Введение к работе
Актуальность проблемы. Дендритные клетки (ДК) человека являются объектом интенсивного изучения как со стороны клеточных биологов и иммунологов, так и ученых, специализирующихся в области клинических исследований. Это обусловлено центральной ролью ДК в функционировании иммунной системы и возможностью их использования в терапевтических целях. Исключительные свойства ДК, как наиболее специализированных антигенпрезентирующих клеток в организме, проявляются в выраженной способности к инициации адаптивных иммунных реакций. Именно поэтому использование ДК в качестве «природных адьювантов» белковых антигенов находит все большее применение в различных направлениях клеточной иммунотерапии (Shortman and Caux, 1997; Steinman and Dhodapkar, 2001; Figdor et al., 2004).
В настоящее время ДК расцениваются как гетерогенная популяция антигенпрезентирующих клеток, широко распространенных в различных тканях организма, и непосредственно контролирующих развитие первичного иммунного ответа (Hart, 1997). Первоначальное взаимодействие ДК с наивными Т-лимфоцитами является ключевым событием индукции клеточного звена иммунитета и определяет направление будущего антигенспецифичского ответа. ДК способствуют дифференцировке специфических клонов Т-хелперов и эффекторных Т-лимфоцитов, действие которых направлено на уничтожение патогенных возбудителей, а также собственных клеток, зараженных вирусами, или претерпевших опухолевую трансформацию. С другой стороны, многочисленные данные указывают на то, что в зависимости от физиологических условий ДК могут осуществлять не только позитивную, но и негативную регуляцию иммунитета (Steinman et al., 2003). Толерогенные эффекты ДК могут проявляться в индукции анергии Т-лимфоцитов либо в индукции дифференцировки Т-регуляторных клеток, что необходимо для поддержания периферической толерантности иммунной системы к аутологичным антигенам (Adler and Steinbrink, 2007).
Пластичность функциональной активности ДК позволяет использовать их для создания терапевтических клеточных вакцин с целью коррекции иммунодепрессивньгх или аутореактивных состояний иммунной системы. Варьируя условия in vitro, можно получать иммуностимулирующие ДК для лечения
онкологических и хронических инфекционных заболеваний или иммунорегуляторные ДК - для лечения аутоиммунных заболеваний и улучшения приживления аллотрансплантатов. Есть основания полагать, что ключевым показателем, определяющим по какому из двух путей пойдет иммунологический процесс, является степень зрелости ДК (МогеШ, 2006). Таким образом, учитывая сложность и разнонаправленность проявляемых ДК иммунологических эффектов, чрезвычайно актуальным является изучение механизмов, обеспечивающих их стимулирующее или регуляторное действие.
Современные высокопроизводительные методы молекулярной и клеточной биологии дают возможность проводить комплексную оценку иммунологических свойств ДК. Анализ экспрессии генома ДК позволяет определить гены, продукты которых обеспечивают их функционирование. На основе таких данных могут быть выявлены маркеры функционального состояния ДК и мишени для их фармакологической регуляции. Все это позволит повысить эффективность проводимой иммунотерапии клеточными вакцинами на основе ДК.
Целью настоящей работы явился сравнительный анализ in vitro функциональных особенностей незрелых и зрелых ДК, а также поиск различий в профилях их генной экспрессии.
Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:
-
Отработать воспроизводимый метод дифференцировки и созревания ДК в культуре.
-
Изучить способность незрелых и зрелых ДК стимулировать иммунологические реакции в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами.
-
Сравнить негативные иммунорегуляторные свойства, проявляемые ДК на разных стадиях созревания in vitro.
-
Сравнить фагоцитарную активность незрелых и зрелых ДК. Оценить возможность использования микро- и наноразмерных синтетических частиц для мечения и доставки антигенов внутрь ДК.
-
Изучить влияние секреторных факторов мезенхимальных стволовых и раковых клеток на созревание ДК.
6. Охарактеризовать дифференциальный профиль генной экспрессии незрелых и зрелых ДК.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было показано, что основным механизмом иммунорегуляторного действия незрелых ДК в смешанной культуре является индукция анергии Т-лимфоцитов, а не дифферешщровки Т-регуляторных клеток.
При помощи проточной ціггофлуориметріш и флуоресцентной микросколии была впервые выявлены разшиия между' механизмами поглощения микро- и наноразмерных частиц ДК, а также продемонстрирована возможность применения флуоресцентных наночастиц Quantum dots для мечения и визуализации ДК в организме.
Кроме того, впервые был проведен сравнительный полногеномный транскриптомный анализ экспрессии генов незрелых и зрелых ДК, полученных в результате стимуляции созревания комбинацией TNF-a и PGE2. Транскриптомный анализ выявил в незрелых ДК экспрессию ряда иммунорегуляторных генов. Были найдены определенные различия между профилями генной экспрессии незрелых ДК и описанных в литературе другими авторами толсрогенных ДК.
Практическая ценность полученных результатов заключается в возможности их применения на различных этапах создания и проведения доклинических исследований индивидуальных клеточных вакцин, направленных на лечение онкологических, хронических инфекционных или аутоиммунных заболеваний.
Дтя изучения условий созревания ДК в настоящем исследовании был разработан метод получения и оценки чистоты первичных культур раковых клеток, основанный на измерении уровней экспрессии поверхностных маркеров CD24, CD70 и CD90. Этот метод должен найти свое применение в биомедицинских исследованиях рака почки для отделения раковых клеток от клеток стромы.
Кроме того, на основании полученных в ходе транскриптомного анализа профилей экспрессии генов возможна разработка новых фармакологических препаратов для регуляции функций ДК в рамках проведения имигунотерапии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5,6,7-й ежегодных конференциях «Стволовые клетки и перспективы их использования в
здравоохранении» в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 2006-2008), на конференции «BD FACS User's Meeting» (Петрозаводск, 2007), на Всемирном конгрессе «HUPO 2008 7th World Congress» (Амстердам, 2008), на 4-й Международной конференции "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine" (Москва-Нижний Новгород-Москва, 2008), а также на Конференции молодых ученых в ФГУ НИИ ФХМ Росздрава (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ: 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 публикации в материалах научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 201 источник. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 24 рисунка и 3 таблицы.
