Содержание к диссертации
Введение
CLASS Глава I Обзор литературы 1 CLASS 2
1.1. Введение 12
1.2. Строение ЛЬ+/&Ґ"АТФазьі 15
1.2.1. Общее строение Na77ҐАТФазы 18
1.2.2. а - субъединица 21
1.2.3. р - субъединица 25
1.2.4. Семейство FXYD белков (у-субъединица) 27
1.2.5. Анкирины 28
1.3. Работа Na/іСКїФгзьі 29
1.4. Влияние напряжения кислорода на синтез АТФ 33
1.5. Значение уровня свободных радикалов для клетки 35
1.6. Активность миелопероксидазы (МП) в сердце при ишемии 43
1.7. Предполагаемые механизмы регуляции Лга+/ЛГ+АТФазы
в условиях разного напряжения кислорода 44
Глава II Материалы и методы исследований 46
2.1. Объект исследований 46
2.2. Используемые растворы и реактивы 47
2.3. Метод изоляции сердца 50
2.4. Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу 51
2.4.1. Протоколы проведения перфузии сердца 55
2.5. Приготовление проб к анализу. Гомогенизация 57
2.5.1. Подготовка проб для измерения гидролитической ктивности Л'а+/АГ,"АТФазы 58
2.5.2. Подготовка проб для проведения измерения АТФ и GSH/GSSH 58
2.5.3. Подготовка проб для измерения пероксидаз 59
2.6. Измерение гидролитической активности Лйг+Ж"ьАТФазы 59
2.7. Измерение АТФ в гомогенате перфузированного сердца 66
2.8. Измерение GSH/GSSG в гомогенате перфузированного сердца 68
2.9. Измерение пероксидаз в гомогенате перфузированного сердца 72
2.10. Определение белка 75
2.11. Измерение количества воды в пробе сердца 76
2.12. Методы обработки результатов экспериментов 77
Глава III Результаты и обсуждения 78
3.1. Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе 77
3.1.1. Кислород зависимые изменения гидролитической активности Na*/К* АТФ азы 77
3.1.2. Зависимость гидролитической активности фазы от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут
перфузии 82
3.2. Изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца при перфузии сердца в разных условиях 84
3.2.1. Кинетические изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца 84
3.2.2. Зависимость концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15
минут перфузии 91
3.3. Изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца 94
3.3.1. Кинетические изменения окисленной и восстановленной
форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца 94
3.3.2. Зависимость уровня окисленной и восстановленной форм
глутатиона в гомогенате желудочков сердца от напряжения
кислорода в перфузионном растворе за 15 минут 102
3.4. Кислород зависимые изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца желудочков сердца 106
3.4.1. Кинетические изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца 106
3.4.2. Зависимость уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15
минут 109
3.5. Кинетические изменения количества воды в ткани желудочков сердца 111
3.6. Заключение 116
3.7. Выводы 119
Список цитируемой литературы 122
Благодарности 140
- Семейство FXYD белков (у-субъединица)
- Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу
- Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе
- Кислород зависимые изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца желудочков сердца
Введение к работе
Мз"7ЛҐАТФаза - встроенный в плазматическую мембрану фермент, который за счет энергии гидролиза АТФ связывает ионы Na* и К*> перенося их через мембрану против градиента концентрации со следующим соотношением:
АТФ + 3 Л^л+2/Г0Ш=АДФ +Pi + 3Na\ut + 2К* in. где Na+in входящий ион натрия, Net оШ - выходящий ион натрия, К*ом - выходящий ион калия, К* in - входящий ион калия, Pt -неорганический фосфат.
Таким образом, Лга+/АГ+АТФаза, которая присутствует во всех клетках животных, образует электрогенный обменник внутриклеточного Na* на внеклеточный К*. Мг+/АҐ"АТФаза состоит из 3 субъединиц - а, р и у.
В исследованиях предыдущих лет уделяли большое внимание строению и функциям фермента, теперь все больше вопросам регуляции и активности JVa+/K*АТФазы в различных условиях.
В сердце Na /вҐАТФаза непосредственно участвует в стабилизации трансмембранного градиента. Энергия, необходимая для совместного транспорта трех молекул Na+ из внешней среды во внутреннюю и двух молекул К? из внутренней во внешнюю среду, обеспечивается гидролизом одной молекулы АТФ. Соотношение 3 Na*: 2 ЛҐ, необходимое для работы фермента, было показано в ткани сердца на различных видах животных [133, 134]. Электрохимический градиент, создаваемый ионами, может быть заново использован для трансформирования энергии, а также для транспорта в клетку таких субстратов как аминокислоты, сахара, витамины, фосфат, Са2+9 Н* и другие с использованием систем вторичного транспорта.
Содержание кислорода в крови человека (у крысы оно практически такое же, поскольку содержание гемоглобина близкое) составляет при рОг 20 кРа или 120 мм рт ст (20% Ог), то есть 20 объемных процентов (20,2 мл 02 на 100 мл крови), а в водном растворе при 37,7С эта величина примерно в 100 раз меньше (0,3 объемных процента). Это значит, что хотя в плазме растворимость 02 такая же, как в любом растворе, количество кислорода, которое получает ткань при перфузии кровью, во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% ( [ГУ]. Поэтому результаты, полученные в рамках данной работы, могут быть взяты за базовые исследования с целью дальнейших разработок в данном направлении, но уже применительно к человеку.
Транспортная и гидролитическая активность Л^/ЛГ^АТФазы в нейронах, эритроцитах, гепатоцитах зависит от уровня кислорода в ткани [16]. Ишемия сердца также сопровождается понижением гидролитической активности Л/л+/йГ*АТФазы в ткани сердца [54]. Тридцатиминутная ишемия снижает уровень миокардиальной АТФ на 50% [153]. Ишемия сопровождается изменением количества синтезируемого АТФ в клетках [54]. При этом по данным исследований, проведенным на сердце для поддержания должного количества АТФ и обеспечения необходимой работы синтез АТФ перестраивается. Многие проводимые исследования посвящены работе и регуляции ІУа+/АҐ"АТФазьі в условиях ишемии [54, 19, 15] при этом работа и регуляция фермента в условиях гипоксии до сих пор остается не достаточно выясненной. В связи с этим остается непонятным значение недостатка кислорода в механизме изменения гидролитической активности JVaVAT1"АТФазы.
Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния величины напряжения кислорода в перфузионном растворе с учетом временного фактора на работу Лй+(Ж+АТФазы и выяснения механизма влияния кислорода.
Задачи работы:
Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на гидролитическую активность Na/К^АТФъы
Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень АТФ в ткани и зависимость гидролитической активности Na+/K*АТФазы от изменения уровня АТФ
Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень окисленной и восстановленной форм глутатиона в ткани
Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на активность пероксидаз в ткани
Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на количество воды в ткани как показатель набухания и повреждения ткани
Работа построена по стандартному принципу, принятому для кандидатских диссертаций. Изложена на 139 страницах, и включает следующие разделы: обзор литературы, материалы и методы,
результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы из 173 источников, В работу включены 24 рисунка и 14 таблиц.
В обзоре литературы обсуждаются данные о строении и работе фермента Nit/ІГАТФазы, изменении работы в условиях ишемии и гипоксии различных тканей, сосредоточено внимание на нерешенных вопросах в этой области.
В разделе материалы и методы подробно описаны условия изоляции сердца, метод проведения перфузии изолированного сердца по Лангендорффу, гомогенизация ткани желудочков сердца и проведение измерения гидролитической активности, уровня АТФ, окисленной и восстановленной форм глутатиона (GSH, GSSG), пероксидазной активности, количества воды в пробах сердца.
В разделе результаты и обсуждения представлены данные собственных исследований, полученные в этой работе: изменение гидролитической активности Na/tt АТФазы, уровня АТФ, окисленной и восстановленной форм глутатиона (GSH, GSSG), пероксидазной активности, количества воды в пробах сердца при его перфузии растворами с разным напряжением кислорода и разной продолжительностью перфузии.
Впервые показано, что гидролитическая активность Na/lC АТФазы претерпевает флуктуационные изменения в зависимости от напряжения кислорода в ряду 9,742 - 138,11 мм. рт. ст., однако через 15 минут пик гидролитической активности приходится на уровень 69,05 мм. рт. ст., а при 45 минутах перфузии он смещается на уровень 25 мм. рт. ст. Далее показано, что уровень АТФ претерпевает флуктуационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода в ряду 9,742 - 138,11 мм. рт. ст., при этом для 10 и 45 минутной перфузии кривые аппроксимации
имеют одинаковую закономерность изменения, но для 15 минутной перфузии растворами с Ро2 от 6,333 до 138,11 мм. рт. ст. не обнаружено достоверные различия в уровне АТФ.
Впервые показано, что уровень GSH, претерпевает флуктуационные изменения во время перфузии в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода в ряду 9,742 - 138,11 мм. рт. ст. Через 15 минут перфузии пик GSH находился на уровне 25,742 мм. рт. ст., а при 45 минутах перфузии он смещался в сторону более высокого давления и увеличивается достоверно, начиная с 69,05 мм. рт. ст. При этом значения процентного отношения GSSG от GSH претерпевают во времени флуктуационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода, однако для напряжения кислорода 25,742 мм. рт. ст. наблюдается увеличение соотношения GSSGIGSH на 10-й и далее на 15 минуте перфузии. Через 45 минут перфузии соотношение GSSGIGSH возвращается практически к первоначальному уровню. Максимальное значение процентного отношения GSSG от GSH при 15 минутной перфузии приходится на 34,374 мм. рт. ст.
Другой показатель изменения свободных радикалов в клетке -уровень активности пероксидаз, претерпевает вне зависимости от напряжения кислорода 25,742, 34,374 и 138,11 мм. рт. ст. изменения в течение 45 минут, пик активности наблюдается через 15 минут для всех значений напряжения кислорода, а при длительности перфузии 5, 10 и 45 минут значения активности пероксидаз практически не изменяется.
Далее было показано, что содержание воды во времени претерпевает флуктационные изменения в течение 45 минут в зависимости от напряжения кислорода в ряду 9,742 - 138,11 мм. рт. ст., наибольшее содержание воды в ткани наблюдается через 10
минут перфузии для 25,742 мм. рт. ст. При 45 минутной перфузии достоверных различий в содержании воды в сердце не обнаружено.
В разделе результаты и обсуждения так же дано обсуждение полученных результатов.
Впервые были проведены исследования работы Naf/K* АТФазы в условиях гипоксии на целом сердце. Рассмотрение изменений, которые происходят в целом органе, позволяют оценить комплексные изменения, вклад в которые вносят все ткани и структуры органа.
Полученные результаты позволяют оценить вклад гипоксии в ишемический процесс и более глубоко понять механизмы изменений работы Na /К4"АТФазы.
В работе использовали 209 животных, из них 179 крыс линии Wistar и 30 крыс линии Lewis. Из этих 209 животных выделено 209 препаратов сердца, которые были перфузированны с использованием метода перфузии изолированного сердца по Лангендорффу. Дальнейшие исследования проводились на гомогенатах желудочков сердца. Из них полностью соответствовали протоколу перфузии 200 сердец. Из одного перфузированного сердца получали 4 пробы для разных исследований, которые гомогенизировали согласно описанным протоколам. Измерение гидролитической активности NcC/lf АТФазы, уровня АТФ, соотношения GSH/GSSH, активности пероксидазы и содержанию воды подверглись 150 проб. Статистической обработке подверглись только те эксперименты, которые полностью соответствовали протоколу исследований.
Семейство FXYD белков (у-субъединица)
Анкирины (ankyrina) составляют семейство белков, которые расположены между встроенными в мембрану белками и белками цитоскелета. Различные изоформы анкиринов представлены в различных типах ткани. Наиболее изучены анкирины эритроцитов, молекулярная масса которых приблизительно равна 200-210 кДа [99]. Анкирины взаимодействуют с а-субъединицей Na /K АТФазы. Два места связывания с анкиринами представлены на а-субъединице [37]. Последовательность Lys(154) - lie - Met - Gly(157) является одним из мест связывания, второе место связывания находится между М4-М5: А1а(455) - Leu - Leu - Lys(458) [37]. Взаимодействие может осуществляться за счет ионных и/или гидрофобных сил. Воздействие в условиях гипоксии на активность Na /л АТФазы в сердце не показано, но мы не можем исключить воздействие анкиринов на ШУіҐАТФязу из механизма регуляции этого фермента в условиях гипоксии. Na /К АТФаза относиться к АТФазам Р-типа, которые в процессе каталитического цикла претерпевают фосфорилирование-дефосфорилирование по активному центру. Каждый каталитический центр обеспечивает гидролиз одной молекулы АТФ сопряжен с выходом из клетки 3-х ионов Na+ и входом в клетку 2-х ионов К 9 причем перенос обоих ионов идет против электрохимического градиента. Таким образом, возникает негативный внутриклеточный потенциал мембраны клетки.
Механизм переноса ионов через плазматическую мембрану включает в себя последовательные этапы работы, представленные на рисунке 1.4. Конформация Е1 Nct/K АТФааы характерна для состония, когда Мэг может связываться с внутриклеточной стороны мембраны. В таком положении сторона белка, обращенная в цитозоль, имеет три высокоаффинных места связывания ионов Na+. При этом другой определенный участок а-субъединицы, обращенный в сторону цитозоля, уже связан с М +-АТФ с образованием комплекса [ЕІАТФЗЛ а ]. Специфические катионсвязывающие центры имеют высокую аффинность к ионам Na и к АТФ (приблизительно 0,2-10 М). Константа связывания К& для Na+ с этими центрами связывания равна 0,6 10"6 М, и эта величина значительно меньше, чем внутриклеточная концентрация Na+ (5-12 мМ). Это подчеркивает, что в норме ионы Na+ должны заполнять центры связывания. Одновременное присутствие на своих местах связывания ионов Na+ и Л/#2+-АТФ запускает следующий этап концевой фосфатной группы АТФ к карбоксильной группе остатка аспарагиновой кислоты а-субъединицы (фосфорилирование белка по карбоксильной группе аспарагиновой кислоты), формируя высокоэнергетическую ацилфосфатную связь, в результате чего происходит образование фосфорилированной а-субъединицы (или ферментофосфатного комплекса Е1Р). После отсоединения АДФ, ионы Na+, связанные с ферментом, не могут освободиться от формы [BlP(3Na+)]. Стехиометрическое «запечатывание», то есть окклюзия транспортируемых ионов внутри мембраны - ключевой момент активного катионного транспорта. В таком виде в белке происходит конформационный переход, определяющий перенос ионов на противоположную сторону мембраны, причем ионы Na+ на внеклеточной стороне имеют низкоаффинную связь с центрами связывания. На внеклеточной поверхности ионы Na покидают белок (первый более быстро, а второй и третий медленнее), и ферментативный комплекс теряет чувствительность к изменению концентрации АДФ. нечувствителен к водному гидролизу. Одновременно центры связывания для ионов с наружной стороны мембраны приобретают высокую чувствительность к ионам ЛГ\ Данная форма [Е2Р] на внешней поверхности присоединяет 2 1С с образованием комплекса [Е2Р2АҐ"], что приводит к гидролизу ацил-фосфатной связи и освобождению неорганического фосфата (Р;) с внутренней стороны мембраны. Константа связывания Кт для К примерно равна 0,2 мМ. Это значительно меньшая величина, чем внеклеточная концентрация ионов К (4-10 мМ). После этого ионы К становятся «запечатанными» в форме Е2(2АГ )]. Открывается доступ к связанным ионам на цитозольной стороне мембраны, поскольку ионы К связаны с низкоаффинными центрами. Они освобождаются во внутриклеточное пространство. Хотя процесс активируется необходимо присутствием АТФ, которая связывается с участком низкого сродства (приблизительно 150-10 6М) и образует комплекс [Е2АТФ(2 К )]. АТФ при этом не гидролизируется.
Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу
Для выполнения поставленных задач использовали экспериментальную установку, обеспечивающую перфузию изолированного сердца раствором с заданным парциальным давлением кислорода [141].
Для изучения влияния различных концентраций кислорода на работу №з+/АҐ"АТФазьі выбрали метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу, так как он имеет следующие преимущества для изучения поставленной задачи: Проведение исследования на целом органе, так как сохраняются неповрежденными все структуры сердца Нивелирование влияния экстракардиальной нервной и эндокринной системы на сердце Четкая дозировка и возможность контролировать парциальное давление кислорода в перфузионном растворе Сравнение полученных данных с аналогичными данными по ишемии.
Данная установка включает в себя: водяную баню с помещенным в нее мотором (THERMOMD H B.BRAUN, BENDER+HOBEIN), обеспечивающим циркуляцию воды, циркуляционный насос (DYNAMAX perestaUic pump model RP-1, RAININ), установка no созданию заданного парциального давления в перфузионном растворе, газовые баллоны с различным содержанием кислорода, стеклянную воронку, штатив, тайгоновые шланги, набор колб для растворов. Блок схема установки представлена на рисунке 2.1.
Канюлю вводили в аорту изолированного сердца, к которой по тайгоновым (газонепроницаемым) шлангам подводили раствор 1 с заданным парциальным давлением кислорода, прошедший через систему терморегуляции, и начинали перфузию согласно протоколу.
Для крепления изолированного сердца на канюле использовали специальный зажим. Канюлю вводили в аорту изолированного сердца так, чтобы раствор 1 попадал в камеры сердца и свободно проходил по коронарным сосудам. Это очень важно, поскольку плохая перфузия или попадание пузырьков газа в систему коронарных сосудов, а, следовательно, и их воздушная эмболия может привести к некорректным результатам.
Температуру водяной бани подбирали с таким расчетом, чтобы при постоянной скорости вращения 9,7 (2,18 мл/мин) температура перфузионного раствора при выходе из стеклянной воронки была 37±0,1 С. Заполняли перфузионную систему используемым раствором так, чтобы в системе не было пузырьков газа.
Используя газовые смеси, содержащие С(?2, Оъ 2 и установку по созданию заданного парциального давления в растворе 1, проводили аэрацию перфузионной жидкости и поддерживали определенное парциальное давление в растворе (таблица 2.1).
Измерение напряжения кислорода (Р02) проводили с использованием четырехканального прибора Oxylite 4000, Oxford Optronix Limited, United Kingdom. В основе метода лежит излучение и поглощение отраженного люминесцентного света, производимого оптодом, который непосредственно вводили в раствор [160]. Для смеси газов с содержанием кислорода 20 и 10 % невозможно было произвести измерения, поэтому в работе использовались расчетные величины. Расчет можно произвести по следующему алгоритму:
Насыщение раствора газовыми смесями проводилось при атмосферном давлении, равное таковому на высоте 480 м над уровнем моря. Среднее атмосферное давление на уровне моря составляет 760 мм. рт. ст., при этом подъем на каждые 10,5 м дает падение давления 1 мм. рт. ст. Соответственно, атмосферное давление, при котором происходило исследование, составляло 760 - (480/10,5), что примерно равно 714,29 мм. рт. ст. В опытах применяли сухие газовые смеси с фракционным содержанием кислорода. При прохождении через слой воды в емкости - газообменнике сухая газовая смесь насыщается парами воды. Парциальное давление водяного пара при температуре растворения 25 С составляет 23,75 мм. рт. ст. [153]. Соответственно парциальное давление кислорода в газовой смеси (напряжение кислорода в растворе) при насыщении ее парами воды в условиях используемой емкости дегазатора рассчитывается согласно закону Дальтона как: где рОг - парциальное давление кислорода, F - фракционная доля, Рим - атмосферное давление, рН20 - давление насыщенного водяного пара при температуре 25С. Соответственно для газовой смеси 5% (F = 0,05):
Эта расчетная величина хорошо коррелирует с полученными результатами прямого измерения напряжения кислорода в растворе. Для газовой смеси 10% (F = 0,1) р02 = 0,1 (714,29 - 23,75) = 69,05 мм. рт. ст. Для газовой смеси 20% (F = 0,2) р02 = 0,2 (714,29 - 23,75) = 138,11 мм. рт. ст. Точка с минимальным напряжением кислорода 6,333 мм. рт. ст. выбрана не случайно, поскольку в ткани бьющегося сердца показано 6 мм. рт. ст. [192].
Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе
После перфузии сердце взвешивали и делили на пробы, которые замораживали в отдельных специальных пробирках (Nunc CryoTube Vials, NUNC Brand Products, Denmark) в жидком азоте для проведения измерения гидролитической активности, концентрации АТФ, соотношения GSH/GSSG, активности пероксидаз. Все время до момента использования пробы хранили в жидком азоте. Для проведения измерения необходимых параметров пробы готовили по специальным протоколам. Гомогенизацию проводили в стеклянном гомогенизаторе, который состоит из стакана вытянутой формы и пестика - стеклянного или тефлонового поршня, диаметр которого чуть меньше (примерно на 0,2 мм) внутреннего диаметра стакана, что позволяет пестику легко перемещаться внутри стакана. При поступательно-вращательном движении пестика вверх и вниз (-20 раз) со скоростью вращения 1500 об/мин происходит измельчение ткани (Potters B.Brauri).
Сердца, пробы которых были предназначены для измерения воды, до разделения на кусочки дополнительно вручную промывали 10 мл раствора 2. Для проведения измерения количества воды в пробах пробы не замораживали и готовили по специальным протоколам, приведенным ниже.
Пробы доставали из жидкого азота и взвешивали. Образцы ткани помещали в гомогенизаторы, находящиеся на льду, и к ним добавляли раствор 3 с температурой 4 С, находящийся на льду. Сначала проводили грубую гомогенизацию на Kinematica, PolytronPT3000 при скорости вращения 16000 об/мин в течении 30 сек. После чего пробы подвергались в течение 10 сек действию ультразвука (BRANSONKf ultrasonic cleaner, model B-1200 El) и замораживались в пластиковых пробирках (эппендорфах). Далее проводили 3 цикла «замораживания-оттаивания» (замораживали в жидком азоте, оттаивали на льду). Затем проводили дальнейшее измельчение (как описано выше). Полученный гомогенат откручивали 30 мин при 12000 об/мин в центрифуге Sorvall, используя ротор ЛГ-34 (t=4C). Для измерения активности ІУа+/АҐАТФазьі использовали надосадочную жидкость (супернатант).
Пробы доставали из жидкого азота и кусочки взвешивали. Образцы ткани помещали в гомогенизаторы, находящиеся на льду, и к ним добавляли раствор 3 температурой 4С, находящийся на льду (на 0,2 г ткани 1,5 мл раствора 3), Гомогенизировали как описано выше. После чего добавляли эквивалентное количество раствора 4 и еще раз гомогенизировали, затем 10 секунд пробы подвергали действию ультразвука (BRANSON 1200, BENDER+HOBEN). После этого пробы разливали в эппендорфы и замораживали в жидком азоте. Непосредственно перед измерением, пробы размораживали на льду и и в центрифугировали (Eppendorf Centrifuge 5415R) 30 мин со скоростью 16000 об/мин при температуре 4С. Для измерения уровня АТФ и GSH/GSSH использовали надосадочную жидкость.
Подготовка проб для измерения активности пероксидаз
Для измерения уровня пероксидаз в ткани сердца, пробы гомогенизировали на льду в стеклянных гомогенаторах, используя POLYMIX PX-SR 90D, 16000 g, в растворе 5 (100 мг ткани на 1 мл раствора). После чего 10 секунд подвергали действию ультразвука (BRANSON 1200, BENDER+HOBEN) и замораживали в жидком азоте. Оттаявшие на льду пробы центрифугировали (Eppendorf Centrifuge 5415R) 30 минут в режиме 16000 g при температуре 4 С непосредственно перед измерением [131, 150]. Для измерения активности пероксидаз использовали данные измерения гидролитической активности.
К специфическим супернатант. 2.6. Измерение гидролитической акти внос і и Na /fC АТФазы Л/а+/8ҐАТФаза обладает двумя активностями: гидролитической, то есть способностью гидролизовать молекулу АТФ до АДФ и неорганического фосфата транспортной, то есть способностью переносить через мембрану ионыNa" и К В работе представлены данные измерения гидролитической активности.
К специфическим ингибиторам Ла+/8ҐАТФазы относятся сердечные гликозиды, типичным представителем которых является уабаии. Он обладает абсолютной специфичностью к ферменту, взаимодействуя с центром, расположенным с внеклеточной стороны мембраны. Уабаин необратимо связывается с фосфорилированной формой фермента (как с Е1-Р, так и с Е2-Р).
Гидролитическую активность Na /lC АТФазы измеряли по образованию из АТФ неорганического фосфата рассчитывали как разницу между количеством неорганического фосфата, образованного под действием фермента в присутствии уабаина и без него. Пробы готовили по специальному протоколу, описанному выше. Гидролитическую активность Na /lC АТФазы измеряли по образованию из АТФ неорганического фосфата (реакция 1) с помощью метода Ратбун и Бетлах [117].
Кислород зависимые изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца желудочков сердца
На рисунке 3.12. представлен график кинетической зависимости уровня пероксидаз при использовании разных Рог в перфузионном растворе. Нулевую точку не определяли. При перфузии сердца 5 мин раствором с Р02 25,742 мм. рт. ст. (кривая 1) уровень пероксидаз в гомогенате ткани желудочков сердца равен 5,9117-10 5±8,7629-10 (по сравнению с точкой 45 мин Рог 25,742 мм. рт. ст. Р 0,05, по сравнению с контрольной точкой 5 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,01), при увеличении времени перфузии с 5 до 10 мин Рог 25,742 мм. рт. ст. нет достоверного изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца и он равен 7,7518-10"5±1,7459 10"5 (по сравнению с точкой 45 мин Р02 25,742 мм. рт. ст. нет достоверных отличий, по сравнению с контрольной точкой 10 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,05). Точка 15 мин Р02 25,742 мм. рт. ст. 2,0427-104±3,2767-10"5 (по сравнению с точкой 45 мин Рог 25,742 мм. рт. ст. Р 0,05, по сравнению с контрольной точкой 15 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,005). Точка 45 мин Р02 25,742 мм. рт. ст. 1,0000-10 11,5373-10-5.
При перфузии сердца 5 мин раствором с Рог 34,374 мм. рт. ст. (криваяя 2) уровень пероксидаз в гомогенате ткани желудочков сердца равен 1,2282-10"4±2,0794-10"5 (по сравнению с 45 минутной перфузией Рог 34,374 мм. рт. ст. нет достоверных отличий, по сравнению с контрольной точкой 5 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,001), при увеличении времени перфузии с 5 до 10 мин Рог 34,374 мм. рт. ст. нет достоверного изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца и он равен 8,8596-10 5±2,8019-1 О 5 (по сравнению с 45 минутной перфузией Рог 34,374 мм. рт. ст. нет достоверных отличий, по сравнению с контрольной точкой 10 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,05). Точка 15 мин Р02 34,374 мм. рт. ст. 2,6209-10 14,3319-10 5 (по сравнению с 45 минутной перфузией Р02 34,374 мм. рт. ст. Р 0,01, по сравнению с 15 минутной перфузией 138,11 мм. рт. ст. нет достоверных отличий). 45 минутная перфузия Рог 34,374 мм. рт. ст. 9,7498-10 5±2,3449-10 5.
При перфузии сердца 5 мин раствором с Рог 138,11 мм. рт. ст. {кривая 3) уровень пероксидаз в гомогенате ткани желудочков сердца равен 2,9931-10 5±2,2119-10"6 (по сравнению с 45 минутной перфузией Рог 138,11 мм. рт. ст. нет достоверных отличий), при увеличении времени перфузии с 5 до 10 мин Рог 138,11 мм. рт. ст. нет достоверного изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца и он равен 2,3823-10"5±5,9280-10"7 (по сравнению с контрольной точкой 10 мин 138,11 мм. рт. ст. Р 0,05). 15 минутная перфузия Р02 138,11 мм. рт. ст. 1,996610 7,6902105 (по сравнению с контрольной точкой 15 мин 138,11 мм. рт. ст. нет достоверных отличий). Точка 45 мин Рог 138,11 мм. рт. ст. 3,6462-10 5±5,1494-10 6.
Показаны изменения во времени уровня активности пероксидаз, которые претерпевали сходные изменения в течение 45 минут вне зависимости от напряжения кислорода 25,742, 34,374 и 138,11 мм. рт. ст., пик активности наблюдался через 15 минут для всех значений напряжения кислорода, а в точках 5, 10 и 45 минут перфузии значения активности пероксидаз показано практически на одном уровне.
Смещение пика гидролитической активности, которые приходились при 15 минутной перфузии на 69,05 мм. рт. ст., при 45 минутной перфузии на 25 мм. рт. ст., могли происходить за счет изменения сродства фермента к субстрату в условиях гипоксии. А так же за счет воздействия каскадных реакций активных форм кислорода и азота.
При 15 минутной перфузии растворами в напряжением кислорода 25,742, 34,374 и 138,11 мм. рт. ст. наблюдается пик количества пероксидаз в ткани. Нет прямой зависимости с гидролитической активностью и уровнем АТФ. Концентрация восстановленных форм глутатиона при напряжении кислорода 34,374 и 138,11 при 15 минутной перфузии снижается, при этом при 25,742 мм. рт. ст. такой зависимости не наблюдается.
