Введение к работе
Актуальность проблемы. Гепатоциты представляют собой огромную клеточную систему, специализированную на выполнение многообразных метаболических и биосинтетических функций. Несмотря на то, что ткань печени на первый взгляд выглядит мономорфной, она гетерогенна с точки зрения и структуры, и функции (Герок В., Блюм Х.Е., 2009). Эта гетерогенность обусловлена кровоснабжением дольки: клетки, локализующиеся в перипортальной зоне, отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности (Kmiec Z., 2001). В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов.
Изменения гепатоцитов, интерпретируемые как дистрофические, могут отражать как повреждение их структур и нарушение функции, так, и наоборот, интенсивную функцию клеток, их повышенную метаболическую активность. Особенно наглядно это положение подтверждается при использовании электронно-микроскопической радиоавтографии, что позволяет не только видеть изменения ультраструктуры клетки, но одновременно оценивать ее функциональное состояние. Д.С.Саркисовым (1993) показано, что даже при выраженной жировой дистрофии гепатоцита сохраняется достаточно высокий уровень биосинтетических реакций в ядерном и цитоплазматическом компартментах.
Печень относится к органам, физиологическая и репаративная регенерация которых выражается примерно в одинаковой степени одновременно в двух формах – клеточной и внутриклеточной, т.е. осуществляется как путем увеличения числа клеток, так и гиперплазии ультраструктур в сохранившихся клетках (Court F.G. et al., 2002). Один из важнейших выводов, который можно сделать по регенерации гепатоцитов, состоит в том, что пролиферативная активность зрелых гепатоцитов достаточна для репопуляции печени после парциальной гепатоэктомии. Резервный компартмент стволовых клеток печени активизируется для пролиферации и дифференцировки только в очень специфических условиях, когда пролиферация зрелых гепатоцитов ограничена или заблокирована (Fausto N., 1991; Forbes S., 2002).
Взаимодействия паренхиматозных клеток различных органов и эндотелиоцитов микроциркуляторного русла являются составной частью паренхиматозно-стромальных взаимоотношений и играют важную роль в развитии физиологических и патологических процессов. Особая актуальность изучения взаимодействий паренхимы и стромы, в том числе элементов микроциркуляторного русла, связана с индукцией и прогрессией опухолевого роста (Thiery J.P., 2002). При изучении метастазирования опухолей молочной железы продемонстрировано явление эпителиально-мезенхимной трансформации, которую рассматривают в качестве одного из механизмов ремоделирования тканей, осуществляемого в критических фазах эмбрионального развития у многих видов животных (Tomaskovic-Crook E. et al., 2009). Кроме того, запуск механизма эпителиально-мезенхимной трансформации может иметь место и в других патологических процессах, таких как фиброз (Guarino M. et al., 2009; Fabris L., Strazzabosco M., 2011). Эти данные заставляют по-новому видеть проблему дифференцировки дефинитивных клеточных форм (Гаршин В.Г., 1939; Заварзин А.А., 1947).
В этом аспекте известна пластичность эндотелиальных клеток сосудов, являющихся активными участниками ряда ключевых физиологических функций, в том числе транспорта кислорода и питательных веществ к тканям (Patel-Hett S., D'Amore P.A., 2011). Среди других важных функций эндотелиоцитов – регуляция тонуса сосудистой стенки и процессов свертывания крови, участие в ангиогенезе и воспалении, что имеет фундаментальное значение в развитии широкого спектра адаптивных и патологических процессов (Bedi S. et al., 2008).
Влияние эндотелия на окружающие ткани реализуется различными путями: эндотелиальные клетки синтезируют компоненты соединительной ткани и способны регулировать синтез этих компонентов другими клетками, с помощью эндотелия осуществляется регуляция тонуса гладкомышечных клеток и, следовательно, показателей кровотока. Эндотелиальные клетки синтезируют компоненты собственной базальной мембраны, в том числе, фибронектин, коллагены, ламинин, эластин и гликозаминогликаны, экспонирующиеся на люминальной поверхности и в экстрацеллюлярном матриксе (Brandao D.F. et al., 2006).
Эндотелиоцитам свойственны тканевая специализация и тканеспецифичный полиморфизм, что определяет наличие нескольких дефинитивных форм структурной организации капилляров: соматических с непрерывной эндотелиальной выстилкой, фенестрированных и синусоидных (Braet F. et al., 2009; Jacobs F. et al., 2009; March S. et al., 2009; Cogger V.C. et al., 2010; Kawasaki T. et al., 2010; Xie G. et al., 2012; Yokomori H. et al., 2012).
Физиологические и патологические вариации функционирования тканей и органов обусловлены высокой пластичностью сосудистой системы и особенно ее микроциркуляторного русла. Эндотелий и адвентиция обладают выраженной способностью к регенерации, являясь «депо» полипотентных камбиальных клеточных элементов стромы (Саркисов Д.С., 1980). По данным электронно-микроскопической радиоавтографии, мельчайшие сосуды являются элементарными структурно-функциональными единицами соединительной ткани, о чем свидетельствуют наивысшая пролиферативная и метаболическая активность перикапиллярных клеток и градиент уменьшения этой активности по мере удаления от сосудистой стенки (Саркисов Д.С., 1993; Колокольчикова Е.Г. и др., 1997).
Установлено, что во взаимоотношениях паренхимы и стромы на территории тканевого микрорайона капилляру принадлежит ключевая роль, он является своеобразным пейсмейкером (Непомнящих Г.И., 1979, 1996; Непомнящих Г.И. и др., 1987).
Звездчатые клетки печени («липоциты», клетки Ито, жиронакапливающие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между гепатоцитами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80% витамина А (Balabaud C. et al., 2004; Geerts A., 2004; Ryder S.D., 2004; Senoo H. et al., 2010). Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен (Balabaud C. et al., 2004; Senoo H., 2004).
Все большее значение придается роли звездчатых клеток в развитии фиброза и цирроза печени (Gabele E. et al., 2003; Forbes S.J., Parola M., 2011; Tacke F., Weiskirchen R., 2012). При получении фиброгенных стимулов «покоящиеся» звездчатые клетки «трансдифференцируются», приобретая миофибробластоподобный фенотип, и могут продуцировать коллаген, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса (Gutierrez-Reyes G. et al., 2007; Friedman S.L., 2008). Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к уменьшению объема метаболически эффективной паренхимы, в дальнейшем – портальной гипертензии и порто-системному шунтированию. Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический обмен между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени (Brandao D.F. et al., 2006; Lee Y., Friedman S.L., 2011).
Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии ретиноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрикса (Kisseleva T., Brenner D.A., 2007). Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени (Desmet V.J. et al., 2004; Schuppan D., Afdhal N.H., 2008).
В настоящее время при исследовании состояния печени с помощью современных методов оценивают некоторые вирусологические и иммунологические показатели. Имеется достаточно большое количество исследований по ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (Вавилин В.А., 2002), опухолевым заболеваниям и быстро прогрессирующим циррозам печени (Непомнящих Д.Л. и др., 2006). Тем не менее, даже при использовании комплекса молекулярно-генетических методик структурное исследование печени остается необходимым для оценки изменений органа, в том числе, в условиях вибрационного и вирусного воздействий.
Исследования висцеральных органов при вибрационном воздействии единичны и касаются, как правило, лишь экспериментальных моделей, несмотря на то, что полиорганные изменения развиваются вследствие системного поражения микроциркуляторного русла с последующей дисфункцией внутренних органов. В условиях профессиональной вибрации важное место занимает печень как основной метаболический и детоксикационный орган, а также желудок как полый орган, особенно чувствительный к вибрационному воздействию (Сухаревская Т.М. и др., 2000; Измеров Н.Ф. и др., 2004).
В оценке структурных изменений органов большое значение имеют межорганные взаимодействия, отражающие системность заболеваний (Крылов А.А., 2000; Апросина З.Г. и др., 2002; Плешко Р.И. и др. 2006; Непомнящих Д.Л. и др. 2010). В этом контексте нами продолжено изучение гепато-гастральных отношений, единство которых обеспечивается принадлежностью к пищеварительной системе.
Цель исследования – изучить ультраструктурные основы межклеточных взаимодействий основных популяций печени при вибрационном и вирусном воздействиях для разработки концепции эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий как основе альтеративных и репаративных процессов.
Задачи исследования:
-
Изучить характер внутриклеточной реорганизации основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии производственной вибрации.
-
Провести структурный анализ клеточных популяций слизистой оболочки желудка в условиях производственной вибрации.
-
Провести оценку структурных изменений клеточных популяций печени после воздействия экспериментальной вибрации (в течение одного месяца) и в периоде восстановления.
-
Изучить внутриклеточную реорганизацию основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии РНК-содержащего вируса гепатита С (HCV-инфекция).
-
Провести структурно-функциональное исследование звездчатых клеток печени в онтогенезе (экспериментальная модель) и при вирусном HCV воздействии (клиническая модель).
-
Изучить особенности морфогенеза эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий в печени при воздействии вибрационного и вирусного факторов.
Научная новизна. Впервые на основе сравнительного изучения характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий факторов установлены основные этапы структурно-функциональной перестройки печени при вибрационном и вирусном воздействиях. Представлены основные варианты внутриклеточной реорганизации гепатоцитов эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при реализации физиологических и патологических процессов. Установлено, что к ведущим ультраструктурным изменениям гепатоцитов и эндотелиоцитов относятся редукцией белоксинтезирующих органелл, частичная деструкция митохондриального компартмента, усиление аутофагических процессов. Показано, что снижение белоксинтезирующей и энергетической функций гепатоцитов и угнетение транссинусоидального обмена сопровождаются фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, увеличением количества коллагеновых волокон в пространствах Диссе, развитием перицеллюлярного фиброза.
Впервые показано, что тканевая пространственная организация печени при воздействии производственной вибрации имеет особенности в сравнении с вирусными воздействиями. При вибрационном воздействии наблюдается высокая объемная плотность гепатоцитов с «опустошенной» цитоплазмой при уменьшении количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с данными показателями при гепатите C, что свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени. РНК-содержащий вирус гепатита С повреждает преимущественно цитоплазматические органеллы при сохранении ядерного компартмента.
Определена фиброгенная активация звездчатых клеток печени, характеризующаяся редукцией липидных капель и синхронной экспрессией фибробластоподобных свойств – позитивной иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный -актин, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и перигепатоцеллюлярным формированием коллагеновых фибрилл. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного -актина происходит в фибробластах и миофибробластах портальных зон Несмотря на прогрессирующее уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, поддерживается функция депонирования ретиноидов: при циррозе печени в фиброзных септах и внутри долек сохраняются липидосодержащие звездчатые клетки. Сделано заключение, что звездчатые клетки печени – полиморфная гетерогенная популяция с широким спектром функциональной активности.
Установлено, что основу висцеропатий при вибрационном воздействии составляет синдром, включающий прогрессирующую системную дистрофию и последующую атрофию паренхиматозных клеток, диффузный фиброз стромы, ранние системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелиоцитов. В ткани печени развивается субтотальный и тотальный коллапс синусоидов, сопровождающийся фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, диффузной атрофией гепатоцитов и коллагенизацией пространств Диссе.
Выделены структурные маркеры цитотоксического поражения гепатоцитов при вирусном гепатите С, ассоциированном опийной зависимостью, – частичная деструкция митохондриального компартмента и гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети, ассоциированная с редукцией белоксинтезирующих органелл. В отличие от вирус-ассоциированного, преимущественно перипортального поражения печени, структурное выражение воздействия наркотических веществ реализуется в центролобулярной зоне. Его маркеры – макровезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов, интрагепатоцеллюлярный холестаз, центролобулярные некрозы, присутствие эозинофилов в клеточных инфильтратах, центральный и перисинусоидальный фиброз.
Впервые при сопоставлении данных биохимического анализа, ПЦР и структурных изменений печени установлено отсутствие прямой зависимости между выраженностью структурных изменений печени, активностью HCV-инфекции и выраженностью репликации вируса (его количественного присутствия в образцах крови и/или ткани печени). Показано, что при достаточно высоком уровне виремии доминируют минимальные изменения структуры печени, определяется слабо выраженная степень активности HCV-инфекции.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты раскрывают новые закономерности тканевых, клеточных и внутриклеточных реакций, имеющие большое теоретическое и практическое значение – установлена роль звездчатых клеток печени в развитии фиброза органа, представлены варианты пластичности клеточных популяций печени, описаны механизмы «автономизации» паренхиматозных клеток печени, существенно влияющие на паренхиматозно-синусоидальный обмен в условиях перисинусоидального фиброза и на возможность редукции фиброзных изменений.
Данные проведенного исследования свидетельствуют о важности комплексного морфологического изучения биопсий печени для диагностики, дифференциальной диагностики, определения прогноза и тактики терапии хронических заболеваний печени. Результаты исследования целесообразно внести в курс преподавания соответствующих разделов гистологии и патоморфологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
При вибрационном и вирусном воздействиях в клеточных популяциях печени развиваются нарушения клеточной и внутриклеточной регенерации, пластический дефицит, дистрофия, атрофия, элиминация клеток, диффузный реактивный фиброз.
Профессиональная вибрация существенно влияет на структуру и функцию печени – основного метаболического и детоксикационного органа – обнаруживается выраженная атрофия паренхиматозных клеток, фиброз и системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелия.
Реорганизация поверхностных и глубоких слоев слизистой оболочки желудка при вибрационном воздействии характеризуется относительно высокими значениями структурной плотности капилляров, но ультраструктурное и радиоавтографическое исследования показывают, что микроциркуляторное русло имеет признаки структурно-функциональной недостаточности.
Наличие РНК HCV в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по структурным изменениям печени и клинико-биохимическим тестам.
Структурные признаки активации звездчатых клеток печени – превращение их из «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки «миофибробластоподобные» с исчезновением липидных капель и экспрессией гладкомышечного -актина – ассоциируются с прогрессией фиброза и цирроза печени.
Апробация работы. Материалы исследования представлены на 8-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998); 6-й Всероссийской конференции «Патология клетки» (Москва, 2000); научно-практических конференциях «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 2000, 2001); 12-й Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006); 13-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011); 19-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2011); XVII Ежегодном Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва, 2012); 14-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2012» (Санкт-Петербург, 2012); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012); Ученом совете ФГБУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 15 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для опубликования результатов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), результатов собственных исследований (7 глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы).
