Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Патология сосудистой стенки 12
1.1.1. Заболевания артерий и их этиология 12
1.1.2. Клетки сосудистой стенки и их участие в реакциях на повреждение 14
1.1.2.1. Роль эндотелия в патологических изменениях сосудистой стенки 17
1.1.2.2. Роль клеток субэндотелиального слоя артерий в развитии 24 поражений сосудистой стенки
1.1.2.3. Роль макрофагов в формировании изменений сосудистой стенки 27
1.1.3. Значение процессов клеточной гибели в развитии патологии сосудистой стенки
1.1.4. Использование моделей для изучения функциональных особенностей клеток, участвующих в патологическом ремоделировании сосудистой стенки
1.2. Фотодинамическое воздействие 38
1.2.1. Понятие фотодинамического воздействия и его компоненты 38
1.2.2. Механизмы фотодинамического воздействия 40
1.2.3. Взаимодействие фотосенсибилизаторов и продуктов их активации с 44 клетками-мишенями
1.2.4. Проблемы и преспективы использования фотодинамического 49 воздействия для диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний
Глава 2. Материалы и методы исследований 53
2.1. Используемое оборудование, материалы и реактивы 53
2.1.1. Оборудование 53
2.1.2. Химические реагенты 5 3
2.1.3. Антитела 54
2.1.4. Клеточные культуры 54
2.2. Приготовление сред для культивирования клеток 56
2.2.1. Приготовление полной среды 56
2.2.2. Приготовление среды для культивирования эндотелиальных клеток 56
2.2.3. Приготовление среды для криоконсервации клеток
2.3. Выделение и культивирование клеток сосудистой стенки человека 56
2.3.1. Получение первичной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека
2.3.2. Получение первичной культуры эндотелиальных клеток аорты человека
2.3.3. Получение первичной культуры клеток субэндотелиального слоя аорты человека
2.3.4. Получение первичной культуры МСК из жировой ткани человека 58
2.3.5. Выделение лейкоцитов из периферической крови человека и получение первичной культуры макрофагов
2.3.6. Пассирование культивируемых клеток 60
2.3.7. Криоконсервация культивируемых клеток 60
2.4. Методы исследования 61
2.4.1. Определение накопления и выведения Фотосенса клетками 61
2.4.2. Определение накопления Протопорфирина IX клетками 62
2.4.3. Фотодинамическое воздействие на клетки сосудистой стенки 62
2.4.4. Проточная цитофлуориметрия 63
2.4.5. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 63
2.4.6. Выявление активных форм кислорода в клетках 65
2.4.7. Выявление апоптотических и некротических клеток 65
2.4.8. Определение жизнеспособности клеток методом МТТ-теста 66
2.4.9. Выявление митохондрий и лизосом 67
2.4.10. Изучение адгезии лейкоцитов периферической крови к эндотелию 67
2.4.11. Определение фагоцитарной активности макрофагов 67
2.4.12. Определение активности матриксных металлопротеиназ-2, 9 68
2.4.13. Исследование количественного содержания цитокинов в среде культивирования
2.5. Активированный эндотелий: клеточная модель и ее характеристика 70
2.6. Статистическая обработка результатов 71
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Изучение эффектов фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса на клетки сосудистой стенки
3.1.1. Накопление Фотосенса клетками сосудистой стенки 74
3.1.2. Выведение Фотосенса клетками сосудистой стенки
3. Влияние компонентов фото динамического воздействия на клетки сосудистой стенки
4. Клеточные эффекты фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса
5. Влияние дозы облучения при фото динамическом воздействии на механизм гибели клеток сосудистой стенки
Изучение влияния фотодинамического воздействия низкой интенсивности на функциональные свойства клеток сосудистой стенки
1. Влияние низких доз фотодинамического воздействия на жизнеспособность клеток сосудистой стенки
2. Влияние фотодинамического воздействия низкой интенсивности на адгезивные свойства эндотелиальных клеток
3. Функциональная активность макрофагов после фотодинамического воздействия низкой интенсивности
Сравнение эффектов фото динамического воздействия с использованием Фотосенса, Фталосенса и 5-аминолевулиновой кислоты на клетки сосудистой стенки
1. Накопление Протопорфирина IX в клетках сосудистой стенки 116
2. Влияние фотодинамического воздействия с использованием различных фотосенсибилизаторов на жизнеспособность клеток сосудистой стенки
Заключение 129
Выводы 133
Практические рекомендации 13 5
Список литературы
- Заболевания артерий и их этиология
- Химические реагенты
- Исследование количественного содержания цитокинов в среде культивирования
- Влияние компонентов фото динамического воздействия на клетки сосудистой стенки
Введение к работе
Актуальность проблемы
Фотодинамическое воздействие (ФДВ) - неинвазивный двухкомпонентный метод, одним элементом которого является фотосенсибилизатор - вещество, повышающее чувствительность биологических тканей к свету, а другим - низкоинтенсивное лазерное излучение. В результате взаимодействия фотосенсибилизатора и света определенной длины волны происходит образование активных форм кислорода (АФК), которые, как известно, являются цитотоксичными агентами, вызывающими структурные повреждения клеток и приводящими к их гибели [Гельфонд, 2007; Castano, Demidova and Hamblin, 2004].
Метод ФДВ был впервые описан в 60-х годах XX века и с тех пор активно применяется в клинической практике для лечения онкологических и некоторых воспалительных (ревматоидный артрит, акне, псориаз и др.) заболеваний [Миронов, 1996; Странадко, 2002; Чиссов, Соколов, Булгакова и Филоненко, 2003; Толстых, Дербенев, Кулешов и др., 2008; Жилова, Бутарева и Волнухин, 2010]. При этом эффективная элиминация опухолевых клеток основана на селективном накоплении в них фотосенсибилизатора за счет более высокой метаболической активности по сравнению с окружающими здоровыми клетками. Наличие погибших клеток и их фрагментов индуцирует процесс естественной тканевой репарации, заключающийся в элиминации разрушенного клеточного материала и представляющий собой последовательные фазы воспалительной реакции. Возможность запуска аналогичных изменений в очагах поражений сосудистой стенки создает предпосылки для использования этого подхода для предотвращения дальнейшего развития патологического процесса.
В последние годы был проведен ряд успешных доклинических исследований по лечению пациентов со стенозами периферических артерий с помощью ФДВ [Jenkins, Buonaccorsi, Raphael et al., 1999; Mwipatayi, Hockings, Hofman et al., 2008]. При попытках применения этого подхода для регрессии атеросклеротических поражений следует учитывать, что, в отличие от рестенозов, подобные патологические изменения артерий человека - результат сложного взаимодействия различных типов клеток: моноцитов-макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток, эндотелия, гладкомышечных и субэндотелиальных стромальных клеток. Кроме того, в атеросклеротических поражениях нельзя однозначно указать клетки-мишени для ФДВ, так как одни и те же клетки, в зависимости от фазы атеросклеротического поражения, могут выполнять разнонаправленные функции (макрофаги - фагоцитоз липидов vs. синтез ферментов, разрушающих соединительную ткань). С другой стороны, в отличие от опухолей, в случае атеросклеротических поражений или рестенозов,
не ставится задача полной ликвидации какого-либо типа клеток. Достаточно приостановить интенсивность процесса, например, за счет снижения фагоцитарной активности макрофагов или пролиферативной активности субэндотелиальных стромальных клеток интимы.
Одной из проблем применения ФДВ является отсутствие «идеального» фотосенсибилизатора - все фотоактивные вещества, разрешенные в настоящее время к клиническому применению (порфирины, фталоцианины, хлорины и др.), обладают рядом недостатков (неоднородный химический состав, малая селективность накопления в клетках-мишенях, длительная повышенная кожная фоточувгтвительность и др.). В связи с этим остро встает вопрос о разработке новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами, отвечающих современным требованиям: наличие интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области спектра (650 нм < X < 800 нм), высокий квантовый выход триплетного состояния, постоянный химический состав, высокая селективность накопления в тканях-мишенях, быстрое выведение из организма, низкая токсичность, устойчивость при хранении и введении в организм. К таким перспективным красителям относят Фталосенс (новый фотосенсибилизатор ряда фталоцианинов) и про-фотосенсибилизатор 5-аминолевулиновую кислоту.
Таким образом, гетерогенность клеточной популяции сосудистой стенки, а также отсутствие «идеальных» фотоактивных веществ диктуют необходимость проведения специальных исследований, посвященных изучению участия различных клеток в процессах, которые могут происходить после ФДВ в артериальной стенке, адаптации имеющихся и поиску новых фотосенсибилизаторов, а также оптимизации условий ФДВ для применения при патологии сосудов.
I Цель и задачи исследования
Целью данной работы является изучение эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки в модели in vitro.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи1.
-
разработать тест-систему для изучения эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки in vitro;
-
изучить динамику накопления и выведрния фотосенсибилизатора Фотосенс в макрофагах, эндотелиальных и субэндотелиальных стромальных клетках человека;
-
изучить влияние фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса и его компонентов на клетки сосудистой стенки человека;
-
исследовать влияние дозы фотодинамического воздействия на механизм клеточной гибели;
-
проанализировать влияние фотодинамического воздействия на функциональные свойства клеток сосудистой стенки;
-
сравнить эффекты фотодинамического воздействия с использованием экзогенных фотосенсибилизаторов и про-фотосенсибилизатора на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки человека.
Научная новизна
Впервые проанализировано влияние фотодинамического воздействия (ФДВ) с использованием двух фотосенсибилизаторов (Фотосенс и Фталосенс) и одного про-фотосенсибилизатора (5-аминолевулиновая кислота) на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки» которые играют важнейшую роль в формировании поражений сосудистой стенки.
Получены новые данные, свидетельствующие о различной чувствительности клеток сосудистой стенки к ФДВ. Впервые показано, что цитотоксический эффект ФДВ определяется не только способностью клеток сосудистой стенки накапливать Фотосенс, но и их функциональными особенностями, в частности, возможностью индукции в них активных форм кислорода. Установлено, что активация эндотелия увеличивает его устойчивость к ФДВ.
Впервые изучены эффекты низкоинтенсивного ФДВ на функциональные особенности клеток сосудистой стенки. Показано, что при использовании низких доз ФДВ (0,25 Дж/см2) происходит уменьшение экспрессии основных молекул межклеточной адгезии эндотелиальных клеток (VCAM-1 и Е-селектина), а также значительно снижается адгезия мононуклеаров к TNFct-активированному эндотелию. Впервые установлено, что ФДВ низкой интенсивности сопровождается снижением фагоцитарной активности макрофагов, уменьшением активности секретируемых ими матриксных металлопротеаз-2 и -9 и снижением уровня секреции интерлейкина-8, что свидетельствует об антивоспалительном воздействии низких доз ФДВ.
Впервые показано, что ФДВ с использованием 5-аминолевулиновой кислоты может обеспечить селективную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток интимы. Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что среди выбранных фотосенсибилизаторов ФталосенсС позволяет наиболее эффективно регулировать численность клеток сосудистой стенки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанная модель для изучения эффектов ФДВ in vitro позволяет подбирать и оптимизировать условия воздействия на различные клетки для выполнения экспериментальных и клинических задач. Выявлены механизмы реализации ФДВ различной интенсивности в эндотелиальных клетках, макрофагах и субэндотелиальных стромальных клетках. Данные, полученные в работе, существенно дополняют представления о влиянии ФДВ на клетки сосудистой стенки, а также позволяют расширить область применения этого метода.
Результаты исследования могут стать основой для предклинических испытаний, направленных на апробацию ФДВ в качестве одного из новых методов функциональной диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
-
Фотодинамическое воздействие с использованием Фотосенса позволяет эффективно элиминировать клетки сосудистой стенки, чувствительность которых к этому воздействию in vitro увеличивается в ряду макрофаги - субэндотелиальные стромальные клетки -эндотелиальные клетки и определяется их функциональными свойствами.
-
В условиях in vitro низкоинтенсивное фотодинамическое воздействие с использованием Фотосенса оказывает противовоспалительный эффект на клетки сосудистой стенки, значительно модифицируя их функциональные свойства, что выражается в уменьшении их способности к адгезии, снижении фагоцитарной и секретирующей (матриксные металлопротеиназы-2, -9) активности.
-
Использование различных фотосенсибилизаторов позволяет оптимизировать условия воздействия в зависимости от поставленных задач: фотодинамическое воздействие с использованием 5-аминолевулиновой кислоты обеспечивает избирательную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток, в то время как Фталосенс-ФДВ вызывает тотальную гибель всех клеток сосудистой стенки.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации были доложены и обсуждены на: 7-й - 9-й Конференциях молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных дню Космонавтики (Москва, 2008, 2010); 7-й Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, Москва, 2009); 5-й Конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); 8-й Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва,
2010); 28*, 29th ASLMS Annual Conference (USA, Kussimmee, 2008; Washington DC, 2009); 15th International Symposium on Atherosclerosis (Boston, 2009); 23th International Congress Laser Medicine Laser Florence 2009 (Florence, Italy, 2009); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 9th WALT Congress (Bergen, Norway, 2010); межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН 17.01.2011 г.
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 30.11.2010 г.
Связь работы с научными программами
Работа выполнена при частичной поддержке гранта МНТЦ № 2579, гранта РФФИ № 07-04-01504а и Госконтракта Минобрнауки № 02.518.11.7141.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 160 страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит из 289 цитируемых источников, из которых 42 - на русском и 247 - на иностранном языке.
Заболевания артерий и их этиология
В процессе атерогенеза ЭК начинают синтезировать ингибитор активатора плазминогена, который смещает равновесие в сторону тромбоза, что способствует прогрессированию поражений сосудистой стенки. В атеросклеротических поражениях эндотелий не только выстилает поверхность бляшки, но и оказывается вовлеченным в ангиогенез в районе утолщения, обеспечивая васкуляризацию ткани, расположенной в глубине крупных бляшек [O Brien, Garvin, Stewart et al., 1994]. Кроме того, ЭК способны модифицировать (окислять) ЛНП после их связывания с рецепторами и в процессе трансцитоза через везикулы от просвета артерии в субэндотелиалыюе пространство [Steinbrecher, Parthasarathy, Leake et al., 1984]. Таким образом, эндотелий может не только играть ключевую роль в поддержании гомеостаза сосуда, функционируя как интактный монослой на поверхности бляшки, но и влиять на прогрессирование поражения. Нарушения его нормальной функции оказываются решающим фактором в индуцировании и течении атеросклероза.
Помимо ЭК важнейшую роль в развитии патологии стенки артерий играют клетки крови. Мф широко представлены на всех стадиях поражения сосудистой стенки и являются главными клеточными воспалительными медиаторами в этом процессе [Ross, 1993]. Мф - основные клетки, накапливающие липиды и выполняющие функцию скэвенджер-клеток. Как и ЭК, макрофаги способны модифицировать ЛНП, используя генерацию N0, перекисное окисление липидов и синтез липоксигеназы [Rosenfeld, Khoo, Miller et al., 1990]. Кроме того, они вырабатывают цитокины и факторы роста, частично управляющие реакциями Т-клеток, других макрофагов, эндотелия и ГМК. Макрофаги могут вырабатывать различные матриксные металлопротеазы и другие ферменты, что играет важную роль в генезе заболевания. Таким образом, макрофаги моноцитарного происхождения играют решающую роль в развитии патологии сосудистой стенки в качестве преобразователей липопротеидов и источника вазоактивных и хемотаксических веществ, цитокинов и литических ферментов. Способность изменять и оптимизировать функцию макрофагов может явиться ключевым моментом в контроле атерогенеза.
При исследовании клеточных механизмов ремоделирования стенки артерий не стоит забывать о ГМК и субэндотелиальных стромальных клетках, аккумуляция которых имеет огромное значение в развитии гиперплазии интимы, прогрессировании поражений и образовании фиброзных бляшек. Так, межклеточные взаимодействия при патологической перестройке сосудистой стенки существенно изменяют миграционную, пролиферативную и синтезирующую способность этих клеток [Thyberg, Hedin, Sjolund et al., 1990]. В области поражения ГМК не только активно пролиферируют, но и являются главным источником соединительной ткани. К формированию фиброзной бляшки приводят эксцентрическое аномальное накопление их в интиме одновременно с нарастанием количества макрофагов и Т-лимфоцитов, аккумуляцией некротических масс, обызвествлением и появлением «vasa vasorum» («сосуды сосудов»).
Кроме того, в последние годы было показано, что в развитии патологии сосудистой стенки могут участвовать не только дифференцированные клетки, но и клетки-предшественники. Согласно этим исследованиям, костномозговые клетки-предшественники могут принимать участие в новообразовании интимы при экспериментальной аллотрансплантации органов [Hillebrands, Klatter, Hurk et al., 2001], после механического повреждения сосудов [Ильинская, Кудряшова, Антропова и др., 2003] и при гиперлипидемически индуцированном атеросклерозе [Sata, Saiura, Kunisato et al., 2002].
Таким образом, изменение функциональных свойств резидентных клеток интимы и медии (ЭК, субэндотелиальные стромальные клетки, ГМК) стимулирует миграцию и аккумуляцию циркулирующих клеток крови (моноциты-Мф, Т-лимфоциты, костномозговые клетки-предшественники) в сосудистую стенку и играет важную роль в её ремоделировании.
В предыдущей главе уже было отмечено, что эндотелий играет важную роль в обеспечении сосудистого гомеостаза. В норме он регулирует тонус сосудов, избирательную проницаемость стенки сосуда, пролиферацию и миграцию ГМК, негативно регулирует тромбогенез и обладает фибринолитическими свойствами [Фрейдлин, 2006]. Регуляция этих физиологических функций опосредована продукцией вазоактивных молекул и цитокинов. Кроме того, важной функцией эндотелия является барьерная - защита от проникновения воспалительных и инфекционных агентов, активных форм кислорода и др. ЭК принимают непосредственное участие в регуляции миграции лейкоцитов из сосудов в ткани, в очаги инфекции и воспаления. При определенных условиях ЭК выполняют функции антиген-представляющих клеток, участвуют в регуляции активации и дифференцировке мононуклеаров крови. Регуляция этих иммунологических функций опосредована межклеточными медиаторами -цитокинами.
Среди наиболее важных регуляторных веществ, выделяемых эндотелием, можно выделить N0, простациклин, брадикинин (вазодилятатори), эндотелии и ангиотензин II (вазоконстрикторы). Оксид азота II (N0) - основное вещество, выделяемое эндотелием. N0 оказывает множественное влияние на сосуды: он является вазодилятатором, ингибирует адгезию и агрегацию тромбоцитов, адгезию и инфильтрацию лейкоцитов, и пролиферацию ГМК. Кроме того, было показано [Rubbo, Trostchansky, Botti and Batthyany, 2002], что выделение NO предотвращает окисление липопротеинов низкой плотности (ЛНП), аккумуляция которых в сосудистой стенке является одним из основных механизмов формирования атеросклеротических поражений. Простациклин усиливает ингибирующее влияние N0 на агрегацию тромбоцитов. Брадикинин стимулирует секрецию N0, простациклина и других вазодилятаторов ЭК. Кроме того, брадикинин стимулирует продукцию тканевого активатора плазминогена (t-PA) и, соответственно, участвует в фибринолизе. Ангиотензин II является прооксидантом, а также стимулирует продукцию эндотелина (наиболее изученный эндогенный вазокоистриктор). Эндотелии и ангиотензин усиливают пролиферацию ГМК, что способствует развитию гиперплазии интимы. В норме баланс веществ, выделяемых ЭК, обеспечивает выполнение эндотелием защитных функций и поддержание сосудистого гомеостаза. Напротив, дисбаланс этих факторов, приводит к эндотелиальной дисфункции.
Под эндотелиальной дисфункцией понимают нарушение функциональных свойств ЭК, сопровождающееся увеличением экспрессии молекул адгезии (ІСАМ-1, молекула межклеточной адгезии; VCAM, молекула адгезии клеток сосудов; Е-селектина) и провоспалительных факторов (TNFa, фактор некроза опухолей; IL-6, интерлейкин б; МСР-1, хемоаттрактантный белок моноцитов) и некоторых интегринов [Shi, Vandeberg, Jett et al., 2005; Vanhoutte, 2009]. При этом происходит инфильтрация и накопление модифицированных липопротеидов низкой плотности, а также циркулирующих моноцитов и лимфоцитов в субэндотелиальном пространстве.
На начальных стадиях взаимодействия с эндотелием лейкоциты движутся вдоль сосудистой стенки, лишь иногда касаясь эндотелиальных клеток, или "прокатываются" по его поверхности (Рис. 1.1.3) [Albelda, Smith and Ward, 1994; Cines, Pollak, Buck et al., 1998]. Этот процесс получил название «роллинга» (качение). На следующей стадии большая часть лейкоцитов тесно взаимодействует с поверхностью активированных ЭК -происходит адгезия. При этом происходит активация лейкоцитов, о чем свидетельствует изменение их формы с округлой на распластанную. Далее адгезировавшие клетки продвигаются в направлении межклеточных контактов и на некоторое время задерживаются на границе ЭК и базальной мембраны.
Химические реагенты
Материалом для выделения клеток служили пупочные канатики, полученные во время нормальных своевременных родов. Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод Gimbrone et al. (1974) в модификации Антонова и соавт. (1981). Для этого в пупочную вену с обеих сторон вставляли канюли, через которые промывали вену (для удаления крови) фосфатно-солевым буфером (ФБ). Отмытую пупочную вену наполняли 0,15% раствором диспазы в среде 199 и пережимали -56 канюли с двух сторон медицинскими зажимами. Пупочный канатик помещали в ФБ и инкубировали 35-50 минут при 37 С. Затем пупочный канатик легко массировали и промывали трижды ФБ. Полученную суспензию клеток собирали и осаждали в течение 10 минут при 200 g (1000 об/мин). Осадок ресуспендировали в ростовой среде (среда 199, содержащая 10% ЭТС, 200 мкг/мл ECGF, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл фунгизона) и высевали клетки в предварительно покрытые 0,2% раствором желатина чашки Петри. Клетки помещали в СОг-инкубатор (+37 С, 5% СОг, 95% воздуха - стандартные условия культивирования). Через сутки производили смену среды культивирования. Дальнейшие смены среды производили каждые 48 часов.
Источником ЭК аорты человека являлись грудные отделы аорт и сонные артерии человека, полученные при проведении срочных (не позднее 5 часов с момента смерти) патолого-анатомических вскрытий лиц, погибших в результате различных причин в возрасте от 30 до 60 лет.
Для получения ЭК из аорты человека использовали метод Antonov et al. (1986). Сосуды, изолированные в асептических условиях, освобождали от соединительной ткани. После этого аорту вскрывали вдоль, освобождали от адвентиции, помещали в 0,15% раствор диспазы в среде 199 без сыворотки и инкубировали 1,5-2 часа при 37С, затем встряхивали и дважды промывали ФБ. Полученные суспензии объединяли, пропускали через 100-мкм нейлоновые клеточные фильтры (BD Falcon, USA) и центрифугировали 10 минут при 600 g. Осадок ресуспендировали в среде роста ЭК, полученную суспензию помещали на чашки Петри, предварительно покрытые 0,2% раствором желатина. Клетки культивировали в стандартных условиях. аорты человека Субэндотелиальные стромальные клетки интимы (интимальные клетки) выделяли из фрагментов аорт после выделения эндотелия. Фрагменты интенсивно промывали ФБ для удаления оставшихся ЭК, помещали в 0,2% раствор коллагеназы IV типа, приготовленный на полной среде 199 и инкубировали 2-3 часа при 37С. Затем пробирку энергично встряхивали, суспензию отбирали в отдельную пробирку, а сосуд дважды промывали ФБ. Полученные суспензии объединяли, фильтровали через 100-мкм клеточные фильтры и центрифугировали 10 минут при 600g. Осадок ресуспендировали в полной среде 199 и высевали клетки на чашки Петри. Клетки культивировали в стандартных условиях.
Клетки субэндотелиального слоя представляли собой гетерогенную популяцию клеток интимы, представленную субэндотелиапьные стромальные клетки (преобладающая клеточная популяция), типичными гладкомышечными, дендритными и тучными клетками, а также макрофагами и лимфоцитами [Orekhov, Karpova, Tertov et al., 1984; Andreeva, Pugach, Gordon et al. 1998]. В связи с этим интимальные клетки не пассировали, все эксперименты проводили на клетках первичной культуры.
Мезенхимные стромальные клетки-предшественники (лМСК) выделяли из подкожной жировой клетчатки человека (материал был предоставлен Институтом хирургии им. А.В.Вишневского РАМН). Для получения первичной культуры лМСК использовали описанный ранее метод Zuk et al. (2002) в модификации Буравковой и соавт. (2009). Сначала жировую ткань дважды отмывали от крови ФБ. Для этого в центрифужную пробирку помещали жировую ткань и доводили объем пробирки до 50 мл фосфатно-солевым буфером так, чтобы соотношение объема жировой ткани и буфера было 1:2. Полученную смесь центрифугировали 10 мин при 600g. Затем проводили ферментативную дезагрегацию ткани. Для этого после отмывки жировую ткань взвешивали, добавляли раствор коллагеназы IA до конечной концентрации 0,075% и инкубировали 30 мин на водяной бане при 37 С, периодически встряхивая. Затем фермент инактивировали равным объемом полной ростовой среды, содержащей 10% ЭТС, и центрифугировали 10 минут при 600g. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и пропускали через 100-мкм клеточные фильтры. ЛМСК из полученной суспензии получали путем их адгезии к пластику. Для этого полученную клеточную суспензию помещали в чашки Петри, плотность посадки составляла 310 клеток на см . Через 24 часа неприкрепившиеся клетки удаляли, первичную
Исследование количественного содержания цитокинов в среде культивирования
Ни один из исследованных клеточных типов не относится к секретирующим, поэтому их размеры должны коррелировать с количеством общего клеточного белка. В таком случае нормирование содержания фотосепсибилизатора на мг клеточного белка позволит сравнить способность клеток разного размера аккумулировать краситель. Использование этого подхода позволило заключить, что способность накапливать ФС у лМСК была в 1,5 ниже, чем у Мф, и в 2 раза выше, чем у ЭК (Рис. 3.1.2 Б), что коррелирует с результатами флуоресцентной микроскопии (Рис. 3.1.1). Также было обнаружено, что накопление фотосенсибилизатора нормальным и TNFa-активированным (см. раздел «Материалы и методы») эндотелием не различалось (Рис. 3.1.2 В). Таким образом, данные, полученные при использовании разных подходов измерения, различались, однако в обоих случаях способность накапливать ФС была наименее выражена у ЭК.
Для определения оптимального времени инкубации клеток с красителем было необходимо изучить кинетику накопления ФС в ЭК, лМСК и Мф. Во всех исследованных клетках характер накопления красителя описывался многофазной кривой, состоящей из чередующихся участков быстрого накопления и плато (или медленного накопления) (Рис. 3.1.3). Продолжительность 1-й фазы быстрого накопления составляла 3 часа вне зависимости от типа клеток. В это время содержание фотосенсибилизатора в клетках увеличивалось экспоненциально, однако количество накопленного красителя было низким. Последующая фаза медленного накопления была наиболее выражена у ЭК, у которых ее длительность составляла 9 часов. В этот период содержание ФС в клетках практически не изменялось. Основное количество красителя в клетках сосудистой стенки накапливалось во время 2-й экспоненциальной фазы, продолжительность которой у ЭК была около 25 часов, у лМСК и Мф - 18 часов. Далее скорость накопления фотосенсибилизатора значительно замедлялась, а кривые накопления выходили на плато. Таким образом, основное количество ФС накапливалось в лМСК и Мф к 24 часам, а в ЭК - к 50 часам инкубации с красителем. Для Мф была характерна также 3-я фаза быстрого накопления, которая начиналась через 48 часов после инкубации с фотосенсибилизатором (Рис. 3.1.3). В этот период количество ФС в клетках увеличивалось линейно с течением времени.
Кинетика накопления данного красителя в ЭК, лМСК и Мф значительно различалась, однако кривые накопления были во многом схожи. Можно предположить, что сходство характера накопления ФС в исследованных клетках сосудистой стенки
Кинетика накопления ФС (10 мкг/мл) клетками сосудистой стенки. Приведены усредненные данные независимых экспериментов (M±SD, n=3). N -количество независимых экспериментов в каждом случае. человека определяется как общим мезенхимным происхождением этих клеюк, так и видовой специфичностью. Несмотря на то, что в настоящее время работы, посвященные изучению накопления фотосенсибилизаторов в неопухолевых клетках, в литерагуре практически не представлены, имеющиеся данные по накоплению металлсодержащих фталоцианинов в малигнизированых клетках животных и человека, подтверждают наше предположение. Ранее было показано, что характер накопления фталоцианина алюминия в опухолевых клетках мыши, китайского хомячка и человека значительно отличается, в то время как кинетика накопления этих ФС в различных мышиных клетках мезенхимального происхождения (как опухолевых, так и нормальных) практически одинакова [Chan, Svensen, Phillips and Hart, 1986; Ben-Hur, Siwecki, Newman et al, 1987; He, Hoing, Deahl et al., 1998]
Различия в кинетике накопления ФС в ЭК, лМСК и Мф объясняются, вероятно, функциональными особенностями этих клеток. Так, ЭК в сосудах формируют полупроницаемый барьер, обеспечивающий регуляцию обмена веществ между кровью и тканями. Избирательный транспорт веществ через эндотелиальный слой осуществляется преимущественно путем трансцитоза - специализированного транспорта отдельных макромолекул через клетку. В связи с этим накопление различных веществ, в том числе и ФС, в ЭК происходит значительно медленнее, чем в других клетках. В отличие от эндотелия, Мф выполняют в организме, прежде всего, защитную функцию, которая осуществляется этими клетками посредством фагоцитоза. Благодаря интенсивному эндоцитозу (в т.ч. высокой фагоцитарной активности) Мф способны активно поглощать и аккумуливать в цитоплазме значительные количества различных веществ, что и определяет высокую скорость накопления фотосенсибилизатора.
Таким образом, среди клеток сосудистой стенки Мф обладают наибольшей способностью накапливать ФС, а ЭК - наименьшей, что согласуется с их функциональными особенностями. Полученные данные по кинетике накопления ФС позволили определить оптимальное время инкубации клеток с красителем - 24 часа. Все последующие эксперименты проводили после 24-часовой инкубации с красителем. С одной стороны, за это время во всех клетках сосудистой стенки накапливается достаточное количество красителя для эффективного проведения ФДТ, а с другой - это соответствует времени циркуляции фотосенсибилизатора в крови пациента перед ФД воздействием [Вакуловская, Летягин и Погодина, 2003; Вакуловская, Шенталь, Кувшинов и Поддубный, 2004].
Одним из требований, предъявляемых к современным фотосенсибилизаторам, является их накопление в клетках-мишенях в значительных концентрациях. Краситель, в том числе и ФС, обычно вводится за 24 часа до лазерного облучения и достаточно быстро распределяется между кровью и тканями. При проведении ФДТ следует учитывать, что в течение первых суток после введения уровень ФС в сыворотке крови значительно снижается за счет выведения его почками: через 5 минут после введения концентрация красителя составляет 10 мкг/мл, через 6 часов - 1 мкг/мл, а через 24 часа -0,5 мкг/мл (согласно инструкции производителя). Изменение концентрации красителя в крови влечет за собой уменьшение его содержания в клетках [Smith, Bedwell, MacRobert et al., 1993; Grant, Speight, MacRobert et al., 1994]. Для обеспечения высокой эффективности ФДТ представляется важным изучить скорость выведения фотосенсибилизатора из предполагаемых клеток-мишеней.
Выведение ФС из клеток сосудистой стенки определяли через различные промежутки времени после 24-часовой инкубации с красителем (Рис. 3.1.4). Было показано, что кинетика выведения красителя из ЭК, лМСК и Мф практически не различается. Во всех исследованных клетках снижение внутриклеточного содержания фотосенсибилизатора носило двухфазный характер. Продолжительность первой фазы быстрого выведения составляла 6 часов. Далее скорость выведения значительно снижалась, а кривая выходила на плато. Полученная закономерность выведения красителя
-79 коррелирует с динамикой изменения уровня ФС в крови при проведении ФДВ [Скидан, Бобрускин, Гуляев и др., 2001; Смирнова, Кубасова, Макарова и др., 2003]. Эти данные позволяют предположить, что в первые 6 часов фотосенсибилизатор выходит из клеток пассивно по градиенту концентрации. Далее при достижении определенной внутриклеточной концентрации ФС, по-видимому, активируются некие механизмы, препятствующие дальнейшему выходу красителя из клеток и обеспечивающие поддержание его постоянного уровня ( 50-60% от первоначального содержания) в течение длительного времени (Рис. 3.1.4).
Влияние компонентов фото динамического воздействия на клетки сосудистой стенки
В отличие от некроза, апоптоз и аутофагия относятся к программируемой клеточной гибели, ОТЛРІЧИТЄЛЬНОЙ чертой которой является гибель отдельных поврежденных клеток, не затрагивающая «здоровое» окружение. Для индукции этих типов клеточной гибели требуется экспрессия специфических генов и активация различных ферментов. Апоптоз сопровождается конденсацией хроматина, выпячиванием наружной мембраны и образованием апоптотических телец [Bright and Khar, 1994; Wilson, 1998]. При этом в течение длительного времени сохраняется целостность органелл. Аутофагия, напротив, сопровождается деградацией поврежденных органелл или всей клетки в целом за счет образование аутофагосом и активности лизосомальных ферментов [Klionsky and Emr, 2000; Burch, 2001]. Как при апоптозе, так и при аутофагии проницаемость клеточных мембран не изменяется. Конечным этапом всех типов программируемой клеточной гибели является поглощение клеточных остатков фагоцитами без развития иммунного ответа.
В данной части работы определяли влияние дозы облучения при ФДВ на способ гибели клеток сосудистой стенки. Для этого использовали различные методы: окраску Аннексии V-FITC - пропидий-йодидом, выявление активной каспазы 3 с помощью антител и определение её субстратной активности. Было показано, что существует прямая корреляция между дозой облучения и типом клеточной гибели после ФДВ: низкие дозы воздействия (0,5-2 Дж/см для ЭК и 2-5 Дж/см для клеток интимы и Мф) индуцируют гибель клеток преимущественно путем апоптоза (Рис. 3.1.11), в то время как высокие и средние - путем некроза (Рис. 3.12). При этом было установлено, что апоптотическая гибель клеток сосудистой стенки после воздействия протекает по каспаз-зависимому пути и сопровождается активацией каспазы 3 (Рис. 3.1.11 Г, Е). Кроме того, при окраске Аннексии V-FITC- пропидий-йодид было обнаружено, что после ФДВ большинство апоптотических клеток обладают также характеристиками некротических (Рис. 3.1.11 Б, 3.1.12 Г). Подобное наблюдение можно объяснить следующим образом. Как известно, в организме завершающим этапом программы апоптотической гибели является подготовка клеток к фагоцитозу макрофагами или окружающими клетками. В условиях in vitro фагоцитоз образующихся апоптотических телец не может быть осуществлен, поскольку воздействию подвергаются все культивируемые клетки. В связи с этим апоптоз завершается постапоптотическим некрозом [Majno and Joris, 1995].
Полученные результаты согласуются с данными других исследователей [Plaetzer, Kiesslich, Krammer and Hammerl, 2002]. Так, ранее на клетках меланомы человека было показано, что дозы облучения, цитотоксичность которых менее 70%, индуцируют преимущественно апоптотическуго гибель клеток, в то время воздействие высоких доз, цитотоксичность которых превышает 90%, приводит к массовому некрозу [Nagata, Obana, Gohlo and Nakajima, 2003]. Предполагают, что подобное изменение программы клеточной гибели при увеличении дозы воздействия связано с фотохимической инактивацией ферментов и других компонентов апоптотического каскада после ФДВ высокой интенсивности [Lavic, Kaplinsky, Toren et al., 1999; Castano, Demidova and Hamblin, 2005].
Отдельно следует отметить реакцию эндотелия на ФДВ, которая несколько отличалась от реакции других клеток сосудистой стенки. Через 1 час после воздействия дозой 1-2 Дж/см большинство ЭК откреплялось от подложки (данные не представлены). Цитофлуориметрический анализ тотальной популяции эндотелия показал, что после ФДВ около 40% клеток погибало путем апоптоза, в то время как 50-60% оставались жизнеспособными и не окрашивались на маркеры апоптоза и некроза (Рис. 3.1.11 Б). Эти данные коррелируют с результатами других исследователей, согласно которым уменьшение адгезивных способностей клеток после ФДВ сопровождается разрушением фокальных контактов, содержащих белки-интегрины [Runnels, Chen, Ortel et al., 1999; Uzdensky A.B., Jureniene A., Kolpakova E. et al., 2004]. Ранее было показано, что интегрин-опосредованные сигналы, возникающие при контакте клеток с внеклеточным матриксом, необходимы для поддержания жизнеспособности эндотелия [Meredith, Fazeli and Schwartz, 1993]. Нарушение адгезии ЭК индуцирует апоптоз, который развивается через 12-18 часов после перехода клеток в суспензию [Meredith, Fazeli and Schwartz, 1993; Frisch and Ruoslahti, 1997]. Можно предположить, высокая цитотоксичность ФДВ по отношению к ЭК (Рис. 3.1.7 А) определяется тем, что после открепления большинство ЭК вступает в апоптоз. Таким образом, механизм апоптотической гибели клеток сосудистой стенки после ФДВ различен: для интимацитов и Мф характерен апоптоз по митохондриальному типу, а для ЭК — по типу аноикоза (форма апоптоза, обусловленная потерей внеклеточных контактов).
При использовании ФДТ для элиминации опухолевых образований не важно, каким образом погибнут клетки. Некротическая гибель, возможно, даже более предпочтительна, поскольку позволяет повысить иммуногенность малигнизированных клеток [Melcher, Gough, Todryk and Vile, 1999; Zitvogel., Casares, Pequignot et al., 2004; Gollnick and Brackett, 2010]. В случае применения ФДВ для лечения пролиферативньгх заболеваний артерий вопрос о способе клеточной гибели является принципиальным. Так, развитие очага некроза в сосудистой стенке после воздействия может привести к необратимым последствиям: к увеличению некротической массы в атероме и к нарушению кровообращения вследствие развития воспалительной реакции. Развитие воспалительного процесса в данном случае будет связано с попаданием некротического материала в межклеточное пространство и будет сопровождаться инфильтрацией сосудистой стенки лимфоцитами и тромбообразованием, что вызовет расстройство кровообращения [Biasucci, Liuzzo, Angiolillo et al., 2000; Esmon, 2008; Antoniades, Bakogiannis, Tousoulis et al., 2009]. В отличие от некроза, апоптоз обычно не сопровождается активацией иммунной системы и не приводит к развитию воспалительной реакции [Duijnhoven, Aalbers, Rovers et al., 2003]. Однако массовая апоптотическая гибель ЭК в артериях может стимулировать тромбообразование, что, вероятно, неблагоприятно отразится на кровообращении.
Таким образом, способ гибели клеток сосудистой стенки после ФДВ напрямую зависит от дозы облучения. Высокие дозы облучения индуцируют некроз, что является крайне нежелательным при использовании ФДТ для лечения пролиферативных заболеваний артерий. При использовании низких доз прогноз более благоприятен, поскольку в этом случае клетки гибнут путем апоптоза. Однако вопрос оптимизации условий сложен и требует дальнейшего подробного изучения и анализа эффектов фотодинамики на клетки.
