Содержание к диссертации
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И ТЕРМИНОВ 6
ВВЕДЕНИЕ 9
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1. Характеристики сердечных фибробластов 15
2. Общие представления о механосенситивности и механосенситивном канале 22
3. Роль механосенситивных каналов в механизмах генерации
механоиндуцированного потенциала 24
4. Функциональная классификация МСК 25
5. Роль внутриклеточного Са2+ в генерации механоиндуцированного потенциала.... 27 6. Роль механосенситивных каналов в формировании электрического ответа
клетки 31
7. Роль цитоскелета в регуляции воротного механизма МСК и в механизмах
генерации механоиндуцированного потенциала -...", 32
8. Зависимость механоиндуцированных потенциалов фибробластами сердца
от возраста животных 37
9. Характеристика ишемии миокарда 38
10. Фибробласты предсердий животных, перенесших инфаркт миокарда,
как субстрат механоэлектрической обратной связи 41
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46
1. Объект исследований 46
2. Метод получения инфаркта левого желудочка 47
3. Метод электрокардиографии 47
4. Метод получения препарата правого предсердия 48
5. Метод получения препарата из околорубцовой зоны левого желудочка
крыс, перенесших инфаркт миокарда 49
6. Получение изолированных фибробластов 50
7. Перфузионная среда для микроэлектродных исследований ткани 51
8. Растворы для исследований изолированных фибробластов методом patch-clamp... 51
9. Микроэлектроды 52
10. Patch-пипетки 53
11. Экспериментальная установка для микроэлектродных исследований
клеток в ткани 54
Электронно-измерительная система 54
Система жизнеобеспечения изолированного препарата сердца 54
Электронно-измерительная аппаратура для регистрации сократительной активности фрагментов сердца и их механической
стимуляции 55
12. Факторы воздействия на клетки при микроэлектодных исследованиях 56
"Л
Электрические стимулы \. .7. 57
Механические раздражители 57
12.3.Создание гипоксии 57
13. Экспериментальная установка для исследований ионных
токов фибробластов методом patch-clamp в конфигурации whole-cell 58
Электронно-измерительная система 58
Система жизнеобеспечения изолированных фибробластов 59
14. Воздействия на клетки при исследованиях методом patch-clamp 59
Электрические стимулы 60
Химические соединения 60
Механические раздражители .60
15. Характеристика регистрируемых параметров при микроэлектродых
исследованиях 61
Характеристика регистрируемых параметров фибробластов 61
Характеристика регистрируемых параметров кардиомиоцитов 62
16. Характеристика регистрируемых параметров при исследованиях методом
patch-clamp 63
17. Методы обработки результатов экспериментов 63
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 64
ЧАСТЬ 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИОННЫХ ТОКОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
ПРИ ИХ СЖАТИИ И РАСТЯЖЕНИИ 64
1. Электрофизиологическая идентификация недеформированных
сердечных фибробластов 64
2. Сжатие и растяжение фибробластов 66
Сжатие фибробластов увеличивает мембранную проводимость 66
Растяжение уменьшает проводимость мембраны фибробластов 68
Исследование вольт-амперных характеристик на фоне сжатия
и растяжения клетки 70
3. Обсуждение 72
ЧАСТЬ 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГИПОКСИИ/РЕОКСИГИНАЦИИ НА
ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФИБРОБЛАСТОВ В ТКАНИ СЕРДЦА 76
1. Электрофизиологические свойства фибробластов
при высоком напряжении кислорода (80 кРа) 76
2. Электрический ответ сердечных фибробластов на гипоксию\реоксигенацию
и его корреляция с resting force и active force 77
3. Влияние растяжения на электрофизиологические параметры сердечных
фибробластов в условиях высокого напряжения кислорода 80
4. Изменения потенциала покоя фибробластов предсердия
и частоты спонтанных сокращений препарата в период гипоксиии/реоксигенации 82
5. Обсуждение 83
ЧАСТЬ 3. ИЗУЧЕНИЕ РОЛЬ ФИБРОБЛАСТОВ ЖЕЛУДОЧКА
В МЕХАНО-ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ НА ФОНЕ
ПОСТИНФАРКТНОГО РЕМОДЕЛИНГА 87
1. Характеристика сердца в процессе постинфарктного ремоделинга 87
Идентификация зоны инфаркта 87
Характеристики кардиомиоцитов из зоны прилегающей к рубцу 88
Основные электрофизиологические характеристики фибробластов
в процессе ремоделинга 91
/. 4. Обсуждение 92
1.4.1. Электрофизиологические свойства сердечных фибробластов
после инфаркта миокарда 95
1.4.2.Возможная роль фибробластов желудочков после инфаркта миокарда как субстрата
механоэлектрической обратной связи 98
2. Фибробласты левого желудочка как субстрат механоэлектрической обратной
связи в сердце после инфаркта миокарда левого желудочка 99
2.1. Характеристики механоэлектрической обратной связи у фибробластов..... .99
2.2.0бсуждение 105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ 116
БЛАГОДАРНОСТЬ 118
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .....119
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И ТЕРМИНОВ
Механоэлектрическая обратная связь (Contraction-excitation feedback или mechanoelectric feedback), в результате которой механические изменения в миокарде приводят к изменению в нем электрических процессов.
Resting force - изометрическая сила, регистрируемая у несокрашающейся мышцы (или в период между сокращениями), которая одним концом прикреплена к механоэлектрическому преобразователю, а другой ее конец зафиксирован. При растяжении мышцы со стороны точки фиксации можно измерять величину resting force в зависимости от величины растяжения.
Active force - изометрическая сила, регистрируемая у мышцы в период сокращения. Мышца одним концом прикреплена к механоэлектрическому преобразователю, а другой ее конец зафиксирован.
АР (action potential) - потенциал действия.
APD (action potential duration) - длительность потенциала действия.
Натяжение мембраны (tension) - механическое натяжение мембраны клетки в результате приложенной силы.
Patch-clamp - метод, который позволяет на изолированных клетках регистрировать их потенциалы (в режиме фиксации тока) или токи (в режиме фиксации потенциала) или одиночные ионные каналы посредством специальной стеклянной пипетки (patch-пипетки), напоминающей микроэлектрод, но не имеющей колющей части. Кроме того, метод позволяет регистрировать ионные каналы с изолированного кусочка мембраны, который может быть расположен по отношению к отверстию patch-пипетки либо внешней, либо внутренней стороной. Метод patch-clamp применяется в разных конфигурациях.
Конфигурация patch-clamp cell-attached - возникает когда patch-пипетку подводят вплотную к мембране изолированной клетки и создают в ней небольшое отрицательное давление. По существу это присасывание patch-пипетки к мембране - suction. Это приводит к тому, что мембрана плотно закупоривает отверстие patch-пипетки и формируется высокоомный контакт - cell-attached, или иначе, пипетка-мембрана с переходным сопротивлением более 1 GD. (так называемая giga seal).
Конфигурация patch-clamp inside-out patch - формируется из конфигурации cell-attached путем резкого отрывания patch-пипетки от клетки, причем giga seal не меняется. В результате на patch-пипетке находится лишь фрагмент мембраны, внутренняя сторона которой смотрит в омывающий раствор перфузионной камеры, а внешняя сторона контактирует с содержимым patch-пипетки.
Конфигурация patch-clamp whole-cell - формируется из конфигурации cell-attached двумя путями. В одном случае в patch-пипетку необходимо резко подать небольшое отрицательное давление, что разрывает мембрану под patch-пипеткой и образуется низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в patch-пипетке). В другом случае низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в patch-пипетке формируется за счет влияния соединений, находящихся в patch-пипетке, которые вызывают образование в мембране пор, проницаемых для ионов, но не для молекул. Это, так называемый, перфоративный patch.
Конфигурация patch-clamp outside-out patch формируется из конфигурации whole-cell путем медленного оттягивания patch-пипетки от клетки. Это заставляет мембрану растягиваться до тех пор, пока она не отделится от клетки и не сошьется. Теперь внутренняя часть мембраны будет контактировать с раствором в пипетке, а внешняя часть мембраны с омывающим раствором в перфузионной камере.
Механосенситивный канал (МСК) - ионный канал, который узнает механическую деформацию мембраны клетки как полноценный физиологический сигнал и его
проводимость является ответом на деформацию мембраны. Механическое воздействие меняет вероятность того, что канал будет открыт. Вместе с тем, слово сенситивность или чувствительность в русском языке, имеет несколько иной оттенок, чем требуется для определения этого типа канала. Этот тип каналов не просто чувствителен к механическому фактору как многие ионные каналы, но его работа управляется механическим воздействием. Поэтому, правильнее было бы назвать механосенситивный канал механоуправляемым. Однако мы оставляем это название МСК, поскольку оно прочно вошло в мировую литературу.
Stretch-activated channels (SAC) - механосенситивные ионные каналы, активирующиеся при растяжении мембраны клетки. С этим термином связаны определенные проблемы. Исторически, каналы, реагирующие на любой механический стресс, были названы SAC. Позже были описаны stretch-inactivated channels (SIC). Далее, появились данные о pressure activated channels (РАС). Поэтому, для обозначения ионного канала, который узнает механическую деформацию мембраны клетки, был введен общий термин -механосенситивный канал (МСК). Именно как МСК и следует рассматривать термин SAC в части ранних работах в этом направлении, stretch-inactivated channels (SIC) -механосенситивные ионные каналы, инактивирующиеся при растяжении мембраны.
I-V кривая - вольт-амперная характеристика (кривая) клетки.
I-V кривая аномального выпрямления с током входящего направления - I-V кривая для invard rectifier К+ channels.
I-V кривая аномального выпрямления с током выходящего направления - I-V кривая для outvard rectifier К+ channels.
[Ca2+]j - внутриклеточная концентрация кальция.
Введение к работе
Миокард содержит две различных популяции клеток. Первая популяция - миоциты, представляющие собой электровозбудимые сократительные клетки и вторая популяция -сопутствующие немышечные клетки, которые электроневозбудимы. К ней относятся различные типы клеток, в том числе фибробласты [182,189,198]. Фибробласты достаточно широко представлены в сердце [182,189,198]. В среднем, в целом сердце млекопитающих, фибробластов приблизительно 5% - 10% от общего количества клеток [30]. Однако их количество особенно велико в зоне синусного узла, где по данным разных авторов оно составляет от 45% [248] до 75% [64] общего количества клеток синусного узла. Хотя в сердце представлены различные немышечные клетки, фибробласты среди них доминируют. Показано, что среди всех немышечных клеток сердца их более 90% [70].
Такое значительное количество этих клеток в сердце позволило предположить, что они играют роль не только структурного скелета, но выполняют и другие функции. В первую очередь было показано, что фибробласты сердца синтезируют и выделяют различные биологически-активные вещества [27,44,45,51,54,55,71,75,93,177,194,243,251, 267,271,272,276,278,282], и, следовательно, принимают участие в регуляции работы сердца [44,71,243,271,276,277,278,282]. Однако, как показано в последние годы, эти клетки играют роль и в процессах электрогенеза здорового сердца и сердца с различными патологиями. В 1986 году A. Kamkin и I. Kiseleva впервые опубликовали данные об электрофизиологических свойствах сердечных фибробластов в целом бьющемся сердце, изолированном сердце или в его фрагментах. Более того, было описано межклеточное электротоническое взаимодействие этих клеток [9,128,129]. Поскольку в те годы авторы еще не сделали гистологические исследования, клетки первично были названы как "атипичные" немышечные клетки сердца [6,7,8,10,15]. Позднее, в исследованиях с одновременным применением микроэлектродной техники и гистологических методов, было показано, что изучаемые "атипичные" клетки сердца являются фибробластами [135,166], обладающими выраженной реакцией на механическое воздействие [11,12,152]. Эти
исследования были проведены с целью идентификации механосенситивных, электроневозбудимых фибробластов предсердий посредством совместного использования электрофизиологических методов с внутриклеточным введением маркеров (люцифер желтый и коллоидное золото) и гистологических методов с последующей электронной микроскопией. Кроме того, были изучены характерные электрофизиологические особенности этих клеток, как кандидатов для реализации механизма механоэлектрической обратной связи в сердце [11,12].
Большинство вызванных растяжением изменений сердечного ритма можно объяснять прямым влиянием механического стимула на различные типы кардиомиоцитов. Однако, возможное физиологическое и патофизиологическое влияние немышечных клеток на электрофизиологические показатели сердечной деятельности и механочувствительность не должны игнорироваться. Например, множество недавних экспериментальных [258] и клинических исследований [287] связывают вызванные растяжением аритмии со степенью фиброза в сердечной ткани [121]. Было предположено, что это частично может быть вызвано эффектами растяжения, передаваемого через немышечные клетки [163]. Следовательно, для всестороннего понимания механоэлектрической обратной связи в сердце полезно обсуждать эффекты растяжения на различных клеточных популяциях сердца, включая фибробласты.
Заболевания сердца, особенно связанные с изменением и нарушением коронарного кровотока (гипоксией, ишемией, инфарктом миокарда) приводят к структурным изменениям миокарда и изменению его электрофизиологических свойств (структурный и электрофизиологический ремоделинг). Электрическая нестабильность сердца в условиях изменившейся гемодинамики часто приводит к возникновению аритмий и фибрилляции сердца. Однако почти все исследования механизмов нарушения ритма при этих заболеваниях были связаны с кардиомиоцитами. При этих заболеваниях увеличивается число фенотипически измененных, механочувствительных электроневозбудимых фибробластов, которые могут служить еще одним субстратом механоэлектрической
обратной связи, которая, как следует из литературных данных, играет большую роль в развитии аритмий.
Электрофизиологическая роль фибробластов сердца в условиях его патологии только начинает изучаться. В этом направлении существуют лишь единичные работы. Кроме того, не известны ионные механизмы потенциалов этих клеток.
Исходя из этих предпосылок была сформулирована цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось определение механизмов возникновения механоиндуцированных потенциалов фибробластов и их роли в реализации механизмов механоэлектрической обратной связи в сердце на фоне ишемии и после инфаркта миокарда.
Исследование включало решение следующих задач:
Изучение токов у недеформированных изолированных фибробластов сердца.
Изучение влияния сжатия и растяжения изолированных сердечных фибробластов на ионные токи и их связь с потенциалами этих клеток.
Изучение вклада механосенситивных ионных каналов в электрические ответы фибробластов в ткани сердца в ответ на механическое воздействие.
4. Изучение электрического ответа сердечных фибробластов на гипоксикЛ
реоксигенацию и корреляции этого ответа с resting force и active force.
Влияние растяжения препаратов здорового сердца на электрофизиологические свойства фибробластов желудочков крысы, как кандидатов для реализации механоэлектрической обратной связи.
Изучение электрофизиологических особенностей кардиомиоцитов и фибробластов левого желудочка в процессе ремоделинга при инфаркте его миокарда.
Изучение механоэлектрической обратной связи у фибробластов в препаратах левого желудочка в процессе ремоделинга при инфаркте его миокарда.
Диссертация состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.
В обзоре литературы, в соответствии с намеченной целью исследования, даются
представления о механоэлектрической обратной связи в сердце, рассматривается известная
роль фибробластов в реализации механизма механоэлектрической обратной связи в
здоровом сердце и в предсердиях после инфаркта миокарда. Приведены общие
характеристики сердечных фибробластов. Даны общие представления о
механосенситивности и механосенситивном канале (МСК). Обсуждается роль МСК в
механизмах генерации механоиндуцированного потенциала и представлена
функциональная классификация МСК. Рассматривается роль внутриклеточного Са2+ и роль
механосенситивных каналов в генерации механоиндуцированного потенциала. Показана
роль цитоскелета в регуляции воротного механизма МСК и в механизмах генерации
механоиндуцированного потенциала. Далее обсуждается зависимость
механоиндуцированных потенциалов фибробластов сердца от возраста животных. Приведены данные об ишемии миокарда. Наконец, представлены характеристики механоэлектрической обратной связи фибробластов предсердий у животных, перенесших инфаркт миокарда.
В главе, посвященной материалам и методам исследований, охарактеризован объект исследований - сердце крысы. Описаны метод получения инфаркта миокарда левого желудочка у крыс; метод выделения фрагмента правого предсердия, содержащего синусный узел и фрагмента левого желудочка околорубцовой зоны. Описаны использованные в работе микроэлектроды; экспериментальная установка, состоящая из системы жизнеобеспечения исследуемых тканей и электронно-измерительной системы, и позволяющая одним микроэлектродом регистрировать внутриклеточную электрическую активность и одновременно осуществлять искусственную поляризацию мембраны; приведены электрические и механические факторы воздействия на ткань сердца и на летки; метод получения изолированных фибробластов; экспериментальная установка, позволяющая регистрировать токи изолированных фибробластов методом patch-clamp в
конфигурации whole-cell; приведены используемые химические соединения; представлены характеристики регистрируемых параметров и принципы их компьютерной обработки.
