Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Основные принципы и механизмы алкилирования 13
1.2. Первичные молекулярные продукты алкилирования важнейших макромолекул клетки 16
1.3. Генотоксические и мутагенные свойства алкилирувдих агентов 19
1.4. Модификация повреждений, вызванных алкилиругащими агентами . 21
1.5. Воздействие алкиляторов на ядерный хроматин 25
1.6. Характеристика типичного алкилирующего агента, отечественного противоракового препарата дипина 32
2. Материалы иметоды исследования 42
3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Разработка метода оценки функционального состояния единичной клетки и клеточной популяции.
Модель реорганизации хроматина клеточного ядра под действием генного индуктора фенобарбитала... 45
3.2. Исследование ранних этапов последействия дипина в условиях генной индукции 58
3.3. Популяционно-клеточный анализ гепатоцитов крысы при действии дипина и последующей генной индукции 64
3.3.1. Анализ гепатоцитов интактнюс и индащрованних фенобарбиталом животных. 64
3.3.2. Анализ процесса активации ядер гепатоцитов крысы в условиях последействия дипина в дозе 15 мг/кг . 73
3.3.3. Анализ активации ядер гепатоцитов крысы в условиях последействия дипина в дозе 30 мг/кг 76
3.3.4. Анализ характера активации ядер гепатоцитов крысы после воздействия дипина на функционально стимулированную печень 78
3.3.5. Длительность существования поврегдений в клетках печени крыс, приводящих к нарушению активации ядер гепатоцитов 82
3.3.6. Поиуляционно-клеточный анализ активации ядер гепатоцитов крысы после многократного воздействия дипина 83
4. Обсуждение результатов исследования. 87
Вывода
Указатель литературы 101
- Модификация повреждений, вызванных алкилиругащими агентами
- Характеристика типичного алкилирующего агента, отечественного противоракового препарата дипина
- Анализ процесса активации ядер гепатоцитов крысы в условиях последействия дипина в дозе 15 мг/кг
- Анализ характера активации ядер гепатоцитов крысы после воздействия дипина на функционально стимулированную печень
Введение к работе
Одним из актуальных аспектов изучения клеточной адаптации следует считать анализ характера ранних изменений функциональной активности клеток в условиях воздействия генотоксических веществ, поскольку реализация адаптивных возможностей клетки происходит с участием её генетического аппарата.
Широкая химизация практически всех сфер деятельности человека привела к быстрому накоплению в различных экологических системах генотоксических веществ, интенсивно загрязняющих биосферу. К 1975 году было зарегистрировано более двух миллионов различных химических веществ, синтезированных человеком; их количество ежегодно увеличивается на 200-300 тысяч (из них приблизительно 500 внедря-ется в практику в виде лекарственных препаратов, пищевых добавок, промышленных соединений и т.п.) /Н.П. Бочков с соавт., 1975/. Естественно, это приводит к все большему увеличению контактов человека, животных и растений с биологически активными химическими агентами, влияющими на их генофонды, морфо-функциональные характеристики и эволюцию различных биоценозов. По данным Всемирной организации здравоохранения, 40 тысяч химических веществ, которые использует человечество, обладают вредными для человека свойствами /Н.П. Дубинин, 1975/.
В нашей стране с 1975 года при Государственном комитете по науке и технике при Совете Министров СССР работает секция "Генетические аспекты проблемы человек и биосфера". На секцию, координирующую работу около 50 научных учреждений АН СССР, АМН СССР, ВАСХНШ, МЗ СССР и др. ведомств, возложен ряд задач, связанных с разработкой чувствительных тест-систем для оценки последствий воздействия различных соединений, мониторингом в популяции человека, разработкой методов защиты окружающей среды, генофондов человека, животных и растений от вредных воздействий /Н.ЇЇ. Дубинин, 1980$ Г.Д. Засухина, 1979; Ноу et at, 1983; Spigebezy еі об , 1983/.
На ежегодной конференции Европейского сообщества по мутагенам внешней среды, прошедшей в Москве (сентябрь 1984), большое внимание было уделено проблемам выхода индуцированных генетических повреждений в зависимости от метаболического состояния живых систем. Ведущими генетиками было подчеркнуто, что конечная генотоксичность зависит не только и не столько от дозы и типа мутагена, сколько от характеристик системы и суммы условий повреждения.
Одно из ведущих мест по распространенности и эффективности применения занимают алкилирущие агенты. Это большая группа различных в химическом отношении соединений, широко используемых в промышленности, сельском хозяйстве I Havelend, Smith.,1981; Sasaki et 0.1, 1980; Thompson et at, 1980/, науке /A.B. Мазин с соавт.,1981; Г.М. Днмптиц с соавт., 1981; И.Г. Васина, 1980; Х.С. йяаилов с со-авт., 1980; Реіеі%а,СкапсІ, 1980/ и медицине /Й.М. Эмануэль, 1980; М.Д. Машковский, 1978; С .А. Гиллер с соавт,, 1977; "лекарственные и диагностические средства, применяемые в онкологической практике", 1982; Rajoioksh/ni et оС 1981; Fatk et Q # 1979/.
Важной особенностью алкилирующих веществ является их высокая реакционная способность в так называемых мягких физиологических условиях, что чрезвычайно повышает вероятность их воздействия на живую природу /У.Росс, 1964/.
Сегодня проблема изучения биологических эффектов алкилирова-ния приобретает важное медико-генетическое значение, поскольку накапливается все больше фактов о мутагенных /Ш.Ауэрбах, 1978/, тератогенных /В.А Александров, 1979/ и канцерогенных /$кеЬу, Matsu-skiMa f 1981/ эффектах алкилирующих агентов в малых дозах и их пагубном влиянии на систему репарации генетических повреждений /Нот ei at f 1980/.
Последствия воздействия алкилирующих агентов становятся труднопредсказуемыми, поскольку в условиях действия других ксенобиотиков, например, агентов, стимулирующих тканевой метаболизм, алкиля-торы могут существенно менять свою биологическую активность и токсичность /І.Г. Дубинина с соавт., 1976; Heihcloiff et at, 1983; Reddifeta, 1980; Henschle ., 1977/.
Большое количество исследований, посвященных биологическим эффектам алкилирующих агентов, не объясняет широкого спектра самых разнообразных клеточных повреждений, инициируемых этими веществами. Это диктует необходимость поиска тех регуляторних "перекрестков" в клетке, изменение которых под влиянием алкиляторов могло бы в определенной мере объяснить все многообразие клеточных и тканевых эффектов. Речь идет о заполнении известного пробела между событиями, связанными с появлением первичных молекулярных продуктов ал-нилирования важных макромолекул в клетке и фенотшическими изменениями систем клеточного жизнеобеспечения. Особый интерес привлекают исследования, позволяющие выяснить влияние алкилирующих агентов на процессы активации генома в клетке, поскольку были получены факты, показывающие, что малые дозы алкилирующего агента способны резко понижать индуцибельность белоксинтезирующего аппарата клетки, и, в частности, системы детоксикации гепатоцитов /В.В. Клименко, I.E. Немировский, 1973; В.В. Клименко с соавт., 1972/.
Пристального внимания заслуживает проблема отдаленных последствий малых доз, а также вопросы, связанные с кумуляцией биологического эффекта, поскольку человеке, и животные, как правило, подвергаются воздействиям на уровне именно малых доз и нередко в форме длительного воздействия.
В случае длительного хранения в клетке изменений» индуцированных малыми дозами алкилирущих агентов, и их влияния на функциональные потенции различных метаболических систем, встает вопрос о непредсказуемой трансформации клеток и целых клеточных сообществ, потере основных адаптивных возможностей при неминуемых повторных контактах клеток с различными ксенобиотиками,
В свете поставленных вопросов актуальной проблемой для изучения следует считать анализ адаптивных свойств системы интерфазного хроматина клеточных ядер, функционирующих в условиях воздействия алкиляторов. Перестройка ядерного хроматина, по нашему мнению, является наиболее вероятным универсальным звеном неспецифической регуляции практически всех метаболических процессов, в основе которых лежат изменения биосинтеза в клетке.
Целью настоящего исследования явилось изучение процесса активации ядер гепатоцитов крысы в условиях последействия малых (тера-певтических) доз типичного представителя алкилирущих агентов (ди-пина).
Задачи исследования
1. Разработать цитологический метод количественной оценки активации ядер гепатоцитов крысы как показатель их функционального состояния.
2. Провести анализ возможных нарушений реорганизации ядерного хроматина гепатоцитов крысы в условиях последействия алкилирущего агента и последующей генной индукции.
3. Исследовать процесс активации ядерного хроматина на различных этапах последействия дипина.
4. Исследовать популяционно - клеточные закономерности реорганизации интерфазного хроматина ядер гепатоцитов крысы при различных условиях активации и подавления их функциональной активности.
5. Изучить популяционно - клеточный характер активации ядер гепатоцитов крысы в зависимости от функционального состояния клеток в момент воздействия алкилятора.
Научная новизна
В настоящем исследовании была впервые предпринята попытка оценить адаптивные возможности гепатоцита в условиях последействия терапевтических доз типичного алкилируодего агента дипина с помощью анализа активации клеточного ядра. Было выяснено, что даже терапевтические дозы препарата резко ограничивают возможности перестройки ядра в ходе интенсивной генной индукции. Методами аналитической микроскопии было показано, что после воздействия однократной нецито-статической дозы алкилирующего агента дипина возникают скрытые изменения в системе интерфазного хроматина, которые в условиях интенсивной функциональной нагрузки на белоксинтезирующий аппарат гепатоцита приводят к нарушению процесса реорганизации клеточного ядра.
Такие изменения длительно сохраняются в клетке. Эти факты указывают на то, что контакт даже однократной малой дозы алкилирующего агента с печеночной клеткой оставляет след, затрудняющий прогнозирование ее поведения в самых разнообразных ситуациях: активация генома, его репрограммирование, тяжелые интоксикации, контакт с вирусами и т.д.
Выявленные изменения потенциальных возможностей ядра гепатоцита связаны с длительно живущими нарушениями консервативных макромолекул, вероятнее всего, с макромолекулярным комплексом хроматина.
Анализ последствий воздействия различных схем, доз и условий введения дипина на процесс структурно-метаболической перестройки ядра гепатоцита показал, что наибольший повреждающий эффект малой дозы наблюдается в случае его воздействия на предварительно активированные клетки.
Эти результаты указывают, что конечный биологический эффект алкилирования формируется в зависимости от исходного состояния клеток и тех конкретных функциональных нагрузок, которые неизбежны в процессе жизнедеятельности организма.
Широкий спектр воздействий, так или иначе повышавших нагрузку на генетический аппарат гепатоцита, позволил вскрыть некоторые общие принципы клеточно-популяционной регуляции функциональной активности печени.
Выявленный в настоящей работе алгоритм структурно-метаболических перестроек в популяции ядер гепатоцигов позволяет обнаружить потенциальные функциональные нарушения, предсказать возможную декомпенсацию клеток на ранних этапам предшествующих грубым морфологическим поломкам.
Вышеизложенные новые данные составляют основу для выводов настоящего исследования и в качестве основных положений выносятся на защиту.
Практическая ценность и -реализация результатов работы
Разработан метод количественной оценки уровня активации ядерного хроматина гепатоцигов in. situ , который можно использовать для анализа эффектов различных индукторов и репрессоров генов, тяжести патологических состояний печени в клинике и эксперименте, оценки эффективности специфической терапии.
Количественный анализ функциональной активности популяции ядер гепатоцигов может быть использован для скрининга генных индукторов среди новых лекарственных препаратов и других биологически активных веществ. Новый метод .. .защищен авторским свидетельством Jfc 733660 от 2Г/І-І980 г.
В работе предложена относительно простая тест-система для оценки биологической активности различных доз и схем введения алкилирующих агентов; показаны условия, позволяющие моделировать клеточные эффекты алкилирующих агентов.
Практическое значение данного исследования заключается и в том, что показаны новые свойства дипина - препарата, широко используемого в клинической и лабораторной практике. Биологическая активность дипина зависит не столько от дозы, сколько от функционального состояния клеток мишеней.
Положения диссертации, подлежащие защите
1. Большинство изменений в клетках печени, инициируемых алки-лирующим агентом, и, в частности, потеря биосинтетических и деток-сицирующих возможностей являются следствием нарушения процесса реорганизации системы интерфазного хроматина,
2. Выявленные нарушения являются долгоживущвми и связаны с модификацией консервативных макромолекул клетки, вероятнее всего с макромолекулярным комплексом хроматина.
3. Скрытые повреждения аппарата реорганизации ядерного хроматина приводят к нарушению биосинтетической деятельности клеток печени в условиях воздействия генного индуктора фенобарбитала.
4. Активация клеток печени перед воздействием алкилирующего агента приводит к резкому усилению повреждающего воздействия, что выражается нарушением формулы популяционно-клеточного ответа.
5. Некоторые общие принципы популяционной регуляции клеточной активности при воздействии активирующих, репрессирующих и комбинированных воздействий,
6. Ступенчатый характер перестройки системы интерфазного хроматина как способ неспецифической регуляции метаболической активности клеток печени.
Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы и глав, посвященных материалам и методам исследования, результатам собственных исследований, их обсуждению; представлен указатель литературы.
Фрагменты работы доложены на конференциях морфологического отдела ЦНИИ 2-го МШПМИ им. Н.И. Пирогова, на Втором Всесоюзном симпозиуме по соматической полиплоидии (Ереван, 1977), на конферен-иди Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 1978), на съезде "Новые методы исследования в экс-периментальной и клинической медицине" (Куйбышев, 1980), на симпо-зиуме "Количественная микроскопия и анализ изображения в биологических и медицинских исследованиях" (Москва, 1981).
Модификация повреждений, вызванных алкилиругащими агентами
Важным моментом при изучении биологических эффектов алкилирующих агентов является вопрос модификации клеточных изменений как в количественном, так и в качественном отношении. К модификаторам следует отнести самые разнообразные физические и химические факторы, меняющие скорость или характер клеточных процессов. Это активаторы или репрессоры генов, метаболические активаторы, влияющие на репликацию, транскрипцию, трансляцию и другие звенья биосинтетических процессов.
В работе Лозио /Lozzio, 1967/ было показано что выход поломок хромосом, индуцированный алкилирующим агентом в лимфоцитах периферической крови человека, увеличивается при активации последних с помощью фитогемагглютинина. Брок / Вчоск., 1971/ обнаружил, что такие алкиляторы как А/ -метил -У-нитро -У-нитрозогуанидин, этил-метансульфонат, двуэтидсульфонат в условиях активной дерепрессии матрицы заметно меняют свое сродство к локусу галактозидозы E.coti Ауэрбах объясняет этот факт тем, что расхождение цепей ДНК облегчает доступ алкилятора к нуклеотидам /Ш.Ауэрбах, 1978/. Большую роль в формировании повреждений играет исходное состояние организма и его особенности, такие как возраст, пол, гормональный и иммунологический статус, эффективность процессов репарации /Н.И. Ким с со-авт., 1983; Н.П. Бочков, Н.П. Кулешов, 1971; OSQWQ et at, 1981/. Помимо этого большую роль играет способ и схема введения алкилято-ра / Сочіеа, Mdiews , 1964 Vogee, 1979/.
При введении циклофосфамида животным, через несколько часов после метаболической активации с помощью фенобарбитала наблюдается увеличение скорости выведения препарата из плазмы крови и в то же время увеличивается скорость накопления метаболитов, которая коррелирует со скоростью их выведения из крови. Резко меняется соотношение концентрации препарата и концентрации метаболитов в моче» Аналогичный сдвиг в соотношении алкилятор/метаболиты и времени их жизни был получен в системе перфузируемой печени животных предварительно обработанных фенобарбиталом / Done Hi et а 6, 1977/. Эти факты свидетельствуют о том,; что в условиях активации метаболизма может существенно меняться как фармакокинетика лекарственного препарата, так и принципиальный характер его биологического действия. Так, например, было показано, что введение циклофосфомида животным, получившим предварительно метаболический активатор уз -нафтоловый, индуцирующий систему цитохромов, - приводит не только к резкому изменению соотношения препарат - метаболиты, но и к резкому повышению мутагенной активности препарата, а также к изменению характера других повреждений / Hotes, Уа//і t 1980/. К такому же эффекту приводит предварительная обработка животных фенобарбиталом, причем мутагенная активность метаболитов увеличивается на порядок. Аналогичные результаты были получены и с использованием других алкилируюших агентов, а также других индукторов и репрессоров системы микросо-мальных ферментов /Яес/с/у el об t 1980; lesca et оЄ t 1979;: Hen-schte ct 1977/.
Принцип метаболической активации оказался весьма эффективным при скрининге самых разнообразных химических агентов, в том числе и алкилирущих агентов на гепатотоксичность и, в частности, на мутагенную активность. На его основе разработано больше количество тест-систем /tfutaroicm е ai, 1983; BGxhe6t,We z.c/о 1980; Vesseinovitch , 1980; De„t% 1979; Sezzes, 1973/.
При воздействии алкилирующего гепатоканцерогена на животных, предварительно обработанных различными ксенобиотиками, было отмечено, что частота возникновения опухолей увеличивалась лишь в том случае, когда предобработка приводила к гиперфункции гепатоцитов. Наиболее активным агентом, увеличивающим гепатоканцерогенез при действии алкилирущих агентов, оказался фенобарбитал / Ре-га і по et ot ,1975/.
Введение метаболических стимуляторов после воздействия алки-лятора может приводить к увеличению сестринских хроматидных обменов и уровня трансформации эмбриональных клеток / DipaoCo, Popes-си , 1981/.
Важное значение имеет модификация самой мишени воздействия. Например, изменение функциональной активности генома, сопровождающееся изменением структуры ядерного хроматина, может менять характер алкилирования молекулы /We/ntvaub , 1983; jLawson et аС 1976/. Исследование чувствительной и резистентной фракции хроматина к ДНКазе - I /Сох, 1979/ показало избирательную тропность алкилирующего агента к эухроматину, в котором более активно протекают процессы транскрипции и репарации первичных молекулярных повреждений. Однако мы полагаем, что репарация по типу "вырезание - зашивание" не залечивает бесследно изменений, индуцируемых алкилирующими агентами.
Метаболическая активность может и уменьшать количество продуктов алкилирования посредством реакции деалкилирования. Эффективность этого процесса зависит от природы алкилирувдего агента, а также от состояния объекта. Например, при действии некоторых -нитрозосоединений стабильность алкилированных компонентов нуклеиновых кислот может существенно меняться. Так, в процессе метаболической активации была изучена ферментативная активность, демети-лирующая О6 -метшщезоксигунозин. БЕЛО показано, что демитилирую-щая активность повышается практически во всех тканях. В условиях метаболической активации деметилирование различных продуктов было одинаково / О Соппеъ, SatfhiU, 1979/.
Одним из факторов, модифицирующих биологический эффект алкили-рувдих агентов, может быть нарушение баланса нуклеотидов во внутриклеточном пуле /Petetson, Peteison, 1979/. Эти авторы показали, что введение животным предшественников нуклеиновых кислот при действии алкилирувдего агента увеличивает количество мутантов и повышает цитотоксичность алкилятора за счет увеличения количества аномалий, возникающих при репликации.
Характеристика типичного алкилирующего агента, отечественного противоракового препарата дипина
Исследования последних лет не изменили ранее сформировавшихся представлений о том, что наиболее важными, с точки зрения конечного биологического эффекта, повреждениями ДНИ при воздействии алкилято-ров являются разрывы полинуклеотидных цепей, образование прочных связей ДНК - ДНК, ДНК - белок, что в конечном итоге может приводить к нарушению матричных свойств хроматина /Н.С. Богомолова с соавт., 1980; В.В. Рупасов с соавт., 1978; С.А. Гиллер с соавт., 1977; Hciwtet/, Biookes, 1967/.
Методами дисперсии оптического вращения, спектрофотометрии, седиментации, вискозимитрии, хроматографии и др. показано влияние различных алкилирующих агентов на гистоны и негистоновые белки. При исследовании эффектов эмбихина и сарколизина на структуру суммарного гистона было выявлено, что оба агента вызывают увеличение вязкости препарата, а сарколизин вызывает и изменения параметров дисперсии оптического вращения гистонов /Н.В. Челяпов с соавт., 1971/. Авторы предполагают, что наблюдаемые эффекты связаны с агрегирующим, а в случае сарколизина, возможно, спираяизующим действием препарата. информационные изменения белков под действием алкиляторов становятся возможными, в первую очередь, за счет увеличения степени свободы молекул при ослаблении взаимодействий ДНК - белок. Важную роль в этом отношении играют локальные повреждения водородных связей /А.С. Богомолова с соавт., 1980/. Образование новых ковалентних ДНК-белковых связей Д.И. Цейтлин, 1979/ - также вносит существенный вклад в формирование повреждений хроматина. При действии алкиляторов могут образовываться сшивки как между молекулами гистонов, так и между молекулами негистоновых белков, однако реакционная способность негистоновых белков в образовании такого рода связей значительно выше. Так, при обработке ДНП из тимуса теленка бифункциональным алкилирующим агентом иприт-эмбихином /П.И. Цейтлин с соавт., 1976/ было показано, что кислые белки образуют белок -белковые сшивки значительно более активно, чем основные белки. Следует отметить, что существенных изменений в обмене гистонов при действии алкиляторов выявить не удалось, в отношении же кислых белков такие факты имеются. В частности, при исследовании хромосомных белков гепатопитов крысы после воздействия диметилнитрозоамина было обнаружено значительное увеличение обмена кислых белков, в то время как изменений в обмене гистоновых белков обнаружено не было. Причем, наиболее интенсивно обменивались слабосвязанные с ДНК неги-стоновые белки. Скорость обмена прочно связанных негистоновых белков при этом существенно не меняется IQotlbQith, Itzhoki, 1979/. Эти авторы также обнаружили, что после инъекции диметилнитрозоамина уменьшается скорость деметилирования слабо связанных с ДНК кислых белков. Приведенные факты позволяют предположить, что эффект алкилирующих препаратов касается в первую очередь хромосомных белков и ферментных систем, имеющих отношение к процессам оперативной регуляции активности генома, хотя многие стороны функционирования негистоновых белков и, в частности, прочно связанных с ДНК, еще недостаточно изучены.
В то же время имеются работы, в которых указывается, что глубоким изменениям могут подвергаться и основные хромосомные белки. Так на модели половых клеток самцов мыши было показано, что основной мишенью для алкилирования является протамин, причем уровень летальных повреждений (доминантных леталей) в половых клетках коррелировал с уровнем этилирования протамина /Seoo, Owens, 1978/.
Таким образом, изменения ДНК в составе ядерного хроматина во многом зависят от ядерных белков, от состояния белковой обкладки. С одной стороны, ядерные белки являются протекторами молекулы ДНК и при этом защищают ее от повреждений, это особенно сказывается при действии монофункциональных алкилирующих агентов /А.И. Горин с соавт., 1976, а,б/. С другой стороны, белки как адекватные мишени для алкилирования и как важная структурирующая и регулирующая составная часть хроматина вносят сверхаддитивный эффект в повреждаемость хроматина / Rapopoit , 1978/. В первую очередь это наблюдается при действии на клетку би- и полифункциональных агентов /Н.А. Соколов с соавт., 1974/. Учитывая широкий спектр повреждений, вызываемых алкилирующими агентами в клеточном ядре, в системе ядерного хроматина, видимо, необходимо учитывать удельный вклад каждого типа изменений в конечное биологическое воздействие на клетку и клеточную популяцию в целом.
Количественный и качественный анализ связывания алкилирующих агентов с различными фракциями хроматина, а также анализ времени жизни первичного молекулярного субстрата алкилирования ДЕЛ, оказался весьма плодотворным для понимания механизмов функциональных нарушений в хроматине клеточного ядра. Так, на примере взаимодействия % ""у/окси - 2ацетиламинофяуорена с хроматином клеток печени крысы с л vivo было показано, что препарат связывается с различными компонентами ДНИ весьма дифферентщровано. Его связывание с РНК, ДНК и белками происходит в соотношении 10:2:1. Причем основная доля препарата, связавшегося с ДНИ, приходится на медленно седиментирувдую фракцию (эухроматин), быстроседиментирующая фракция ДНК (гетерохроматин) - обеднена продуктами апеллирования. Через 1-2 недели метка практически полностью исчезает из хроматина. Из РНК она полностью удаляется к 7 дню, из белка к II дню, причем с первого по одиннадцатый день уменьшение происходит линейно; из ДНК она также удаляется довольно быстро. Однако из гетерохроматина метка удаляется медленнее, чем из эухроматина. Исследование основного и минорного адцуктов показало, что количество минорного аддук-та /3/гуанин - Мг ил/ацетидаминофяуорен/ в гетерохроматине в 2-2,5 раза выше, чем в эухроматине / Schwoztz, оос/моп , 1979/. Таким образом становится более ясно, что глубокие изменения при действии алкиляторов происходят в основном в эухроматине, а остаточные явления могут быть связаны в большей мере с гетерохромати-ном, причем в гетерохроматине сохраняются изменения первичной структуры (модификация минорных оснований), имеющих отношение к регу-ляции функциональной активности клетки /Vonjns/xin et QC , 1973/. Безусловно, высокоспецифический в отношении генетических повреждений ферментативный аппарат системы репарации клетки /М.М. Виленчик, 1976$ Otmezood, Stewett, 1972/ достаточно эффективно удаляет из ДНИ эти изменения. Однако, как мы уже упоминали, определенный "след" последействия может играть важную роль в механизме образования длительно живущих клеточных повреждений.
Анализ процесса активации ядер гепатоцитов крысы в условиях последействия дипина в дозе 15 мг/кг
Возвращаясь к вопросу об активации гепатоцитов с помощью фенобарбитала, следует отметить, что в этой серии экспериментов мы наблюдали совершенно иной характер распределения клеток по уровням активности, чем у интактных животных. Наполненность второго уровня составила 3 %, третьего - 41+4,3 % и четвертого - 26+2,6 %. Такое распределение мы обозначили как третий тип популяции. Совокупность подученных данных свидетельствует о том, что под действием фенобарбитала активация ядер происходит довольно синхронно, при этом сохраняется принцип дискретности распределения ядер по уровням активности. Если индуцирующий стимул воздействует на популяцию гепатоцитов первого типа, то в процесс активации вовлекается как минимум 60 % клеток, которые перемещаются с I и 2 уровней на 3 и 4. Если индуцирующий стимул воздействует на второй функциональный профиль, то в процессе активации вовлекается как минимум 30 % клеток. Однако нельзя исключить, что перестройка хроматина в обоих случаях происходит во всех 100 % клеток. Возможно при действии фенобарбитала клетки могут перемещаться не только на более высокие уровни активности, но и на более низкие, например, с третьего на второй.
Анализ распределения ядер гепатоцитов по уровням активности в различных экспериментальных сериях (более 200 животных) показал, что иные типы популяций, с другим характером распределения, нежели I, П, Ш - явление крайне редкое (менее 5 %). По нашему мнению, отсутствие промежуточных форм распределений отражает высокую скорость перехода ядер с одного уровня активности на другой и дискретный характер регуляции функциональных состояний гепатоцитов. Учитывая кинетику процесса реорганизации хроматина под действием генного индуктора (рис. 3), следует отметить, что третий тип по-пуляции является не стационарным состоянием клеток, а кратковременной реакцией интактных гепатоцитов на индуцирующий стимул. За пределами временного интервала максимальной реорганизации ядра (от 25 до 45 минут после введения фенобарбитала) ни у одного живот-ного не наблюдается ядер на четвертом уровне активности. По сравнению с третьим типом популяции первый и второй типы являются отражением более длительных адаптивных состояний ткани. В рамках физиологических воздействий первый тип популяции, надо полагать, представляет собой клеточный ансамбль с меньшей функциональной активностью, но с большими потенциальными возможностями, чем второй тип. Состояние популяции первого типа, вероятно, является необходимым звеном механизма гомеостаза, играя существенную роль в процессах, защищающих геном от истощения. Анализ всех экспериментальных .данных, полученных в нашей работе, позволил сделать вывод, что соотношение первого и второго типов популяций в каждой экспериментальной группе (серии) является характеристикой, отража-ющей соотношение времен пребывания клеток в этих двух состояниях.
Очевидно, что наблюдаемые нами дискретные уровни активности ядер и четко отграниченные типы популяций являются отражением (формой реализации) общего принципа регуляции активности гепатоци-тов. Речь идет о конкретном выражении закона структурно-функциональной временной дискретности, сформулированного Крыжановским /Т.Н. Крыжановский, 1973/.
На основании рассмотренных данных можно заключить, что изменение функциональной активности ядер гепатоцитов крысы осуществляв ется дискретно (ступенчато), причем переход клеток с одного уров-ня активности на другой происходит объемами, близкими к 30 %. Это позволило выявить три типа функциональных профилей. Третий тип популяции является формой, отражающей реакцию гепатоцитов интактного животного на воздействие генного индуктора. Процесс реорганизации ядерного хроматина в этом случае имеет импульсный характер и осуществляется по жесткой временной программе.
Популяционно-клеточный анализ показал, что дипин в дозе 15 мг/кг (серия Д-І5) не приводит к каким-либо существенным изме-нениям в распределении ядер гепатоцитов по уровням активности (рис. 15). Как было уже отмечено, у интактных животных (серия К) были обнаружении два типа популяций в соотношении 1:2 (здесь и далее это отношение встречаемости первого типа ко второму). Изменений в соотношении типов популяций при действии дипина выявить не удалось. Таким образом, ни средний показатель активности гена-тоцитов в единицах ПАЯ, ни характер популяпдонного ответа существенно не меняется у исходно здоровых животных после воздействия однократной малой дозы препарата. Видимо, дшшн в малых дозах не вызывает существенных надмолекулярных перестроек ядерного хроматина и практически не нарушает механизмы популяционной адаптации в обычных условиях. При введении этим животным генного индуктора (серия Д-І5+ФБ) мы обнаружили нарушение реорганизации ядерного хроматина в 100 % случаев. Поскольку процесс генной индукции ин-тактных животных приводит к стереотипной реакции клеток (у всех животных наблюдается только третий тип популяции), а воздействие одного дипина не влияло на профиль популяции, мы считали корректным сравнивать суммарные распределения ядер гепатоцитов животных, получавших фенобарбитал на фоне дипина с распределением, характеризующим воздействие только одного индуктора (ФБ) и с распределением, характеризующим активность гепатоцитов у интактных животных (рис. 15). У большинства животных полностью отсутствуют ядра с 4 уровнем активности. У 20 % животных такие ядра имеются, однако их количество оказалось приблизительно в 7 раз меньшим, чем у животных, получавших только фенобарбитал. Этот факт, на наш взгляд, отражает индивидуальную реактивность животных в отношении повреждающего воздействия, вероятно, связанную с различным исходным состоянием гепатоцитов в момент действия алкилирующего агента. В целом суммарная гистограмма, характеризующая эффект фенобарбитала на фоне дипина, существенно не отличается от гистограммы интактных не индуцированных животных. Однако соотношение типов популяций в этом случае сдвигается в пользу второго типа - 1:3 (10 популяций первого типа и ЗО - второго), т.е. по сравнению с серией Д-І5 (соотношение 1:2) наблюдается незначительный индуцирующий эффект фенобарбитала (таблица 3). Этот результат, в частности, свидетельству-ет о том, что анализ соотношения типов популяций является довольно чувствительным инструментом для оценки функционального состояния популяций гепатоцитов.
Анализ характера активации ядер гепатоцитов крысы после воздействия дипина на функционально стимулированную печень
Новый метод, по существу, и позволил ответить на поставленные в работе задачи: какие наиболее общие звенья регуляции клеточной активности нарушаются при действии терапевтических доз дипи-на, каков при этом популяционный характер "доморфологических" изменений в печени и ряд других, не менее важных вопросов.
Как следует из работы, уровень реорганизации ядерного хроматина, измеренный in зі hi , достаточно тесно коррелирует с уровнем функциональной активности клеток печени Это оказалось справедливым независимо от того,анализировалась ли кратковременная перестройка ядер в ходе изменения биосинтетической программы гепато-цитов, либо исследовалось относительно стационарное состояние печени.
Поскольку разработке метода посвящена специальная глава, мы считали целесообразным подчеркнуть только отдельные стороны предложенного показателя активности ядра /ПАЯ/. Наиболее важной особенностью метода является то, что изменения физико-химических свойств хроматина, характерные для активации ядра, мы обнаруживали не через изменение косвенных показателей, характеризующих стехиометрию или доступность связывания лигандов с ДНК, а с помощью ионов поливалентных металлов, непосредственно сохраняющих дополнительное, коррелирующее с активацией ядра и клетки, количество ДНК. Количество ДНК мы определяли с помощью реакции Фёльгена. Известно, что в стандартных условиях эта реакция протекает с высокой воспроизводимостью. Метод оценки функциональной активности, определяемой через дополнительное количество ДНК с помощью реакции Фёльгена, является высоко специфическим и потому адекватным для анализа отклонений в функциональной активности в популяции интерфазных клеток.
Одним из основных результатов проведенной работы является вывод о том, что при действии терапевтической дозы алкилирующего агента в клетках печени инициируются скрытые длительноживущие повреждения аппарата регуляции активности, проявляющиеся в условиях функциональных нагрузок. Однако из литературных данных, посвященных химиотерапии, нельзя сделать заключения о существовании сверхдлительного последствия при использовании алкшгарующих агентов. /Лекарственные и диагностические средства, применяемые в онкологической практике, 1982; Система создания противоопухолевых препаратов в СССР и (Ж, 1977/. Таким образом, возникает некоторое несоответствие между этими фактами. Однако определенную согласованность между ними удается проследить.
Чрезвычайно важным наблюдением в работе является то, что клетки печени с потенциальными повреждениями после воздействия дитттта могут функционировать весьма длительное время, выполняя свои многообразные функции. Известно, что при действии аналогичной дозы дипи-на на крыс небольшая часть клеток печени получает мутационные повреждения /Г.Р. Мутовин с соавт., 1975/, которые практически полностью репарируются. Циничные клетки с грубыми поломками хромосом, как известно, элиминируются внутритканевым стабилизирующим отбором /Ю.М. Оленов, 1962/. В печени наблюдается небольшой сдвиг в классах плоидности /Л.Е. Немировский с соавт., 1977/, в самой общей форме характеризующий эффект дипина как гепатотропного агента.
Однако в условиях интенсивных функциональных нагрузок в клетках печени существенно снижаются адаптивные возможности. В частности, гепатоциты не способны адекватно отвечать на белоксинтезнру-ющий стимул; в этом случае тормозится пролиферативная реакция в печени, не индуцируются и некоторые белки ферменты. Таким образом, одним из вопросов для обсуждения становится вопрос о том, с какого типа изменениями может длительно функционировать гепатоцит, могут ли накапливаться обнаруженные изменения, и каков прогноз в отношении поведения этих клеток в условиях многообразия воздействий различных физических и химических факторов.
При действии алкилирующих агентов в гепатоцитах возникают существенные изменения на функциональном уровне; существенных морфологических изменений клеточных ядер на светооптическом уровне нам обнаружить не удалось. В ядрах гепатоцитов нарушается процесс реорганизации хроматина, который уже на ранних этапах генной индукции необходим для изменения генетической программы клетки.
Рассматривая популяционные аспекты регуляции функциональной активности клеток печени в различных экспериментальных условиях нам удалось в некоторой степени раскрыть структурно-временной механизм этого процесса. Этот механизм, вероятно, является основной мишенью при воздействии малых доз препарата. Прежде чем обсудить результаты по воздействию дипина на популяцию печеночных клеток, следует вкратце остановиться на современных представлениях о популяции гепатоцитов - клеточном сообществе как категории, формирующей ту или иную тканевую реакцию в организме. На основании морфологических, гистохимических и электронно-микроскопических данных сложилось представление о гетерогенности
Гепатоциты различных областей печеночной дольки содержат неодинаковое количество РНК, ферментов, питментов и т.д. Отличаются они и ферментативной активностью, связанной, например, с процессами детоксикации или процессами накопления веществ. В настоящее время исследователи связывают эту гетерогенность популяции гепатоцитов с особенностями структурной организации различных зон печеночной дольки /И.В. Урываева с соавт.,1983; А.Ф. Блюгер, 1975; Wilson , 1982/. Многочисленными работами, посвященными проблемам индуктивного биосинтеза, в печени была показана высокая функциональная пластичность гепатоцитов; они легко мобилизуются в ответ на воздействие самых разнообразных индукторов. Так, например, в работе Салганика с соавторами, было показано, что воздействие на клетки печени различных индукторов, гормонов, ксенобиотиков и нормальных метаболитов приводит к соответствующей специализации продуктивной фазы индукции, - синтезу в высоких концентрациях различных белков, ферментов практически во всех клетках.
