолликулярным эпителием в щитовидной железе млекопитающих 18
2.1.2.3. Функции С-клеток 20
2.2. Пренатальный гистогенез щитовидной железы млекопитающих 24
2.3. Клеточные маркеры 27
2.3.1. Белки цитоскелета 27
2.3.2. Маркеры фолликулярных и С-клеток щитовидной железы 29
2.4. Гормональная регуляция гомеостаза кальция 31
2.5. Нитрат свинца, как конкурент кальция в кальциевом гомеостазе 35
3. Материалы и методы исследования 39
3.1. Объекты исследования 39
3.1.1. Изучение щитовидной железы крысы в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе 39
3.1.2. Изучение щитовидной железы человека в пренатальном онтогенезе 40
3.1.3. Модель повреждения щитовидной железы крысы нитратом свинца 40
3.1.4. Модель экспериментального остеопороза 40
3.1.5. Корригирующая терапия при остеопорозе 41
3.2. Методы исследования 42
3.2.1. Биохимические методы исследования при экспериментальном остеопорозе 42
3.2.2. Иммуногистохимические методы 42
3.2.2.1. Непрямой иммунопероксидазный метод 44
3.2.2.2. Стрептавидин-биотиновый метод 44
3.2.2.2.1. Специфика окрашивания парафиновых срезов щитовидной железы человека антителами к цитокератинам № 7, № 19 и виментину 45
3.3. Морфометрические методы исследования 45
4. Результаты и их обсуждение 47
4.1. Изучение дифференцировки эпителия щитовидной железы в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе 47
4.1.1. Исследование фенотипических изменений клеток щитовидной железы в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе крысы 48
4.1.1.1. Выявление экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток 48
4.1.1.2. Выявление экспрессии тиреоглобулина 51
4.1.1.3. Выявление экспрессии кальцитонина 56
4.1.1.4. Выявление экспрессии нейронспецифической енолазы 58
4.1.2. Исследование клеток щитовидной железы в пренатальном онтогенезе человека 65
4.1.2.1. Выявление экспрессии цитокератинов № 7, № 19 и виментина 65
4.1.2.2. Выявление экспрессии тиреоглобулина 72
4.1.2.3. Выявление экспрессии кальцитонина 74
4.1.2.4. Выявление экспрессии нейронспецифической енолазы 76
4.1.2.5. Выявление экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток 76
4.1.3. Сравнительный анализ основных этапов пренатального развития крысы и человека 79
4.2. Изучение реакции эпителиальных клеток щитовидной железы крысы после воздействия нитрата свинца 86
4.2.1. Изучение экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток в щитовидной железе и печени после воздействия нитрата свинца 86
4.2.2. Иммуногистохимическое изучение С-клеток щитовидной железы после воздействия нитрата свинца 89
4.3. Изучение С-клеток щитовидной железы кроликов при эксперимен тальном остеопорозе 102
4.3.1. Исследование динамики показателей сыворотки крови и мочи...102
4.3.1.1. Динамика изменения уровня ФСГ 102
4.3.1.2. Динамика изменения концентрации кальция в сыворотке крови и моче 104
4.3.2. Иммуногистохимический и морфометрический анализ С-кле-точной популяции 106
4.3.3. Сравнительный морфометрический анализ С-клеток 115
5. Заключение 120
6. Выводы 126
7. Библиографический список использованной литературы 128
- Взаимоотношения С-клеток с фолликулярным эпителием в щитовидной железе млекопитающих
- Биохимические методы исследования при экспериментальном остеопорозе
- Исследование фенотипических изменений клеток щитовидной железы в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе крысы
- Изучение С-клеток щитовидной железы кроликов при эксперимен тальном остеопорозе
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ. В связи с неблагоприятной экологической обстановкой в большинстве регионов России особую актуальность приобретают исследования, посвященные действию токсических веществ и, в первую очередь, солей тяжелых металлов на различные органы и ткани человека. Щитовидная железа (ЩЖ) является органом-мишенью для различных неблагоприятных экзогенных факторов (Майстеренко В.Н., 1996; Шадлинский В.Б., 1999; Риггз Б.Л., 2000) и в последние годы интенсивно изучалось их влияние на различные морфофункциональные характеристики ЩЖ и синтез йодсодержащих гормонов (Бонецкий А.А., 1999; Шадлинский В.Б.,1999; Окороков А.Н., 2001). Вместе с тем, в ЩЖ С-клетки синтезируют кальцитонин, который участвует в поддержании гомеостаза кальция (Са) в организме. Трудно предположить, что при различных неблагоприятных воздействиях на организм, популяция С-клеток останется не чувствительна к этим факторам. Особую актуальность имеют исследования по возможному влиянию солей тяжелых металлов, в частности свинца (Зербино Д.Д., 1997), на С-клетки ЩЖ и костную ткань, так как свинец способен накапливаться в скелете, замещая Са (Майстеренко В.Н., 1996) и изменяя гомеостаз Са в организме. Известно, что регуляция содержания Са в крови и костной ткани осуществляется несколькими гормонами, среди которых наиболее важными следует признать паратиреоидный гормон, кальцитонин, витамин Дз и эстрогены. Изменение содержания любого из них неизбежно вызывает нарушение кальциевого обмена. В частности, снижение уровня синтеза эстрогенов, например в менопаузу, приводит к нарушению процессов ремоделирования костной ткани и, как следствие, развитию остеопороза. Большое количество больных с такой патологией, не изученность влияния изменения уровня эстрогенов на морфофункциональное состояние С-клеток ЩЖ, обуславливает актуальность изучения механизмов регуляции функционирования С-клеток (Окороков А.Н., 2001). В настоящее время для лечения и профилактики постменопаузального остеопороза широко используются препараты кальцитонина, Са и эстрогенов (Риггз Б.Л., 2000). Однако, в виду недостаточности литературных данных (Greenberg С, 1986; Dick I.M., 1991; Saggese G., 1992) о причинах снижения секреции кальцитонина С-клеткими к моменту наступления менопаузы (Sekulic М., 1998; Hurley D.L., 1989; Deroisy R., 1989), гормональная и кальциевая терапия таких больных не всегда обоснована и часто не приводит к желаемому результату. Ввиду того, что данные о влиянии эстрогенов на С-клетки ЩЖ единичны и противоречивы, ответ на вопрос, как реагируют эти клетки на снижение уровня эстрогенов, в том числе на фоне лечения Са-содержащими или гормональными препаратами, поможет обоснованию корригирующей терапии для лечения остеопороза.
Известно, что поведение любых клеток при различных воздействиях связано с особенностями их происхождения и нм4іфйІА9ПШірмки в ходе онтогенеза. С-клеткам посвящен ряд иссредоведийіи«твКЛ'орьі| показаны
СПетер«я»г // "
} оэ witg-rggoj
изменения их морфологических характеристик в процессе онтогенеза, причем почти все эти исследования выполнены методами классической гистологии (Волкова О.В., 1976; Алешин Б.В., 1982, 1983; Архипенко В.И., 1983, Шадлинский В.Б., 1999). В то же время, для изучения механизмов и закономерностей дифференцировки, и получения новых научных фактов о характеристиках С-клеток ЩЖ в ходе онтогенеза, необходимо использование более информативных иммуногистохимических методов исследования.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучить динамику морфофункциональных изменений популяции С-клеток щитовидной железы в онтогенезе крысы и человека, а так же при свинцовой интоксикации у крыс и овариоэктомии у кроликов. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1 .Иммуногистохимически изучить экспрессию кальцитонина и нейронспецифической енолазы в С-клетках щитовидной железы человека и крысы в онтогенезе.
2.Исследовать влияние однократного введения нитрата свинца на экспрессию кальцитонина и нейронспецифической енолазы С-клеток щитовидной железы крысы.
З.Изучить влияние овариоэктомии на иммуногистохимические характеристики С-клеток щитовидной железы кроликов.
4.Изучить влияние препарата кальция с витамином Дд, в том числе на фоне введения эстрогенов, на С-клетки щитовидной железы кроликов при лечении экспериментального остеопороза.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены новые данные о появлении в онтогенезе нейронспецифической енолазы и кальцитонина в С-клетках щитовидной железы человека и крысы. На основании иммуногистохимической идентификации уточнены сроки появления дефинитивного фенотипа различных клеток щитовидной железы. Впервые получены доказательства реакции С-клеток щитовидной железы в ответ на интоксикацию нитратом свинца. Новыми следует признать данные о том, что после овариоэктомии, и при коррекции метаболических нарушений, вызванных ею, специфически изменяются размеры и иммуногистохимические характеристики С-клеток. Впервые продемонстрировано, что заместительная терапия эстрогенами и препаратами кальция с витамином Дз после овариоэктомии приводит к нормализации морфологических параметров С-клеток щитовидной железы кролика.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Проведенное исследование выявило морфологические закономерности развития щитовидной железы человека и крысы в пренатальном и постнатальном онтогенезе. Полученные в работе данные приближают нас к пониманию патогенеза некоторых заболеваний щитовидной железы, связанных с нарушениями функционирования С-клеток. Кроме того, результаты исследования могут оказаться полезными для травматологов при лечении спонтанных переломов костей в период менопаузы, данные работы * г.-
демонстрируют важную роль С-клеток щитовидной железы млекопитающих в поддержании гомеостаза Са в условиях свинцовой интоксикации и при уменьшении содержания эстрогенов. Полученные результаты будут иметь как несомненный теоретический интерес, так и практическое значение для гистологии, эмбриологии, травматологии, токсикологии и эндокринологии.
По материалам диссертации опубликовано 16 работ.
Взаимоотношения С-клеток с фолликулярным эпителием в щитовидной железе млекопитающих
До настоящего времени не понятно, почему С-клетки не организованы в отдельные эндокринные железы и компактные структуры, а дисперсно, отдельными клетками или малыми группами, располагаются в пространстве между тиреоидными фолликулами.
Локализацию С-клеток в центральной зоне обычно связывают с тем, что С-клетки вселяются в зачаток ЩЖ зародыша в области, которая в дальнейшем становится центральной зоной тиреоидной паренхимы [16, 17]. Но в этом распределении можно усмотреть другую закономерность: фолликулы центральной зоны тиреоидной паренхимы проявляют более высокую функциональную активность и значительно сильнее реагируют на тиреотропный гормон, чем периферические фолликулы, излишек коллоида в которых аккумулируется и может быть виден. Распределение такого типа, обычно описываемое у человека [159, 234], часто может быть найдено и у других млекопитающих, включая диких животных [226]. В частности, оно характерно для тех млекопитающих, которые проявляют специфически сезонные и репродуктивно зависимые циклы изменения гормональной активности [229]. В периферической области железы (так называемой зоне накопления), необычно большие фолликулы содержат уплотненный коллоид с большой концентрацией Тз и Т4 [218]. Установлено, что С-клетки редко встречаются в этих зонах у животных. Те же регионы ЩЖ, где С-клетки встречаются часто, не проявляют значительной аккумуляции коллоида. Следовательно, С-клетки преимущественно группируются в области повышенного функционирования фолликулов [6]. Возможно, это отражает участие С-клеток в механизмах локальной регуляции секреции фолликулярных клеток. Известно, что число С-клеток по отношению к объему фолликулярного эпителия в центральных зонах относительно высоко [8, 11, 53, 82, 156, 169]. В 80-е годы XX столетия это наблюдение явилось основой вывода о значении С-клеток, как фактора фолликулогенеза [11, 155]. Правда, некоторые авторы предлагали фолликулогенез рассматривать как механизм поддержания постоянного соотношения числа С-клеток на фолликул [22].
Связь активации С-клеток с усилением функциональной деятельности фолликулярного эпителия установлена в процессе реакции ЩЖ на действие многих тиреостатических веществ [6]. Под влиянием последних блокируется образование тиреоидного гормона, но так как взаимоотношения между ЩЖ и тиреотропной функцией гипофиза имеют характер отрицательной обратной связи, то в аденогипофизе усиливается секреция тиреотропина, а избыток последнего приводит фолликулярный аппарат ЩЖ в состояние функционального возбуждения (хотя и без отдачи в кровь тиреоидного гормона, образование которого блокировано). При этом количество С-клеток, выявленных в тиреоидной паренхиме, увеличивается, и одновременное повышение уровня кальцитонина подтверждает усиление их секреторной функции [6]. Но даже если секреторная активность С-клеток усиливается одновременно и параллельно с возрастанием функциональной активности фолликулярного эпителия, то С-клетки, являясь клетками нейрогенного происхождения, не должны испытывать зависимости от гипофиза, так как они сохраняются и продолжают активно функционировать после гипофизэктомии [6]. В этом случае механизмы возбуждения С-клеток при избыточном действии тиротропина должны объясняться какими-то другими причинами.
Не исключено, что определенное влияние на С-клетки может оказывать их непосредственный контакт с фолликулярными клетками. В качестве подтверждения этого предположения можно рассматривать электронно-микроскопические исследования [199], в которых описаны плотно связанные друг с другом структурные специфические комплексы, образованные фолликулярными и С-клетками. Предполагается, что в том же пространстве формируется базальная мембрана, впоследствии окружающая фолликул и отделяющая его от кровеносных сосудов [22, 174, 199]. Базальная мембрана частично составлена из ламинина синтезируемого тиреоцитами [144]. Нарушение контакта с мембраной, особенно с ламинином, происходящее при быстром увеличении числа С-клеток (например, при онкогенезе), приводит к нарушению их дифференцировки [144]. В то же время, факторы, стимулирующие рост паренхимы ЩЖ, не оказывают влияния на С-клетки [125].
Биохимические методы исследования при экспериментальном остеопорозе
Для выявления клеток паренхимы ЩЖ человека и млекопитающих в норме, а так же при экспериментальном воздействии НС на ЩЖ крыс и экспериментальном остеопорозе у кроликов проводили иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов ЩЖ срезов моноклональными и поликлональными антителами [36]. С-клетки выявляли с помощью антител против кальцитонина (поликлональных для исследуемой ткани крысы и кролика и моноклональных - для человека) и НСЕ. Тиреоциты выявляли антителами против тиреоглобулина. Для выявления зачатка ЩЖ на ранних сроках пренатального онтогенеза человека парафиновые серийные срезы ЩЖ эмбрионов окрашивали антителами к цитокератинам № 7, № 19 и виментину. Для изучения пролиферации клеток паренхимы ЩЖ человека и млекопитающих в норме, а также при экспериментальных воздействиях НС на ЩЖ крыс проводили иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов ЩЖ на ядерный антиген пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA). В настоящее время именно иммуногистохимическое окрашивание с применением моноклональных антител к PCNA является Исследования выполнены совместно с к.б.н., с.н.с. ІШИЛ КГМУ Валеевой И.Х. наиболее удобным, дающим наилучшие результаты методом изучения пролиферации [180]. При изучении экспериментального воздействия НС на ЩЖ крыс использовали непрямой иммунопероксидазный метод.
При изучении ЩЖ в процессе онтогенеза у человека и крысы и при экспериментальном остеопорозе у кроликов применяли меченый пероксидазой стрептавидин-биотиновый метод с использованием LSAB-kit. Контроль специфичности иммуногистохимической реакции проводили путем замены первых антител неимунной сывороткой мыши или кролика. Ниже приведена таблица использованных в работе антител и подробные протоколы иммуногистохимических методов. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали, после чего помещали в 0,05 М ТБС (физиологический раствор Трис-НС1 забуференный буфером, рН-7,6). Блокировали эндогенную пероксидазную активность, помещая срезы на 20 мин в стакан с 1% раствором перекиси водорода. Промывали в ТБС. Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали на срезы 5% неимунную сыворотку животного - донора вторых антител. Инкубировали во влажной камере 30 мин. Удаляли сыворотку и, не промывая в ТБС, раскапывали на срезы первичные антитела в рабочем разведении. Инкубировали во влажной камере 30-60 мин (в зависимости от используемых антител) при комнатной температуре. Промывали в трех сменах ТБС. Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали вторичные антитела (конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против Ig животного -донора первичных антител). Инкубировали 30 мин во влажной камере. Промывали в трех сменах ТБС. При выявлении пероксидазной активности в качестве хромогена использовали 3-аминоэтил карбазол (АЭК) с 1% перекисью водорода в 0,1 М ацетатном буфере (рН-5,0). Инкубировали 5-Ю мин.
Промывали в воде, докрашивали ядра гематоксилином и заключали срезы в глицерин-желатину. Проводили депарафинирование и регидратацию срезов, из воды стекла со срезами помещали в ТБС. Переносили стекла со срезами на 20 мин в 1% раствор перекиси водорода. Промывали в ТБС. Удаляли излишки жидкости со стекла, раскапывали блокирующий реагент (bloking reagent) и инкубировали 5 мин во влажной камере. Не промывая в ТБС, удаляли блокирующий реагент и раскапывали приготовленные в рабочем разведении первичные антитела. Инкубировали 30-60 мин (в зависимости от используемых антител) во влажной камере. Промывали в трех сменах ТБС. Раскапывали связывающие антитела (смесь биотинилированных антител) к Ig мыши и кролика. Инкубировали мин. Промывали в трех сменах ТБС. Раскапывали конъюгированный с пероксидазой стрептавидин и инкубировали 20 мин. Промывали в трех сменах ТБС. Проводили выявление пероксидазной активности с раствором АЭК в течение 5-10 мин. Промывали в воде, ядра докрашивали гематоксилином и заключали срезы в глицерин-желатину. Окрашивание проводили стрептавидин-биотиновым методом. Специфика данной процедуры окрашивания заключалось в том, что данные антигены могли быть выявлены только после предварительной демаскировки методом HIAR (Heat-Induced Antigen Retrieval) [233, 134, 158, 103, 260]. Стекла раскладывали в пластиковый контейнер, который помещали в 0,01 М цитратный буфер (рН-6,0) и кипятили 30 мин, затем выдерживали в том же буфере еще 15 мин и переносили в ТБС. Срезы инкубировали 20 мин с 5% сывороткой кролика, а потом с атителами с использованием LSAB-kit. Проводили выявление пероксидазной активности с раствором АЭК в течение 5-15 мин. Промывали в воде, ядра докрашивали гематоксилином и заключали срезы в глицерин-желатину.
Исследование фенотипических изменений клеток щитовидной железы в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе крысы
В клетках паренхимы пренатальной и постнатальной ЩЖ крысы от 16-го дня гестации и до 28-го дня жизни наблюдали высокая пролиферативная активность (рис. 4). Морфометрический анализ клеток, иммуннореактивных по PCNA, позволил установить волнообразный характер периодов репликации ДНК с пиками максимальной активности, которые были выявлены на 18-й день гестации (рис. 5), у новорожденных, 10-й и 25-й дни жизни крысят (рис. 6). За всплесками пролиферации следовало увеличение числа клеток паренхимы на единицу площади (рис. 4). Понятно, что в столь быстро растущем организме пролиферация должна быть высокой. Но волнообразный характер этого процесса на фоне выраженного увеличения числа клеток паренхимы, видимо должен отражать определенные этапы в процессе становления и роста ЩЖ. Возможно, всплески пролиферативной активности необходимы для создания клеточной массы и используются организмом для перевода части клеток в иное состояние - к частичной или полной дифференцировке составляющих железу клеточных типов. Используя антитела к клеточным маркерам ЩЖ (тиреоглобулину, кальцитонину и НСЕ) нами была изучена закономерность экспрессии этих маркеров в ходе пренатального и раннего постнатального онтогенеза крысы [77].
Первые немногочисленные клетки, позитивные по тиреоглобулину, а значит синтезирующие его в ЩЖ, зафиксированы нами у семнадцатидневного плода крысы по периферии ЩЖ (рис. 7 А). К 18-му дню тиреоглобулинпозитивными клетками был занят уже весь центр эмбриональной ЩЖ (рис. 7 Б). В дальнейшем, до 20-го дня гестации происходило последовательное увеличение числа клеток, содержащих тиреоглобулин, и распространение их по всем областям паренхимы ЩЖ. Но весь этот период времени тиреоциты фолликулы не формировали, и тиреоглобулин находился только в цитоплазме клеток (рис. 8, 9). Первые фолликулы появились лишь на 21-й (0) день пренатального развития (рис. 10). Но с 1-го по 5-й день жизни число фолликулов было меньше, чем на предыдущем сроке, то есть на момент рождения (рис. 11). К 10-му дню жизни фолликулярная структура ЩЖ полностью восстанавливалась, а к 17-18 дням уже наблюдалось разделение фолликулярного эпителия на центральную и периферическую зоны с заполненными тиреоглобулином фолликулами (рис. 12). После 25-го дня слабая экспрессия тиреоглобулина появилась в центральной зоне железы, но по периферии крупные и полностью сформированные фолликулы окрашивались очень интенсивно (рис. 13).
Таким образом, тиреоциты начали синтезировать тиреоглобулин на 17-й день гестации, а формирование фолликулов произошло значительно позже, лишь на 21-й (0) день развития. Формирование фолликулов повлекло за собой появление пока еще не заполненных фолликулярным содержимым пространств, что привело к уменьшению количества клеток паренхимы на единицу площади (рис. 4). С 1-го по 5-й дни жизни фолликулярные клетки ЩЖ крысят, очевидно, находились в таком функциональном напряжении, адаптируясь к новым условиям среды, что почти все фолликулы утратили свою структуру. Усиленно высвобождая в кровоток тиреоидные гормоны, что связано с повышением потребности в них организма, часть тиреоцитов просто гибла [23]. Десквамация эпителия на этом сроке была показана ранее и для С-клеток, в частности, было обнаружено, что в период новорожденности у крыс очень низкий уровень кальцитонина в плазме крови, который повышается почти вдвое в первые часы жизни [151]. Результаты других исследователей подтверждают, что ЩЖ новорожденных лишь в 1/5 всех случаев имеет структуру, сходную с микроструктурой взрослого организма, во всех остальных случаях в ней встречаются участки десквамации эпителия, иногда весьма значительные [23].
Таким образом, восстановление фолликулярного строения ЩЖ произошло на 10-й день жизни, а окончательное восстановление структуры паренхимы ЩЖ с разделением на центральную и периферическую зоны произошло на 17-18 дни жизни, и на этом, видимо, становление фолликулярного эпителия, можно считать заканченным.
Изучение С-клеток щитовидной железы кроликов при эксперимен тальном остеопорозе
Первичные изменения эндокринной функции яичников, развивающиеся в менопаузе, заключаются в снижении секреции эстрогенов и прогестерона. Синтез и секреция эстрогенов в яичниках находятся под контрольным влиянием со стороны гормонов передней доли гипофиза и, в частности, ФСГ. ФСГ - гипофизарный гормон, гликопротеид, состоящий из двух субъединиц. Его продукция активируется фоллиберином. Ингибитор образования фоллиберина - эстрогены (отрицательная обратная связь). Чем меньше в крови эстрогенов, тем больше вырабатывается ФСГ, и наоборот. Орган-мишень у самок - яичники, где ФСГ инициирует развитие фолликулов, клетки внутреннего слоя которых продуцируют эстрогены. Последние, по принципу отрицательной обратной связи, тормозят продукцию фоллиберина, а, следовательно, и ФСГ. В эксперименте в качестве контроля успешности проведенной овариоэктомии и, как показатель снижения уровня эстрогенов нами была изучена динамика уровня ФСГ в сыворотке крови. В контрольной группе интактных животных средний показатель уровня ФСГ был равен 0,45±0,05 МЕд/л. Овариоэктомия привела к снижению уровня эстрогенов в сыворотке и, как следствие, к постепенному повышению уровня ФСГ, который через 3 недели после овариоэктомии составил 0,96±0,06 МЕд/л (р 0,05) (табл. 3). Через 6 недель после операции уровень ФСГ у животных поднялся до 1,17±0,07 МЕд/л. Повышение уровня ФСГ у прооперированных животных можно рассматривать как следствие падения концентрации эстрогенов в результате овариоэктомии. У животных, не получивших в дальнейшем заместительной терапии (группа А), уровень ФСГ продолжал повышаться, и к 30-й неделе эксперимента вырос до 1,88±0,1 МЕд/л. При проведении корригирующей терапии только препаратами Са (группа В) уровень ФСГ к 30-й неделе (22-я неделя от начала лечения) повысился до 1,29±0,1 МЕд/л, что значительно превысило нормальный показатель ФСГ. При проведении корригирующей терапии препаратами Са и гормональным препаратом (группа С) наблюдали достоверное снижение уровня ФСГ уже к 12-й неделе эксперимента и дальнейшее снижение его до 0,40±0,05 МЕд/л к 30-й неделе после овариоэктомии (22-я неделя терапии), что соответствовало предоперационному показателю. Таким образом, динамика изменения уровня ФСГ в сыворотке животных, подвергшихся овариоэктомии, позволяет нам сделать заключение о развитии гипоэстрогенемии, которая может быть коррегирована только гормональными препаратами. Наличие гипоэстрогенемии позволяет сказать, что в результате овариоэктомии нами были созданы условия для развития у животных остеопороза, подобного постменопаузальному остеопорозу.
Достаточно показательным критерием развития остеопороза, и, как следствие, изменения кальциевого обмена являются полученные нами данные по динамике изменения концентрации Са в сыворотке крови и моче кроликов (табл. 4). У овариоэктомированных животных уровень Са в сыворотке крови и мочи к 6-й неделе после овариоэктомии постепенно повысился в среднем до 2,47±0,67 мМ/л и 1,18±0,18 мМ/л соответственно. В дальнейшем в группе А, где экспериментальные животные не получали корригирующей терапии, уровень Са продолжал повышаться и к 30-й неделе достиг 3,44±0,13 мМ/л в сыворотке крови и 2,14±0,85 мМ/л в моче. В группе В после начала терапии препаратом С, уровень Са в крови поднялся до 3,5±0,23 мМ/л, а в моче повысился более, чем в 3 раза (2,25±0,43 мМ/л) к 30-й неделе после операции (или к 22-й неделе от начала лечения). У животных группы С, в которой после овариоэктомии через 8 недель начали корригирующую терапию препаратом Са и гормональным препаратом, отмечалось резкое снижение концентрации Са в крови до 1,47±0,06 мМ/л и 1,69±0,16 мМ/л (что соответствует норме) к 20-й и 30-й неделям (12-й и 22-й неделям от начала лечения) соответственно. Уровень Са в моче так же снизился к 30-й неделе эксперимента до нормальной концентрации - 0,75±0,25 мМ/л. Таким образом, повышение уровня Са в сыворотке крови на фоне дефицита эстрогенов объясняется тем, что падает активность остеобластов, зависящая от уровня циркулирующих в крови эстрогенов [66]. Неизмененная же активность остеокластов приводит к выходу Са из костной ткани в кровь. Повышение уровня Са в крови является компенсаторной реакцией, поскольку на фоне низкого уровня эстрогенов снижается абсорбция Са в тонкой кишке и усиливается экскреция Са с мочой [66]. Известно, что витамин Д3 усиливает всасывание Са в тонкой кишке и усиливает реабсорбцию Са в канальцах нефрона. Таким образом, у животных, получавших Са и витамин Дз, можно было ожидать уменьшения дефицита и потери Са организмом. Однако мы обнаружили, что на фоне повышения концентрации Са в крови (может быть за счет усиления всасывания в тонкой кишке) так же происходило усиление выведения Са с мочой, несмотря на то, что витамин Д3 должен был уменьшить этот процесс. Только при комплексной терапии и нивелировании недостатка эстрогенов происходит постепенное восстановление концентрации Са в сыворотке крови и в моче до значений, характерных для дооперационного периода. По данным последних исследований, эстрогены могут оказывать прямое влияние на захват Са клетками двенадцатиперстной кишки [66]. В исследованиях, посвященных изучению реакции С-клеточной популяции, приводятся противоречивые данные об изменении количества С-клеток в ЩЖ, а так же синтеза и секреции кальцитонина в ответ на дефицит или избыток эстрогенов [95, 135, 223, 250]. Одним из системных факторов, поддерживающих гомеостаз Са, является кальцитонин экспрессируемый С-клетками ЩЖ, и не вызывает сомнений, что именно он будет выбран в качестве маркера этих клеток в подобных исследованиях. Фактически, проводя иммуногистохимическое окрашивание с целью идентификации и последующей морфометрии клеток, мы выявляем специфический продукт, накапливаемый или синтезируемый в этих клетках, и по нему оцениваем наличие, а также размеры и другие свойства клеток.
