Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Митохондриом кардиомиоцитов млекопитающих 8
1.1.1. Митохондрии кардиомиоцитов 8
1.1.2. Межмитохондриальные контакты кардиомиоцитов: строение, функциональное значение 12
1.2 Гипертрофия кардиомиоцитов и миокарда в целом 20
1.2.1. Общая характеристика процесса гипертрофии 20
1.2.2. Митохондрии кардиомиоцитов при гипертрофии 23
1.2.3. Обратимость гипертрофии кардиомиоцитов 27
1.3 Воздействие гипергравитации на животных 30
1.3.1. Роль изучения гипергравитационного воздействия 30
1.3.2. Характеристика изменений в организме млекопитающих при кратковременном и длительном гипергравитационном воздействии 31
1.3.3. Изменения сердечно-сосудистой системы в условиях гипергравитации 36
1.3.4. Характеристика кардиомиоцитов миокарда млекопитающих в условиях гипергравитации 38
1.4 Воздействие антиортостатического вывешивания на животных положении 43
1.4.2. Характеристика изменений в организме млекопитающих при вывешивании в антиортостатическом положении 44
1.4.3. Изменения сердечно-сосудистой системы при вывешивании в антиортостатическом положении 49
1.4.4. Характеристика кардиомиоцитов миокарда млекопитающих при вывешивании в антиортостатическом положении 52
2. Материал и методы исследования 56
2.1 Описание экспериментальных моделей 56
2.2 Методы исследования 60
3. Результаты собственного исследования и их обсуждение 64
3.1 Контрольный материал 64
3.2 Воздействие гипергравитации 2G 73
3.2.1. Результаты 73
3.2.2. Обсуждение 93
3.2.3 Изменения кардиомиоцитов и капилляров миокарда левого желудочка при гипергравитации 2G 94
3.2.4 Изменения митохондриома кардиомиоцитов миокарда левого желудочка при гипергравитации 2G 106
3.3 Воздействие вывешивания в антиортостатическом положении 116
3.3.1. Результаты 116
3.3.2. Обсуждение 130
4 Изменения кардиомиоцитов и капилляров миокарда левого желудочка при антиортостатическом вывешивании 130
4.1 Изменения митохондриома кардиомиоцитов миокарда левого желудочка при при антиортостатическом вывешивании 135
Заключение 144
Выводы 151
- Гипертрофия кардиомиоцитов и миокарда в целом
- Воздействие антиортостатического вывешивания на животных положении
- Воздействие гипергравитации 2G
- Воздействие вывешивания в антиортостатическом положении
Введение к работе
Актуальность проблемы. Митохондрии являются одними из самых изменчивых и полиморфных органелл эукариотической клетки, их размеры, форма и ультраструктура быстро меняются под влиянием различных экспериментальных факторов. В современной клеточной биологии часто изучают не отдельные митохондрии, но всю совокупность органелл в целом - митохондриом. Удобным объектом для исследования реакции митохондриома на различные экспериментальные воздействия являются кардиомиоциты, постоянно ритмично сокращающиеся клетки, в которых энергопродуцирующий аппарат занимает около трети общего объема (Непомнящих, 1991; Barth et al., 1992).
Около двадцати лет назад было показано, что кардиомиоциты млекопитающих
обладают особой системой организации митохондрий - митохондриальным ретикулумом, в
котором практически все отдельные митохондрии объединены между собой структурно и
энергетически с помощью межмитохондриальных контактов (ММК) (Бакеева и др., 1982;
Амченкова и др., 1986; Бакеева, Ченцов, 1989). Хорошо изучена ультраструктура ММК
(Бакеева и др., 1982), установлена также функция этих структур — они обеспечивают
передачу энергии в форме электрического потенциала по мембранам объединенных
митохондрий, образующих эквипотенциальную поверхность (Амченкова и др., 1986). Это
позволяет рассматривать митохондрии, соединенные ММК, как мембранный
внутриклеточный кабель (Скулачев, 1989), благодаря которому возможно быстрое
распространение энергии в объеме клетке. Сравнительно недавно показано, что ММК
являются универсальными по ультраструктуре и необходимыми для формирования
, митохондриома кардиомиоцитов структурами как позвоночных, так и беспозвоночных
животных (Шорникова, 2000).
На основании целого ряда работ (Абдулла и др., 1991; Пауков, Проценко, 1996; Агафонова и др., 1997), проведенных на желудочковых кардиомиоцитах крыс в условиях изменения нагрузки на сердце, была установлена прямая связь между функциональной активностью кардиомиоцитов и числом ММК в них. Так, при увеличении нагрузки на сердце, обусловленной стенозом аорты, развивается гипертрофия кардиомиоцитов, сопровождающаяся ростом числа ММК (Пауков, Проценко, 1996). Напротив, при снижении нагрузки на сердце в условиях гипокинезии отмечено снижение числа ММК (Агафонова и др., 1997; Колесникова и др., 1998). Из вышеуказанных работах следует, что изменение степени ассоциирования митохондрий является одной из универсальных приспособительных реакций кардиомиоцитов при различных изменениях условий функционирования миокарда.
Как вариант изменения нагрузки на сердце, можно рассматривать воздействие на
организм гипергравитации, а также вывешивание животных в антиортостатическом
положении, моделирующем основные эффекты невесомости (Morey-Holton, Globus, 2002).
Оба фактора оказывают значительное влияние на организм млекопитающих в космическом
полете. Работы, описывающие ультраструктуру кардиомиоцитов и их митохондрий
желудочка млекопитающих в таких условиях, не многочисленны (Frey et al., 1997; Philpott et
al., 1992; Goldstein et al., 1998). В этих работах отсутствует анализ поведения митохондриома
как системы митохондрий и ММК в кардиомиоцитах, что определяет актуальность данной
работы. Также к настоящему времени остаются не изученными изменения митохондриома
кардиомиоцитов в период после снятия воздействия гипергравитации и антиорто-
статического вывешивания. Анализ изменений в других системах органов крыс показал, что
, \ при повторе действия ги пер гравитации реакции организма отличаются от обнаруженных при
» первом воздействии (Краснов и др., 1998; Краснов и др., 2000). Однако вопрос об отличиях
*
реакции митохондриома кардиомиоцитов на однократное и повторное воздействие гипергравитации и антиортостатическое вывешивание абсолютно не освещен в литературе.
6 Целью исследования явилась морфо-функциональная характеристика митохондриома как системы митохондрий, объединенных между собой ММК, кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс при двух экспериментальных воздействиях, изменяющих уровень нагрузки на миокард: при гипергравитации 2G и при антиортостатическом вывешивании животных; а также после снятия данных воздействий, и при их повторном действии. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. для определения общего состояния миокарда, выяснения фона, на котором
развиваются изменения митохондриома кардиомиоцитов, исследовать ряд морфо-
функциональных параметров клеток и кровеносных капилляров:
площадь поперечного сечения кардиомиоцитов и их ядер;
относительный объем миофибрилл;
относительное число капилляров и их диаметр;
2. дать подробную ультраструктурную морфометрическую характеристику
митохондриома кардиомиоцитов по следующим параметрам:
относительный объем митохондрий;
численная плотность митохондрий;
соотношение числа митохондрий разных размеров;
их ультраструктура;
число крист в митохондриях;
число ММК. Научная новизна работы. Впервые в кардиомиоцитах левого желудочка крыс,
\ подвергнутых гипергравитации, проанализированы морфофункциональные изменения митохондриома как системы митохондрий, объединенных ММК. Показано, что рост числа ММК происходит не одинаково в различных зонах локализации митохондрий в кардиомиоцитах, что является первичной реакцией митохондриома при гипергравитации,
7 опережающей развитие гипертрофии самих клеток, и что несомненно связано с динамичностью и высокой чувствительностью ММК к данным экспериментальным условиям. Установлено, что после прекращения 2G воздействия указанные изменения числа ММК сохраняются. Также показано, что реакция системы ММК, то есть изменения в их числе, а также кардиомиоцитов в целом на повторное действие гипергравитации зависит от длительности первого воздействия и последующего перерыва перед вторым воздействием.
Впервые исследован митохондриом кардиомицитов левого желудочка крыс при вывешивании их в антиортостатическом положении. При этом выявлено, что рост числа ММК происходит в уменьшающихся по размерам (гипотрофированных) кардиомионитах. Описана замедленная нормализация изменений в митохондриоме кардиомиоцитов после снятия данного воздействия. Впервые изучен митохондриом кардиомицитов при повторном антиортостатическом вывешивании кръц', и обнаружена более выраженная ответная реакция со стороны числа ММК на повторное воздействие по сравнению с однократным.
Научно-практическое значение работы. Выполненная работа представляет не только
теоретический, но и практический интерес в области космической биологии и медицины.
Данные, полученные в настоящей работе, об изменениях кардиомиоцитов при
гипергравитации важны для разработки методов использования перегрузок для борьбы с
нежелательными последствиями действия невесомости на организм. Данные о влиянии
однократных и повторных воздействий искусственной невесомости на кардиомиоциты могут
способствовать разработке оптимальных временных режимов пребывания человека в
условиях космических полетов. В целом, полученные в работе результаты расширяют и
. » дополняют картину ранее известных изменений, протекающих в сердечно-сосудистой
» системе млекопитающих при гипергравитации и невесомости.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Гипертрофия кардиомиоцитов и миокарда в целом
Одно из изучаемых в работе экспериментальных воздействий - гипегравитация -приводит к изменениям в организме животных, связанным с увеличением функциональной нагрузки на сердце (Oyama, Chan, 1973; Котовская и др., 1985; Краснов, Носова, 1987), поэтому логично предположить развитие гипертрофии кардиомиоцитов в условиях 2G. В связи с этим в данном разделе приведен обзор работ, посвященных процессу гипертрофии кардиомиоцитов. 1.2.1. Общая характеристика процесса гипертрофии В многочисленных работах различных исследователей было неоднократно продемонстрировано, что повышение функциональной нагрузки на сердце приводит к , развитию его гипертрофии (Саркисов, Втюрин, 1969; Меерсон, 1978; Непомнящих, 1991). Увеличение совершаемой сердцем работы, приводящее к его гипертрофии, может быть следствием различных причин, таких как увеличение физической нагрузки на весь организм (бег, плавание), перегрузка сердца давлением (наиболее хорошо изученная форма гипертрофии) или объемом крови, гипобарическая гипоксия, постоянное повышение частоты сердечного ритма; также перегрузка сердца может быть также следствием локального повреждения миокарда при острой хронической ишемии или инфаркте, может быть вызвано нарушением гормонального баланса (Campbell, Gerdes, 1988; Тен Эйк, Бассет, 1990; Непомнящих, 1991; Абдулла, 1992; Проценко, 1996). Вышеперечисленные факторы могут приводить к гипертрофии как левого, так и правого желудочка сердца, или сразу обоих, но с разной степенью выраженности (Anversa et al., 1983, и др.), что связано с разной функциональной нагрузкой этих отделов, и, как следствие, с разной чувствительностью их к одним и тем же воздействиям. Но так как направленность изменений разных отделов сердца при гипертрофии общая, то в дальнейшем изложении этого раздела работы, посвященные изучению гипертрофии в левом и правом желудочке, будут обсуждаться вместе. Подавляющее большинство исследований, посвященным различным аспектам изменений кардиомиоцитов при гипертрофии, включает в себя количественный анализ наблюдаемых изменений, что убедительно демонстрирует необходимость такого подхода, в частности делая возможным сравнение данных, полученных при разных моделях гипертрофии. В гипертрофированном миокарде, как правило, отмечается изменение парамегров микроциркуляторного русла (Меерсон, 1986). При артериальной гипертензии снижается число профилей капилляров в 1 мм2 ткани миокарда, что вызывает увеличение радиуса диффузии питательных веществ от капилляров к кардиомиоцитам (Непомнящих, 1991).
В динамике развития гипертрофии левого желудочка, вызванной сужением восходящей аорты, показано уменьшение численной плотности капилляров с увеличением времени воздействия (Breisch et al., 1984). При введении крысам высоких доз тиреоидных гормонов в гипертрофированном левом желудочке сердца этот показатель также снижается на 12-18 % (Gerdes et al., 1979). Напротив, гипертрофия миокарда, индуцированная гипоксией, как правило, сопровождается увеличением капилляризации сердца (Hudlicka, 1984). В частности, в условиях гипобарической гипоксии в правом желудочке отмечается почти двукратное увеличение (в 1,7 раза) числа капилляров и их диаметра (Абдулла и др., 1991а). При гипертрофии миокарда крыс, вызванной физической нагрузкой - ежедневным бегом показана зависимость изменения численной плотности капилляров правого желудочка от интенсивности нагрузки (Anversa et al., 1983): при невысокой нагрузке происходит рост численной плотности капилляров на 16%, а при высокой, напротив, снижение этого показателя. В этой работе отмечено, что реакция правого желудочка на физическую нагрузку такого рода более ярко выражена, чем левого (в частности, по приросту массы желудочков). Однако, в другой работе при нагрузке крыс плаванием через 9 недель обнаружено развитие гипертрофии обоих желудочков в равной степени (Frenzel et al., 1988), при этом число капилляров уменьшается на 22%, что сопровождается их расширением на 27%. Электронномикроскопические исследования, проведенные разными авторами на протяжении нескольких десятилетий (Саркисов, Втюрин, 1967; Тен Эйк, Бассет, 1990; Perennec, Hatt, 1990), показали, что в основе гипертрофии миокарда лежит увеличение размеров мышечных клеток, но не их числа. При этом изменение размера кардиомиоцитов в разных условиях выражено неодинаково. Так, при умеренной 7-недельной физической нагрузке бегом описано удлинение кардиомиоцитов правого желудочка на 26% (Anversa et al., 1983); при 9-недельном плавании крыс увеличивается на 30% ширина кардиомиоцитов (Frenzel et al., 1988); при измерении площадей поперечного сечения кардиомиоцитов правого желудочка в условиях гипобарической гипоксии (Абдулла и др., 1991а) и левого желудочка - при стенозе брюшной аорты (Проценко, 1996) крыс было найдено, что этот показатель может даже удваиваться при гипертрофии миокарда. Этот процесс сопровождается ростом массы саркоплазмы клеток, числа миофиламентов, величины и количества митохондрий (гиперплазия внутриклеточных ультраструктур). Увеличиваются размеры ядер кардиомиоцитов, хроматин становится менее конденсированным, наблюдается активация синтеза нуклеиновых кислот и белка, которые используются для наращивания массы миофибрилл и других внутриклеточных структур (Абдулла, 1992); повышается количество рибосом и гликогена (Меерсон, 1986; Непомнящих, 1991). Изменяются и параметры сократимого аппарата кардиомиоцитов - Z-полоски миофибрилл утолщаются и становятся нерегулярными, происходят изменения длины саркомера и формы полос, включая смещение миофибрилл, под сарколеммой обнаруживаются вновь образованные миофиламенты (Тен Эйк, Бассет, 1990; Perennec, Hatt, 1990). Зоны синтеза миофиламентов отличаются разрежением цитоплазмы, наличием свободных рибосом и неупорядоченных нитей миофибрилл (Непомнящих, 1986).
В гипертрофированном миокарде происходят также многочисленные биохимические изменения, в том числе изменение синтеза миозина и снижение его АТФ-зной активности, что связывают с изменением соотношения между изоферментами миозина (Тен Эйк, Бассет, » 1990); при устойчивой гипертрофии усиливается активность ряда окислительных ферментов - сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и других (Саркисов, Втюрин, 1967). На основании данных о регуляции экспрессии генов белков миокарда при повышении нагрузки на сердце полагают (Yazaki et al., 1993), что ключевой фактор изменения их экспрессии -активация протеинкиназы С, происходящая под влиянием гормонов, выброс которых повышен при росте нагрузки и в связи с изменением механических свойств кардиомиоцитов при увеличении гемодинамической нагрузки. Известно, что механическое натяжение кардиомиоцитов при перегрузке давлением активирует различные вторичные мэссенджеры (фосфатидилинозитол и др.), что в результате приводит к .интенсификации белкового синтеза. Ренин-ангиотензиновая система также связана с развитием гипертрофии, индуцированной перегрузкой давлением, так как ангиотензин II увеличивает рост кардиомиоцитов по аутокринному механизму (Yamazaki et al., 1998). Однако отмечается, что молекулярный механизм этих процессов требует дальнейших исследований (Пшенникова и др., 1999). 1.2.2. Митохондрии кардиомиоцитов при гипертрофии При сравнении данных, полученных в разных работах, об изменениях внутриклеточных компонентов кардиомиоцитов при гипертрофии, можно заключить, что особенно варьирует при этом соотношение относительных объемов миофибрилл и митохондрий — сократимого и энергопродуцирующего аппаратов этих клеток. Так, компенсаторная гипертрофия при развитии индуцированной (сужением брюшной аорты) и спонтанной артериальной гипертензии у крыс сопровождается возрастанием в кардиомиоцитах относительного объёма миофибрилл и уменьшением этого показателя для митохондрий (Непомнящих, 1991). Аналогичные изменения в соотношении относительных объемов миофибрилл и митохондрий отмечали при развитии гипертрофии левого желудочка в условиях перегрузки давлением через 10 и более суток при частичном пережатии нисходящей аорты (Page, McCallister, 1973), а также при гипертрофии правого желудочка через 5 и более суток в условиях гипобарической гипоксии (Абдулла, 1992). О снижении относительного объема митохондрий сообщалось также через 4 недели при развитии гипертрофии миокарда, индуцированной односторонним сужением почечной артерии (Wendt-Gallitelli, 1977), при этом чем при увеличении срока воздействия (до 24-х недель) это снижение становилось более выраженным.
Воздействие антиортостатического вывешивания на животных положении
Одной из центральных задач космической биологии и медицины является моделирование в земных условиях эффектов невесомости, характерных для космических полетов (Ильин, Капланский, 1998). В настоящее время существует целый ряд моделей, воспроизводящих эффекты невесомости на Земле (Коваленко, 1977; Ильин, Новиков, 1980; Morey-Holton, Globus, 2002). Одной из таких моделей, предложенной в конце семидесятых годов прошлого века одновременно отечественными (Ильин, Новиков, 1980) и зарубежными (Morey-Holton, 1979) исследователями, является вывешивание животных в антиортостатическом положении, используемое при работе с мелкими лабораторными животными, как правило крысами. Эта модель воспроизводит два основных эффекта невесомости - перераспределение жидких сред организма в краниальном направлении и снятие опорной нагрузки с задних конечностей (Ильин, Новиков, 1980; Morey-Holton, Wronski, 1981; Shellock et al., 1985). При этом животное находится под углом к горизонтальной плоскости, и его голова расположена ниже туловища (Ильин, Новиков, 1980; Shellock et al., 1985; Morey-Holton, Globus, 2002). Ряд существенных доработок такой модели (использование биологически инертных материалов для закрепления хвоста и др.) сделал возможным исследование животных после длительных периодов вывешивания — до 120 суток (Zhang, 1995). Важно отметить, что животное в течение эксперимента не лишено возможности двигаться, напротив, специальное приспособление наподобие рельсов на потолке клетки, к которым присоединяется устройство, фиксирующее хвост или заднюю часть туловища животного, делает возможным передвижение животного по клетке с помощью передних конечностей (Ильин, Новиков, 1980; Morey-Holton, Globus, 2002). 1.4.2. Характеристика изменений в организме млекопитающих при вывешивании их в антиортостатическом положении При помещении человека или животного в антиортостатическое положение в их организме происходит ряд взаимосвязанных функциональных изменений: смещение жидкости в кранио-каудальном направлении приводит к увеличению кровенаполнения мозга и легких, повышению венозного давления и венозного возврата сердца. При увеличении объема поступающей крови включаются в качестве компенсаторных реакций перемены в гормональном и водно-солевом обмене, такие как торможение секреции антидиуретического гормона, ренина. Эти изменения, в свою очередь, приводят к увеличению фильтрации жидкости во внесосудистое пространство, к усилению почечного плазмотока, диуреза и вывода электролитов (Коваленко, 1977; Кротов и др., 1977; Musacchia et al., 1980; Егоров, Ицеховский, 1983). Такие изменения приводят к нормализации объема крови в организме при антиортостатическом вывешивании.
У животных в начальный период вывешивания на протекание этого комплекса изменений накладывается еще и проявление стресс-синдрома, сроки протекания и глубина проявления которого описаны в литературе по-разному. В ряде работ отмечается низкая стрессорность модели вывешивания и подчеркивается, что уже за первые сутки эксперимента у крыс нормализуются поведенческие реакции, потребление пищи, сниженное в первые часы (Shellock et al., 1985; Philpott et al., 1992; Morey-Holton, Globus, 2002). Но на 45 этом этапе (первые - вторые сутки) у мышей показано подавление способности к обучению (Wu et al., 2000), а также повышение числа апоптических клеток в тимусе (Zhang et al., 2001). На 7 - 14 сутки эксперимента некоторые исследователи отмечали наличие у вывешенных животных умеренного хронического стресса, основываясь на показателях массы их тела, а также гипертрофии надпочечников (Musacchia et al., 1980; Ильин, Капланский, 1998). Показано, что признаки хронического стресса уже не выявляются на стадии 4-х недель вывешивания (Thomason et al., 1987). Реакция различных систем органов животных на пребывание в условиях имитации невесомости изучена неравномерно; большая часть публикаций в этой области касается изменений в скелетно-мышечной системе. Общим наблюдением авторов различных исследователей является атрофия мышц задних конечностей (в частности камбаловидной, несущей основную антигравитационную нагрузку) у экспериментальных животных, связанная, безусловно, с функциональной разгрузкой этих мышц при вывешивании (Musacchia et al., 1980; Allen et al., 1997; Desplanches, 1997; Григорьев и др., 2002). Через 4 суток вывешивания крыс в волокнах их камбаловидной мышцы описаны гиперплазия митохондрий, расширение Т-системы и хаотическое расположение миофибрилл (Wu et al., 2002). Атрофия обнаруживается уже на 5 сутки вывешивания, и проявляется как в снижении мышечной массы задних конечностей (Musacchia et al., 1980), так и в уменьшении площади сечения скелетных волокон (Desplanches, 1997). Через 2 недели пребывания крыс в антиортостатическом положении к этим изменениям в камбаловидных мышцах добавляются дегенерирующие изменения (Wu et al., 2002). С помощью иммуноцитохимических исследований было показано, что в таких атрофирующихся мышцах появляются апоптотические ядра (Allen et ah, 1997). При более длительных сроках — 4-х недельном вывешивании в атрофирующихся скелетных волокнах, замедляется работа Са АТФ-азы саркоплазматического ретикулума (Yang et al., 1997), уменьшается абсолютный объем митохондрий (Sun et al., 1998) и интенсивность дыхания межфибриллярных митохондрий (Yajid et ah, 1998). Известно, что атрофия скелетной мускулатуры крыс в условиях невесомости характеризуется аналогичными изменениями морфо-функциональных параметров, что и атрофия в результате вывешивания, что оправдывает широкое использование данной модели (Ильин, Капланский, 1998). Пребывание в вывешенном состоянии приводит у крыс также к изменениям гематологических показателей. За 14 суток воздействия происходит некоторое угнетение эритропоэза (на что указывает уменьшение содержания эритропоэтина и числа ретикулоцитов), что связывают с уменьшением потребности организма в кислороде вследствие снижения нагрузок на опорно-двигательный аппарат (Ильин, Капланский, 1998). Также были получены данные, указывающие, что за 30 суток эксперимента увеличивается число аномальных по форме эритроцитов и уменьшается текучесть их мембраны (Dong et al., 1997).
Исследования в этой области могут способствовать выяснению причин анемии в условиях космических полетов (Dong et al., 1997). Биохимический состав крови крыс в условиях пребывания в искусственной невесомости также меняется. В частности, зарегистрированы снижение концентрации в крови гормона роста, тироксина и трииодтиронина. Снижение содержания двух последних гормонов в сочетании с морфологическими признаками гипофункции щитовидной железы (Логинов, 1993) связывают с общим угнетением активности эндокринных желез, обусловленным торможением функциональной активности аденогипофиза (Ильин, Капланский, 1998). Аналогичные изменения характерны для организма крыс при их пребывании в невесомости (Логинов, 1993; Ильин, Капланский, 1998). При вывешивании крыс у них происходит перестройка водно-солевого гомеостаза -через 2 недели в почках увеличивается содержание воды, натрия, калия и магния, что связано с вышеописанным перераспределением жидкостей в организме при использовании данной модели (Лаврова и др., 1993). Однако, аналогичные изменения у животных после их космического полета не выявляются, что связывают с менее выраженным перераспределением жидкостей при пребывании в невесомости по сравнению с вывешиванием (Лаврова и др., 1993). В миокарде крыс как в условиях невесомости, так и при моделировании ее эффектов на модели антиортостатического вывешивания содержание воды и ионов (натрия, калия, кальция, магния) находится в норме (Лаврова и др., 1993). Обобщая целый ряд работ, посвященных исследованию различных систем органов животных в условиях космических полетов и при антиортостатическом вывешивании, можно заключить, что модель вывешивания в антиортостатическом положении является адекватной для исследования механизмов влияния невесомости на скелетно-мышечный аппарат задних конечностей, органы репродуктивной, иммунной и эндокринной систем (Morey-Holton, Globus, 2002). Однако изменения в выделительной, центральной нервной системах (Краснов и др., 1993), в биохимическом составе крови и печени значительно различаются у животных полетной и вывешенной групп (Ильин, Капланский, 1998). Часть этих расхождений связывают с развитием у животных полетной группы после возвращений на Землю так называемого острого гравитационного стресса, тогда как у вывешенных животных после окончания эксперимента признаков острого стресса не отмечают (Ильин, Капланский, 1998).
Воздействие гипергравитации 2G
Через 5 суток воздействия гипергравитации 2G при морфометрическом анализе на светооптическом уровне обнаружено, что площади поперечного сечения кардиомиоцитов и число капилляров не изменяются относительно контроля, при этом достоверно увеличивается от контроля на 21% средний диаметр капилляров (рис. 2а-б). Морфометрический анализ на электронномикроскопическом уровне показал, что проявляется тенденция (здесь и далее термин «тенденция» применяется при статистически недостоверном различии, но при р близком к 0,05, а именно при р 0,15) к уменьшению относительного объема митохондрий в клетках (рис. 2а). I Ультраструктура большинства митохондрий и других компонентов клеток остается ортодоксальной как и в контроле (рис. 7а); в ряде кардиомиоцитов наблюдались нарушения структуры сократимых элементов - разволокнение миофиламентов, их локальный лизис (рис. 76). На этом сроке опыта не было отмечено изменений в численной плотности митохондрий (рис. 3), но происходит изменение длины митохондрий: в межфибриллярной области в 8 раз чаще, чем в контроле, встречаются длинные органеллы (рис. 4, 76). Число крист снижается только в митохондриях межфибриллярной зоны (рис. 5). Число ММК , достоверно возрастает от контроля в среднем по клетке на 32 % и во всех зонах кардиомиоцитов, что особенно выражено в околоядерной зоне — на 33 %, и в субсарколеммальной околососудистой зоне - на 43 % (рис. 6). Ультраструктура ММК (их протяженность, электронная плотность) визуально не подвергается изменениям на протяжении всего эксперимента. После 19-суточного воздействия гипергравитации 2G развивается гипертрофия кардиомиоцитов: средняя площадь их поперечного сечения, а также ядер достоверно возрастает соответственно на 41% и 17 % по сравнению с аналогичными значениями у крыс контрольной группы (рис. 2а). Число капилляров, приходящееся на один кардиомиоцит, имеет тенденцию к увеличению на 10% по сравнению с контролем. При этом средний диаметр капилляров не изменяется по сравнению с предыдущим сроком эксперимента - он на 23% выше, чем у контрольных крыс (рис. 26 ). Морфометрический анализ, проведенный на ультратонких срезах показал, что на данном сроке воздействия относительные объемы миофибрилл и митохондрий по сравнению с контролем значимо не изменяются (но относительный объем митохондрий имеет тенденцию к снижению) (рис.2а). При анализе ультраструктуры клеток на этом этапе было отмечено, что в отдельных кардиомиоцитах встречаются места отека саркоплазмы, чаще наблюдаемые в околоядерной области, однако митохондрии в зонах отека, как правило, не набухают и имеют нормальную ультраструктуру (рис. 8а).
Как и на предыдущем сроке опыта иногда встречались нарушения структуры миофибрилл (рис. 8а). В субсарколеммальных областях встречались миофиламенты, лежащие перпендикулярно основному ходу миофибрилл в клетке (рис. 8 в). Численная плотность митохондрий остается на уровне контроля (рис. 3), при этом изменяются размеры митохондрий: в околоядерной зоне клетки отмечена тенденция к увеличению доли средних по размеру митохондрий (рис.4). Значительно чаще - в 10 раз, чем в контроле встречаются длинные межфибриллярные митохондрии, некоторые из которых достигают 7 мкм (рис. 8 б), число крист в органеллах этой зоны повышается до контрольного уровня (рис. 5). Количество ММК держится на высоком относительно контроля уровне - выше на 22% в среднем по клетке (рис. 6а), однако в околоядерной и субсарколемальной околососудистой зонах число этих структур меньше по сравнению с уровнем, достигнутом за 5 суток воздействия 2G (рис. 66). р Для анализа способности гипертрофированных кардиомиоцитов и их митохондриома к восстановлению параметров к исходному уровню после прекращения гипергравитационного воздействия была исследована обратимость изменений в I и II экспериментах. Результаты в данном пункте рассматриваются в сравнении с контролем и с результатами через 19 суток 2G, то есть с предыдущей точкой опыта. Через 30 суток после снятия 19-суточного воздействия гипергравитации 2G средние площади поперечного сечения кардиомиоцитов и их ядер значительно повышены - соответственно на 33% и 36% от контрольного уровня (рис. 2а). Число капилляров, » приходящееся на один кардиомиоцит, достоверно выше на 18 %, чем в норме. Капилляры в миокарде левого желудочка всё ещё расширены, их средний диаметр остаётся достоверно увеличенным (на 13 %) по сравнению с контролем, однако он достоверно меньше на 8 %, чем соответствующий показатель на предыдущем сроке опыта - после 19-суточного гипергравитационного воздействия (рис.2б). Как и при 5- и 19-суточном действии 2G, на данном этапе относительный объем миофибрилл находится в пределах нормы, но относительный объем митохондрий имеет тенденцию к снижению от контроля (рис.2а). При анализе ультраструктуры кардиомиоцитов было отмечено, что значительно реже, чем при 19-суточном действии гипергравитации встречается отечность саркоплазмы, в целом , кардиомиоциты имеют нормальную ультраструктуру (рис. 9). В субсарколеммальной околососудистой зоне клеток повышается численная плотность митохондрий по сравнению с нормой и предыдущим этапом (рис. 3), что сопровождается по сравнению с предыдущим сроком опыта некоторым (недостоверным) снижением числа средних органелл и ростом числа мелких (рис. 4). Число крист в митохондриях этой зоны снижается по сравнению с контролем и предыдущим этапом эксперимента (рис. 5). В околоядерной области распределение митохондрий по размерам возвращается к контрольным значениям (рис.4), число же крист при этом незначительно снижается (рис. 5). На этом этапе сохраняются в относительно большом количестве длинные межфибриллярные митохондрии (рис. 96). По числу ММК в кардиомиоцитах не происходит изменений по сравнению с предыдущей точкой эксперимента (рис. 6), то есть число ММК остается повышенным и не возвращается к контрольному уровню во всех зонах локализации митохондрий в клетке.
После 5 суток повторного действия гипергравитации 2G (после 19-суточного первого воздействия и последующего 30-суточного пребывания в условиях нормальной гравитации) площадь поперечного сечения кардиомиоцитов несколько уменьшается по сравнению с & предыдущим сроком эксперимента, оставаясь на 27 % выше соответствующего контрольного значения (рис. 2а). Площадь поперечного сечения ядер этих клеток также снижается при повторном воздействии гипергравитации, однако этот показатель остается на 21 % выше, чем в контроле (рис. 2а). Число капилляров, приходящееся на один кардиомиоцит, остается на повышенном уровне, в то время как диаметр капилляров значительно уменьшается и достигает значений, характерных для контрольной группы (рис.2б). Относительный объем митохондрий в саркоплазме кардиомиоцитов достоверно уменьшается от уровня контроля (рис. 2а). При электронномикроскопическом анализе клеток на данном этапе эксперимента вновь изредка заметна локальная отечность саркоплазмы, отмеченная ранее при 19-суточном гипергравитационном воздействии, однако большинство клеток выглядят неизмененными(рис. 10а). Ультраструктура большинства митохондрий ортодоксальная, но изредка встречались органеллы с локальной деструкцией крист (рис. 106). Численная плотность митохондрий изменяется только в околососудистой субсарколеммальной зоне - она имеет тенденцию к снижению от значения на предыдущем сроке опыта (рис. 3). Анализ размеров митохондрий в разных зонах их локализации в клетке показал, что в околоядерной и околососудистой субсарколеммальной зонах соотношение числа митохондрий разной длины не отличается от наблюдаемого на предыдущем сроке эксперимента. В межфибриллярной зоне число длинных митохондрий гораздо выше, чем в контроле, как и на других этапах эксперимента (рис. 4). Число крист находится в пределах нормы в митохондриях околоядерной и межфибриллярной зон, в митохондриях околососудистой субсарколеммальной зоны оно снижено по сравнению с контролем, как и на предыдущем сроке воздействия (рис. 5). При повторном действии 2G изменяется степень ассоциативности митохондрий — « число ММК снижается в среднем по клетке от предыдущей точки, но остается выше, чем в контроле (рис. 6а); при анализе по зонам выявлено, что впервые за весь срок эксперимента этот параметр достигает контрольного значения в околоядерной зоне; в межфибриллярной - остается на повышенном относительно контроля уровне; в субсарколеммальной околососудистой зоне снижается, но не достигает уровня контроля (рис. 6 б). Эксперимент II Последовательность изложения в этом подразделе строго соответствует последовательности, принятой в подразделе "Эксперимент I", так как схемы этих экспериментов совпадают (динамика воздействия - пребывание в условиях нормальной гравитации - повтор воздействия), различаются же сроки первого воздействия, перерыва после него, что подробно описано в разделе "Материал и методы исследования
Воздействие вывешивания в антиортостатическом положении
В данном подразделе порядок изложения результатов соответствует принятому в подразделе, посвященному I и II экспериментам с гипергравитацией, будут описаны те же морфо-функциональные параметры, что и в предыдущем подразделе. После 14-суточного вывешивания в антиортостатическом положении морфометрический анализ миокарда на светооптическом уровне показал, что площади поперечного сечения кардномиоцитов на этом этапе снижены на 7% относительно контроля, также отмечена тенденция к снижению площадей поперечного сечения ядер (рис. 19а). При этом обнаружено увеличение на 10 % относительного числа капилляров (рис. 196). В результате морфомегрического анализа на электронно-микроскопическом уровне обнаружено, что относительный объем миофибрилл и митохондрий в саркоплазме кардиомиоцитов находится в пределах нормы (рис. 19а). При электронномикроскопическом исследовании выявлено, что ультраструктура митохондрий, а также других компонентов кардиомиоцитов на данном этапе опыта не подвергается изменениям по сравнению с контролем (рис. 20). Численная плотность митохондрий всех зонах локализации в клетке также не изменяется по сравнению с контролем (рис. 21). При этом увеличивается доля мелких органелл в околоядерной и субсарколеммальной околососудистой зонах и соответственно снижается доля средних митохондрий в этих зонах (рис. 22). Число крист в митохондриях находится в пределах нормы во всех зонах (рис. 23). Число ММК при 14-суточном сроке вывешивания соответствует контролю во всех зонах (рис. 24). Ультраструктура ММК тоже сохраняется без изменений, как на этом, так и на последующих этапах эксперимента по вывешиванию. « После 30-суточного вывешивания в антиортостатическом положении при морфометрическом анализе полутонких срезов обнаружено уменьшение на 16,5 % относительно контроля площадей поперечного сечения кардиомиоцитов, площади поперечного сечения ядер снижаются более выражено - на 30 % от контроля (рис. 19а). Вместе с тем происходит увеличение на 11 % от нормы относительного числа капилляров (рис. 196). В то же время на электронно-микроскопическом уровне не обнаружено изменений в значениях относительных объемов как миофибрилл, так и митохондрий в саркоплазме по сравнению с контролем (рис. 19а). На данном этапе эксперимента были обнаружены различные изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов (рис. 25). В некоторых митохондириях матрикс локально просветляется, происходит локальная деструкция крист (лизис), причем такие изменения могут затрагивать часть митохондрии или же практически всю органеллу (рис. 256). Митохондрии с такими нарушениями чаще наблюдались в околоядерной и субсарколеммальной околососудистой зонах (рис. 25 а, в).
Следует отметить, что вышеописанные нарушения встречались регулярно, но они не затрагивали большинство митохондрий, при визуальной оценке нарушенную ультраструктуру имела одна митохондрия из десяти органелл. Сократимый аппарат кардиомиоцитов при этом сохранял нормальное строение (рис. 25а). Численная плотность митохондрий во всех зонах их локализации в клетке не „ изменяется относительно контроля (рис. 21). При анализе размеров митохондрий было отмечено, что в околоядерной зоне число средних органелл меньше, чем в контроле, в субсарколеммальной околососудистой зоне распределение митохондрий по размерам соответствует контрольному (рис. 22). Число крист в митохондриях всех зон не изменяется на данном сроке вывешивания (рис. 23). Число ММК возрастает в среднем на клетку на 10 % относительно контроля (рис. 24 а), но при анализе по зонам видно неравномерное изменение этого показателя: в околоядерной зоне он повышается на 27 %, в межфибриллярной проявляется лишь тенденция к его росту по сравнению с контролем, в "почках" же число ММК не изменяется относительно контроля (рис. 24 б). Через 30 суток после окончания 30-суточного антиортостатического вывешивания («отдых») площади поперечного сечения кардиомиоцитов и их ядер увеличиваются по сравнению с аналогичными показателями на предыдущем этапе соответственно на 11 % и 25 %, но оба параметра остаются ниже контрольного уровня соответственно на 7 % и 13 % (рис. 19а). В тоже время число капилляров, приходящееся на один кардиомиоцит, не изменяется по сравнению с предыдущим этапом эксперимента (рис. 196). Методами морфометрического анализа на ультраструктурном уровне было установлено, что относительный объем миофибрилл и митохондрий находится в пределах нормы (рис. 19а). При ультраструктурном анализе было замечено, что среди митохондрий некоторые органеллы видоизменены — они отличаются просветленным матриксом и локальной деструкцией крист (рис. 26 а, б), то есть наблюдались изменения аналогичные тем, которые были описаны на предыдущем этапе — после 30- суточного вывешивания. Также были обнаружены изменения в лизосомах. Вторичные лизосомы встречались чаще, чем в норме, и не только на полюсах ядер, что характерно для интактных кардиомиоцитов, но и в других зонах клеток (рис. 26а); к тому же в околоядерной зоне на данном этапе опыта нередко наблюдались аутофагосомы (рис. 26в). Визуально отмечалось повышение числа мультивезикулярных телец, локализованных в разных зонах кардиомиоцитов (рис. 26г). Численная плотность митохондрий не изменяется в данных условиях. Однако, изменяется распределение этих органелл по размерам: в околоядерной зоне оно возвращаются к контрольным значениям; в межфибриллярной зоне, напротив, число мелких органелл ниже контрольного уровня (а средних, соответственно, выше); в "почках" не обнаружено изменений по этому параметру (рис. 22). Число крист повышается недостоверно (проявляется тенденция) по сравнению с контролем в околоядерной зоне, и имеет тенденцию к снижению от контроля в субсарколеммальной околососудистой зоне (рис. 23).
Число ММК снижается по сравнению со значением через 30 суток вывешивания как в целом на клетку (рис. 24 а), так и при расчете отдельно по зонам: в околоядерной и в межфибриллярной зонах - до контрольного уровня; в субсарколеммальной околососудистой зоне число ММК оказывается даже ниже контрольного уровня (рис. 24 б). Через 14 суток повторного антиортостатического вывешивания (после первого 30-суточного вывешивания и последующего 30-суточного перерыва) площадь поперечного сечения кардиомиоцитов совпадает с контрольным значением, то есть этот параметр повышен относительно аналогичного параметра на предыдущем этапе опыта на 10 % (рис. 19а). При этом площадь ядер кардиомиоцитов также находится в пределах нормы, что означает рост площади ядер (на 13 %), как и рост площади клеток по сравнению с предыдущим этапом (рис. 19а). Число капилляров остается на высоком по сравнению с контролем уровне и не изменяется после предыдущего срока (рис. 196). При морфометрическом анализе установлено, что значения относительных объемов миофибрилл и митохондрий на этом этапе по-прежнему значимо не изменяются относительно контрольных значений, при этом выражена тенденция к повышению относительного объема миофибрилл по сравнению со значением на предыдущем этапе - при «отдыхе» (рис. 19а). При анализе ультраструктуры клеток на данном этапе эксперимента были обнаружены митохондрии с нарушенной ультраструктурой, причем характер повреждений этих органелл был таким же, как и на предыдущих этапах - наблюдались места локальных просветлений матрикса с отсутствием крист, более частыми эти картины были в околоядерной области (рис. 27а). Однако большинство митохондрий, а также миофибриллы сохраняли нормальную ультраструктуру (рис. 276). Отмеченное на предыдущем этапе увеличение числа лизосом и мультивезикулярных телец не было характерным для данного этапа эксперимента. Численная плотность митохондрий не изменена по сравнению с контролем на этом этапе, как и на предыдущих этапах, только в межфибриллярной зоне обнаружена тенденция к снижению этого показателя от нормы (рис. 24). В распределении митохондрий по размерам происходят следующие изменения: в околоядерной зоне по сравнению с контролем и «отдыхом» незначительно снижается доля средних органелл; в межфибриллярной - как и на предыдущем этапе доля средних митохондрий выше, чем в норме, а мелких - ниже; в « субсарколеммальной околососудистой зоне этот параметр не отличается от контроля (рис. 22). Подсчет числа крист в митохондриях показал, что в околоядерной зоне их число снижается достоверно на 12 % относительно предыдущего этапа - «отдыха», в межфибриллярной зоне продолжает оставаться в пределах нормы, в субсарколеммальной околососудистой - поднимается на 17 % от значения на предыдущем этапе (рис. 23).
