Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкий биологический и клинический интерес к изучению мезенхимных стромальных клеток (МСК) связан с уникальностью их свойств, таких как высокий пролиферативный потенциал, способность к самоподдержанию и дифференцировке во многие типы клеток соединительной и других тканей. Согласно современным представлениям, популяция МСК in vitro является гетерогенной и представлена стволовыми и родоначальными клетками различной степени зрелости. При этом содержание МСК в органах крайне мало (Digirolamo et al., 1999; Pittenger et al., 1999; Wexler et al., 2003), и для выделения, а также наращивания их численности используют различные методические приёмы. Однако ни один из известных способов не позволяет получить значительного числа равноценных по потенциям клоногенных МСК. Для выделения МСК как пост- так пренатального происхождения используют свойство этих клеток прикрепляться к пластику и формировать колонии. В большинстве исследований указывается на разное время прикрепления подавляющей части МСК, в пределах от 2- до 72-х часов (Фриденштейн и др., 1973; Castro-Malaspina et al., 1980; Derugina et al., 1995; Phinney et al., 1999; Yamada et al., 2000; Peister et al., 2004). Однако отсутствуют исследования, которые убедительно и в полной мере определили условия, необходимые для выделения и прикрепления всей популяции МСК. Не исключено, что в составе популяции МСК могут существовать клетки, которые проявляют свои адгезивные и клоногенные свойства после длительного пребывания во взвеси. Для исследования свойств клеток, отличающихся по адгезии к субстрату, возможно применение различных подходов. Одним из них является изучение чувствительности МСК к факторам роста, таким как эпидермальный фактор роста, EGF, основный фактор роста фибробластов, bFGF, и фактор роста, выделенный из тромбоцитов, PDGF, которые оказывают многостороннее влияние на процессы роста и дифференцировки клеток. Однако данные литературы по влиянию факторов роста на МСК в целом не однозначны и чувствительность к ним МСК разного органного происхождения практически не исследована.
Основными органами миелоидного кроветворения в пре- и постнатальный периоды онтогенеза являются эмбриональная печень и зрелый костный мозг соответственно. Всесторонний сравнительный анализ МСК из этих органов кроветворения, функционирующих в разные периоды онтогенеза и выполняющих сходную функцию в организации кроветворного микроокружения, позволит глубже исследовать биологию МСК, изменения их свойств в пре- и постнатальном онтогенезе, а также оценить степень их функциональной близости.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro, из органов миелоидного кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени.
Были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить субпопуляции МСК, различающиеся по адгезии in vitro, из зрелого
костного мозга и эмбриональной печени:
- по клоногенному потенциалу;
- по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD73, CD29,
CD144 и рецепторов адгезии avP3, avP5, a5pi;
по содержанию ранних остеогенных клеток-предшественников;
по способности к индуцированной дифференцировке в остео- и адипогенном направлениях.
2. Оценить содержание менее зрелых 5-фторурацил-резистентных
предшественников в стандартных культурах МСК из двух органов.
3. Сравнить влияние факторов роста EGF, bFGF, PDGF на субпопуляции МСК,
различающихся по адгезии in vitro, из зрелого костного мозга и эмбриональной
печени:
на рост и колониеобразующую способность;
на содержание ранних остеогенных клеток-предшественников;
на остеогенную дифференцировку;
на адипогенную дифференцировку.
Научная новизна. Впервые показано, что МСК в составе органов миелоидного кроветворения крысы, зрелого костного мозга и эмбриональной печени, отличаются по своим адгезивным свойствам, которые они реализуют постепенно в течение многократных переносов в новые культуральные флаконы на протяжении 4-6 недель. Впервые проведен анализ свойств субпопуляций МСК, различающихся по адгезии in vitro. Субпопуляции МСК в пределах исследуемых органов не отличаются по способности к клональному росту, потенциям к остео- и адипогенной дифференцировке, по поверхностному иммунофенотипу. В то же время субпопуляции МСК из двух органов различны по остеогенным потенциям. Проведен анализ влияния факторов роста на МСК в ходе индивидуального развития. МСК субопуляций в составе каждого органа обладают сходной чувствительностью к факторам роста EGF, bFGF и PDGF. Кроме того, показано, что в стандартной костномозговой культуре МСК in vitro доля резистентных к цитостатику 5-фторурацилу клеток сходна с таковой МСК печеночного происхождения.
Теоретическое и практическое значение. Результаты работы представляют существенный интерес для клеточной биологии и регенеративной медицины. Выявленные в процессе пролонгированного культивирования адгезивные субпопуляции МСК позволяют говорить о длительном сохранении в суспензии МСК, постепенно реализующих свой клоногенный потенциал. Суммарное количество клоногенных МСК субпопуляций в 6 - 8 раз превышает их число в стандартной популяции и представляет собой значительный резерв близких по свойствам МСК, никогда ранее не используемый в научных и практических целях. Пролонгированное культивирование субпопуляций МСК может представлять собой подход для изучения гистогенетического ряда стволовых клеток мезенхимного происхождения, многие этапы которого до сих остаются неизвестными. МСК, сохраняющие свои свойства в ходе длительного культивирования, были обнаружены в органах кроветворения крысы как пре-, так и постнатального происхождения, что даёт основания говорить о возможной универсальности такого поведения клеток в культуре.
Полученные данные расширяют представления о системе МСК в процессе индивидуального развития. Изучение влияния факторов роста на субпопуляции МСК, отличающихся по адгезии in vitro, имеет важное значение для понимания регуляции процессов пролиферации и дифференцировки стромальных родоначальных клеток.
Работа имеет важное практическое значение, так как в ней представлен простой и воспроизводимый метод получения значительной массы полноценных МСК, что в перспективе представляет интерес для практической медицины. Использованная схема культивирования МСК происходит без повреждающих воздействий на клетку, что существенно для применения МСК в медицинских целях. Предварительные опыты подтвердили присутствие субпопуляций МСК в культуре из зрелого костного мозга человека, что усиливает прикладной аспект подобных исследований.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007, 2008), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах, соответствующих Перечню ВАК - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 7.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах, содержит 2 таблицы, 40 рисунков, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственного исследования, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 368 цитируемых источников.
