Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
Глава 2. Материалы и методы 21
Глава 3. Результаты исследования 30
1. Экспрессия нестина в конечном мозге крыс в ранний постнатальный период онтогенеза 30
1.1. Первый день постнатального развития 30
1.2. Пятый день постнатального развития 45
1.3. Десятый день постнатального развития 57
1.4. Четырнадцатый день постнатального развития 65
2. Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных 73
3. Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных после ишемии 80
3.1 Характеристика ишемического поражения 80
3.2 Экспрессия белков промежуточных филаментов (нестин, виментин, GFAP) в клетках головного мозга после ишемии 85
3.2.1 Нестин 85
3.2.2 Виментин и GFAP 86
Глава 4. Обсуждение 96
1. Нестин в раннем постнатальном периоде онтогенеза 96
2. Нестин в конечном мозге половозрелых животных
3. Экспрессия нестина клетками конечного мозга после ишемии
4. Нестин как маркер нейральных стволовых клеток 113
5. Взаимодействие нестина с другими белками промежуточных филаментов 120 Заключение 122
Выводы 124
Список литературы
- Первый день постнатального развития
- Четырнадцатый день постнатального развития
- Экспрессия белков промежуточных филаментов (нестин, виментин, GFAP) в клетках головного мозга после ишемии
- Нестин в конечном мозге половозрелых животных
Введение к работе
Актуальность темы
Цитоскелет принимает непосредственное участие во всех внутриклеточных процессах. Одним из важнейших компонентов цитоскелета являются промежуточные филаменты (ПФ). Они создают внутриклеточный каркас, обеспечивают упругость клетки, поддерживают упорядоченность расположения компонентов цитоплазмы, координируют связи между внеклеточным матриксом, цитоплазмой и ядром [Улумбеков, Челышев, 2007]. Несмотря на обширный литературный материал, посвященный ПФ [Herrmann, Aebi, 2000; Strelkov et al., 2003; Herrmann, Aebi, 2004; Goldman et al., 2008 и др.], они остаются крайне малоизученными. В настоящее время известно более 50 белков промежуточных филаментов, которые разделяют на шесть классов, основываясь на сходстве в их аминокислотной последовательности [Cooper, 1997; Lendahl et al., 1990]. Одним из самых загадочных и малоизученных белков ПФ является нестин.
На нестин возлагаются большие надежды в качестве иммуноморфологического маркера нейральных стволовых/прогениторньгх клеток (НСПК). Исследования в области стволовых клеток требуют наличия специфических маркеров, выявление которых необходимо не только для более глубокого понимания нейрогенеза, но и может быть полезным для разработки подходов к лечению различных заболеваний и состояний центральной нервной системы. До настоящего времени не существует маркеров, которые бы были специфичны для НСПК. На роль такого маркера предполагается нестин. Однако противоречивый характер данных разных авторов не дает возможности однозначно считать нестин маркером НСПК.
Нестин был открыт в 1985 г. [Hockfield, McKay, 1985]. Ген нестина был охарактеризован в 1990 г. [Lendahl et al., 1990].
Известно, что нестин активно экспрессируется в клетках головного мозга млекопитающих в эмбриональный период онтогенеза [Hockfield, McKay, 1985; Dahlstrand et al., 1995]. В мозге взрослых животных нестин, напортив, почти не обнаруживается. Показано, что по мере дифференцировки нервной ткани синтез нестина подавляется [Zimmerman etal., 1994; Lothian, Lendahl, 1997], а в дифференцирующихся астроцитах и нейронах начинают экспрессироваться глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и белки нейрофиламентов, соответственно. Важно отметить, что при этом недостаточно разработанными остались вопросы о том когда и где происходит смена ПФ. Изучению экспрессии нестина в раннем постнатальном периоде онтогенеза посвящено малое количество работ [Wie et al., 2002]. Между тем, ранний постнатальный период является очень важным этапом онтогенеза. В этот период происходит адаптация к условиям внеутробной жизни. У человека он длится 28 дней после рождения, у крыс — 14 дней. В этот период в головном мозге млекопитающих происходит ряд процессов (пролиферация, дифференцировка, миграция и др.), обуславливающих окончательное созревание нервной системы.
В центральной нервной системе (ЦНС) взрослых млекопитающих нестин в норме обнаруживается только в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой фасции гиппокампа [Cameron, McKay, 2001; Fukuda et al., 2003; Ernst, Christie, 2005; Ogita et al., 2005; Zecevic et al., 2005].
Однако при ряде патологических состояний наблюдается повышение экспрессии нестина. Одним из таких состояний является ишемия головного мозга. Ишемия — одно из наиболее распространенных и тяжелых поражений центральной нервной системы, характеризующихся острым развитием очаговой и общемозговой неврологической симптоматики. Появление нестина после ишемии ассоциируют с нейральными стволовыми клетками, предполагая, что при этом происходит замена погибших клеток новообразованными [Sharp et al., 2002; Не et al, 2005]. Тем не менее
на настоящее время в литературе нет однозначных данных, подтверждающих эту гипотезу.
Таким образом, изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга млекопитающих актуально и имеет не только фундаментальное, но практическое значение.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга крыс на отдельных этапах онтогенеза и после ишемического воздействия с помощью одного из наиболее совершенного из существующих методов — иммуногистохимии. В соответствие с целью исследования были сформированы следующие задачи:
Изучение пространственно-временного распределения клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза.
Характеристика нестин-иммунопозитивных клеток у взрослых интактных животных.
Определение морфологических типов и локализации нестин-иммунопозитивных клеток после ишемического повреждения ЦНС.
Научная новизна
В настоящем исследовании впервые показаны изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза. Продемонстрирована зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемическии период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период.
Основные положения, выносимые на защиту
В пределах мозга существуют региональные различия в экспрессии нестина. Нестин-иммунопозитивные клетки в коре головного мозга и в гиппокампе экспрессируются на разных стадиях развития нервной ткани.
Транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах.
Нестин является неспецифическим маркером нейтральных стволовых/прогениторных клеток. Использование нестина, как маркера НСПК, возможно только с учетом морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров.
Теоретическое и практическое значение исследования
Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований в области нейрогистологии. Полученные данные наглядно демонстрируют, что использование нестина как маркера нейральных стволовых клеток in situ возможно только при соблюдении ряда условий: обязательный учет морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетание методов световой и конфокальной микроскопии, использование других маркеров. Нестин не следует считать специфическим маркером нейральных стволовых клеток. Полученные данные могут быть использованы как при проведении научных экспериментов с применением иммуногистохимических методов, так и в качестве учебных материалов в курсах по нейроморфологии и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических ВУЗов.
Первый день постнатального развития
На первый день постнатального развития (Р1) при окрашивании по методу Ниссля в коре больших полушарий мозга выявляются признаки начинающейся стратификации двигательной коры (рис. 1а): I и II слои уже сформированы, в то время как остальные слои еще не определяются. При иммуногистохимическом выявлении ядерного антигена нейронов NeuN, можно наблюдать сходную картину — четко определяются верхние слои двигательной коры, а в нижних клетки располагаются диффузно (рис. 16).
Иммуногистохимическое исследование белка ПФ нестина обнаруживает на изучаемой стадии в двигательной коре больших полушарий биполярные нестин-иммунопозитивные клетки с радиально направленными маловетвящимися отростками (рис. 2а). Эти отростки протягиваются от молекулярного слоя коры и переходят в белое вещество. Иногда встречаются клетки, дающие интенсивную иммунную реакцию на нестин, в которых видны фигуры митоза (рис. 26). Промежуточные филаменты, содержащие нестин также можно обнаружить в клетках (рис. 2в), похожих на мигрирующие1 (клетки, имеющие "локомоторную" морфологию типичную для мигрирующих нейробластов на поздних этапах развития нервной ткани: короткий лидирующий отросток, оканчивающийся структурой подобной конусу роста [Borrell et al., 2006]). Кроме того, нестин выявляется в клетках стенок капилляров1 и клетках поверхностной глиальной мембраны мозга (вероятно менингоцитах).
При иммуногистохимическом выявлении виментина в неокортексе положительную реакцию на этот белок дают округлые, звездчатые и мигрирующие клетки, а также волокна, переходящие в белое вещество (рис. 3). Схожесть размеров и направления волокон, содержащих виментин, с волокнами, содержащими нестин, позволяет сделать предположение, что промежуточные филаменты в этих волокнах состоят из виментин-нестиновых гетерополимеров. Кроме того, реакцию на виментин, как и на нестин, дают клетки стенки капилляров и клетки поверхностной глиальной мембраны мозга.
Клетки, содержащие ПФ, образованные глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP), в неокортексе на данной стадии отсутствуют.
Субвентрикулярная зона (SVZ) боковых желудочков мозга состоит из эпендимного слоя и клеток в субэпендиме (рис. 4). Последние представляют собой. скопление клеток различной величины и формы. Толщина латеральной SVZ в ростральных участках головного мозга составляет от 100 (в вентральной части) до 500 мкм (в дорсальной), что значительно превышает толщину в каудальньгх участках,
При изучении препаратов в световом микроскопе невозможно точно определить, где располагается иммуногистохимическая реакция на нестин— в эндотелиоцитах, отростках периваскулярных астроцитов или в других клеточных элементах. Поэтому в настоящей работе будет говорится, что нестин определяется в клетках стенки капилляров. Изучению экспрессии нестина в сосудах посвящены специальные исследования [Mokry et al., 2004]. где она составляет около 20 мкм. SVZ с медиальной стороны боковых желудочков всегда тоньше, чем с латеральной. Толщина медиальной SVZ составляет 50-100 мкм в ростральных участках и около 10 мкм в каудальных.
На границе субэпендимного слоя и белового вещества, как показывает иммуногистохимическое выявление антигена NeuN, иногда встречаются единичные дифференцированные нейроны (рис. 5). Среди эпендимоцитов NeuN-иммунопозитивные клетки отсутствуют.
В SVZ положительную реакцию на нестин дают клетки обоих ее слоев. В эпендимоцитах определяется хорошо выраженная цитоплазматическая реакция на нестин (рис. 6). Нестин выявляется как перинуклеарно, так и у вентрикулярной поверхности, и в крупных отростках, направляющихся в белое вещество. Большинство клеток субэпендимного слоя дает положительную реакцию на нестин. Часть этих клеток имеет вытянутую биполярную форму: один отросток отходит в эпендимный слой, а другой отросток, как и у эпендимоцитов, направляется в белое вещество и продолжается в толще коры, доходя до пиальной поверхности (рис. 6). Подобное строение отростков позволяет определить эти клетки как радиальные глиоциты. Другая часть клеток в субэпендимном слое, дающих положительную реакцию на нестин, имеет сложную разнообразную форму. Встречаются митотически делящиеся нестин-иммунопозитивные клетки. Распределение клеток с ПФ, содержащими нестин, совпадает с границами SVZ (рис. 6).
Иммуногистохимическое исследование экспрессии белка ПФ виментина обнаруживает следующее. В SVZ боковых желудочков мозга дают положительную реакцию все эпендимоциты и большинство клеток субэпендимного слоя (рис. 7). Кроме того, обнаруживаются длинные маловетвящиеся отростки клеток обоих слоев радиально расходящиеся от SVZ. На этом сроке в SVZ иммунная реакция на виментин наиболее выраженная (см. таблицу 3). Распределение клеток с ПФ, содержащими виментин, как и в случае с нестином, совпадает с границами SVZ.
Четырнадцатый день постнатального развития
К концу периода раннего постнатального онтогенеза (Р14) структуры конечного мозга у крыс имеют вид, характерный для половозрелых особей. Это хорошо видно при окраске по методу Ниссля, (рис. 32а), и подтверждается при иммуногистохимическом исследовании селективного нейронального ядерного маркера NeuN (рис. 326).
В частности, изучение экспрессии нестина на 14-й день постнатального развития (Р14) позволило установить, что интенсивность иммунной реакции на нестин еще более уменьшается относительно предыдущих изучавшихся сроков. Так в двигательной коре головного мозга нестин выявляется практически только в клетках стенки капилляров (рис. 33). Иногда можно проследить редкие тонкие радиально направленные отростки. Также встречаются единичные звездчатые нестин-иммунопозитивные клетки. Выраженность иммуногистохимической реакции на виментин на этом сроке также значительно уменьшается. Клеток или волокон, содержащих виментин, в сером веществе коры головного мозга не обнаруживается. Однако в белом веществе (на границе SVZ и VI слоя коры) определяются типичные астроциты, экспрессирующие виментин (рис. 34а). Морфологически аналогичные клетки дают положительную реакцию на GFAP (рис. 346) и слабоположительную на нестин (рис. 34в).
SVZ истончается примерно до 140 мкм в ростральных отделах и до примерно 15 мкм в каудальных. В эпендимоцитах уже не определяются длинные отростки, направленные к поверхности коры больших полушарий. Все эпендимоциты экспрессируют виментин (рис. 35). Нестин, напротив, в эпендимнои глии не экспрессируется. При этом, даже в случае отсутствия в составе эпендимного слоя нестин-иммунопозитивных клеток, обязательно встречаются отдельные эпендимоциты с различной интенсивностью реакции на нестин (рис. 36). По степени экспрессии GFAP популяция эпендимоцитов гетерогенна (рис. 37). Часть клеток дает выраженную реакцию, распределенную по всей цитоплазме с некоторой конденсацией вокруг ядра. Другая часть клеток дает слабоположительную реакцию на GFAP с преимущественной локализацией метки в апикальной части клетки. Большинство клеток в субэпендимном слое не экспрессируют нестин (рис. 36). Однако иногда можно увидеть нестин-иммунопозитивные округлые клетки и клетки с короткими отростками, располагающиеся, преимущественно, группами. Виментин по данным иммуногистохимического исследования в субэпендимном слое SVZ не экспрессируется (рис. 35), a GFAP обнаруживается в клетках, напоминающих астроциты (рис. 34, 37).
На основании анализа результатов иммуногистохимических реакций на нестин удалось установить, что в гиппокампе, как и на предыдущих сроках, нестин-иммунопозитивные клетки располагаются во всех слоях кроме str. pyramidale (рис.38). Наибольшее их количество располагается в области зубчатой извилины. По своей морфологии это отростчатые клетки, напоминающие астроциты. Преимущественно эти клетки располагаются в str. radiatum и str. oriens, прилегая к слою пирамидных нейронов. При этом в str. pyramidale проникают длинные отростки этих клеток, пересекающих его перпендикулярно. Прочие слои гиппокампа также имеют большое количество нестин-иммунопозитивных отростков. Интересно, что виментиновые ПФ присутствуют в клетках имеющих такую форму и расположение (рис. 39). Из чего следует, что ПФ отростчатых клеток гиппокампа наиболее вероятно состоят из нестин-виментиновых гетерополимеров. ПФ, образованные GFAP, обнаруживаются в клетках имеющих типичное строение астроцитов (рис. 40). Они располагаются во всех слоях гиппокампа (наименьшее их количество в str. pyramidale и str. radiatum). Также во всех слоях определяются отростки астроцитов.
Виментин-иммунопозитивные эпендимоциты боковых желудочков мозга на 14-й день постнатального развития. Видны обе (латеральная слева и медиальная справа) стенки желудочков, прилегающие друг к другу, вследствие чего создается впечатление, что эпендима состоит из 2 слоев. Е — слой эпендимоцитов. Строение ЦНС у половозрелых контрольных животных не отличалось от хорошо известного многократно описанного В срезах конечного мозга не наблюдалось каких-либо морфологических признаков дистрофических и дегенеративных процессов, за исключением присутствия единичных сморщенных нейронов, преимущественно встречавшихся в гипоталамической области. Двигательная кора головного мозга в обеих (интактных и ложнооперированных) контрольных группах имеет характерную ламинарную структуру (рис. 41). Гиппокамп имеет слоистое строение и неизмененные поля СА1-4 и зубчатую фасцию (рис.42). Количество пирамидных нейронов на 100 мкм СА1 зоны гиппокампа равняется 14,84 ±2,90 и 10,20 ± 2,73 для 1-й и 2-й контрольных групп, соответственно (см. таблицу 4). Количество эктопических нейронов в 1-й контрольной группе составляет 6,30 ±2,13 клеток на 100 мкм СА1, во второй — 3,44 ±0,87 (см. таблицу 4). Субвентрикулярная зона боковых желудочков мозга представляет собой слой эпендимной глии и прилегающие к ним клетки (субэпендимный слой) (рис. 43а). У половозрелых интактных животных SVZ выражена не так явно как в ранний постнатальный период онтогенеза. Толщина SVZ латеральной стенки желудочка составляет 52,50 ± 12,32 мкм. Медиальная стенка по данным световой микроскопии представляет собой только слой эпендимоцитов. В субэпендиме, обычно в латеровентральной части SVZ выявляются единичные NeuN-иммунопозитивные нейроны (рис. 436).
На основании анализа результатов иммуногистохимических реакций на нестин можно сделать заключение, что в большинстве участков мозга в клетках нервной ткани нестин не экспрессируется. Слабо-положительную реакцию на нестин дают эндотелиоциты капилляров (преимущественно в гипоталамической области). В области пролиферативной зоны гиппокампа клетки, содержащие нестин, не обнаружены. В субвентрикулярной пролиферативной зоне конечного мозга встречались единичные клетки, дающие слабую положительную реакцию на нестин (рис. 44). В мозговых оболочках, чаще вблизи базальной поверхности мозга, интенсивную реакцию на нестин дают морфологически не идентифицируемые клеточные элементы (вероятно менингоциты). У ложнооперированных и интактных крыс отсутствует различие в экспрессии нестина. В остальных областях головного мозга нестин-иммунопозитивных клеток обнаружено не было.
Виментин в группе контрольных животных экспрессируется в следующих типах клеток конечного мозга: в клетках оболочек мозга (арахноэндотелиоцитами); в области основания мозга в клетках, формирующих поверхностную глиальную мембрану наблюдается отчетливая цитоплазматическая реакция на виментин; в клетках стенок кровеносных сосудов (рис. 45а). Кроме того, интенсивная реакция на виментин обнаружена во всех клетках эпендимы желудочков мозга (рис. 456). Строма сосудистых сплетений содержит виментин-иммунопозитивные клетки. В эпителии сосудистых сплетений виментин не обнаружен. В области стенок боковых желудочков виментин содержат не только клетки эпендимы, но и клетки субэпендимного слоя (рис. 456). В таницитах третьего желудочка виментин выявляется как в перинуклеарной зоне, так и в отростках. В гипоталамусе, вблизи стенки третьего желудочка присутствуют отдельные клетки, цитоплазма которых дает интенсивную реакцию на виментин. Положительную реакцию на виментин различной интенсивности дают единичные астроциты белого вещества мозга.
Экспрессия белков промежуточных филаментов (нестин, виментин, GFAP) в клетках головного мозга после ишемии
Через неделю после ишемического поражения головного мозга в клетках, находящихся в области поражения обнаруживается выраженная иммуногистохимическая реакция на нестин (рис. 49). По своей морфологии (наличие длинных разветвленных отростков, формирование частью отростков периваскулярных "ножек") эти клетки могут быть идентифицированы как астроциты (рис. 49а).
В гигаюкампе такие нестин-иммунопозитивные клетки располагаются преимущественно на месте погибших нейронов — в str. pyramidale (рис. 496). Также клетки, дающие положительную реакцию на нестин, после ишемии иногда появляются в области гиппокампальной пролиферативной зоны (Fascia dentatd). Морфология этих клеток указывает на то, что, это астроциты, что доказывается данными, полученными с помощью конфокальной лазерной микроскопии (рис. 57). Нестин-иммунопозитивных клеток, делящихся митозом, не обнаружено. Кроме того, в гигаюкампе нестин выявляется в клетках стенок кровеносных сосудов. Экспрессия нестина начинает проявляться на 5-7 сутки после ишемии, достигает максимума (судя по выраженности иммунной реакции и количеству клеток) на 2-х недельном сроке и снижается через месяц после ишемии (см. таблицу 5, рис. 50).
При формировании очага поражения в коре головного мозга по типу ишемического инфаркта, клетки, дающие положительную реакцию нанестин, располагаются по краю очага (рис. 49в). Морфологически эти клетки напоминают астроциты с длинными отростками, формирующими структуры наподобие рыболовной сети. Располагаются онидиффузно — на расстоянии 90,56 ± 44,71 мкм друг от друга. Изредка в эпицентре очага деструкции располагаются единичные нестин-иммунопозитивные астроциты. Нестин-иммунопозитивные нейроны в поврежденных гиппокампе, неокортексе и п. caudatoptamen отсутствуют. Неповрежденные структуры мозга, как правило, не содержат клеток синтезирующих нестин (помимо капиллярных эндотелиоцитов).
В SVZ интенсивность реакции на нестин при ишемическом поражении увеличивается. Через неделю после повреждения часть эпендимоцитов, выстилающих боковые и Ш желудочки мозга обнаруживают иммунную реакцию на нестин. На 2-х недельном сроке положительную реакцию на нестин дают уже все эпендимоциты и большинство клеток в субэпендиме (рис. 51). В сосудистом сплетении конечного мозга положительная реакция на нестин обнаруживалась в клеточных элементах стромы.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии виментина позволило установить, что после ишемического поражения головного мозга в зоне поражения появляются виментин-иммунопозитивные клетки. В гиппокампе эти клетки располагаются во всех слоях и зонах, с преимущественной локализацией в str. pyramidale, sir. lacunoso-moleculare зоны CA1 и hilus зубчатой фасции (рис. 52а). В этих местах наблюдается наиболее плотное расположение виментин-иммунопозитивных клеток. Морфологически эти клетки напоминают активированные астроциты — утолщенная перинуклеарная цитоплазма и гипертрофированные отростки. Также вокруг крупных кровеносных сосудов наблюдаются скопления клеток полигональной формы, содержащих виментин. Экспрессия виментина максимальна на недельном сроке после ишемии и постепенно снижается (см. таблицу 5).
При формировании очага поражения в двигательной коре головного мозга по типу ишемического инфаркта виментин-иммунопозитивные клетки, как и нестин-иммунопозитивные, располагаются покраю очага поражения (рис. 526). Они представляют собой клетки с утолщенной иногда вакуолизированной перинуклеарной цитоплазмой и сильноветвящимися, теснопереплетающимися отростками.
В SVZ положительную реакцию на виментин дают не только клетки в эпендимном слое, но отростчатые клетки в субэпендиме (рис. 52в). Создается такое впечатление, что оттуда они выселяются в белое вещество мозга, где мигрируют к пораженным участкам коры головного мозга.
В ответ на ишемическое поражение происходит индукция синтеза GFAP в астроцитах большинства областей головного мозга. Однако наиболее интенсивная реакция на GFAP обнаруживается в астроцитах в местах повреждения. В гиппокампе при этом происходит увеличение числа GFAP-иммунопозитивных астроцитов относительно равномерно во всех слоях (рис. 53). Морфологически такие активированные астроциты отличаются утолщением отростков и увеличением размеров перикнуклеарной цитоплазмы.
При формировании локализованного очага поражения, как и в случае с нестином, GFAP-иммунопозитивные астроциты располагаются по краю очага (рис. 54). Часть клеток, синтезирующих GFAP обнаруживается в очаге поражения. Наблюдается структурное сходство активированных GFAP-иммунореактивных астроцитов из пораженных областей с нестин-и виментин-иммунопозитивными клетками.
Экспрессия GFAP в области поражения на различных сроках после ишемии претерпевает следующие изменения (см. таблицу 5, Рис. 55). Через 1 неделю после ишемии экспрессия GFAP значительно увеличивается, по сравнению с контрольной группой. Затем (2 недели после ишемии) количество GFAP-иммунопозитивных клеток несколько снижается и становится даже ниже, чем в контроле. Однако, иммунная реакция на GFAP всегда представляется более распространенной, чем на нестина. В SVZ наблюдаются изменения, зависящие от срока после ишемии. Так через неделю после ишемии, как и в контроле, GFAP-иммунопозитивные клетки выявляются исключительно в субэпендимном слое. Эти клетки имеют округлую безотростчатую форму, по размерам они сравнимы с эпендимоцитами. Практически все клетки в субэпендиме экспрессируют GFAP (рис. 56а). Кроме того, в некоторых GFAP-иммунопозитивных клетках видны фигуры митоза. Пролиферация в субэпендимном слое подтверждается выявлением маркера пролиферации PCNA. Все это позволяет определить GFAP-иммунопозитивные клетки как прогениторные глиобласты. Однако через 2 недели после ишемии наблюдается иная картина: реакция в субэпендиме становится более выраженной, а также ПФ, содержащие GFAP, определяются в слое эпендимоцитов (рис. 566). На сроке 4 недели после ишемии иммунная реакция становится более умеренной: часть эпендимоцитов перестает экспрессировать GFAP, а в субэпендимальном слое кроме низкодифферцированных глиоцитов определяются типичные GFAP-иммунореактивные астроциты, часть из которых мигрирует в близлежащее белое вещество.
Нестин в конечном мозге половозрелых животных
Как показали наши исследования, у взрослых интактных животных в большинстве участков мозга иммуногистохимическая реакция на нестин отсутствует, что соответствует данным других авторов. В пролиферативной зоне гиппокампа клетки, содержащие нестин, в отличии от данных S. Fukuda с соавт. [Fukuda et al., 2003] нами обнаружены не были. В тоже время J. Dahlstrand [Dahlstrand etal., 1995] указывает на то, 4TOFDMPHK также нестина не определяется. Отсутствие реакции на нестин можно объяснить наличием в FD пролиферативно немой зоны [Melvin et al., 2007]. Однако подобная разница в результатах не может трактоваться однозначно, т. к. эксперименты проводились с использованием различных методов, а, следовательно, необходимо проведение дополнительного исследования.
В субвентрикулярной пролиферативной зоне конечного мозга встречались единичные клетки, дающие слабую положительную реакцию на нестин (рис. 44). Это подтверждает предположение о том, что популяция нестин-иммунопозитивных клеток в ЦНС гетерогенна. У взрослых интактных животных нестин выявляется в следующих типах клеток: 1. Клетки субэпендимной области. 2. Морфологически не идентифицируемые клеточные элементы мозговых оболочек (вероятно менингоциты). 3. Эндотелиоциты и/или другие клетки стенки сосудов, преимущественно в гипоталамической области. В проведенных нами экспериментах транзиторная общая ишемия головного мозга приводила к гибели нейронов и появлению нестин-иммунопозитивных клеток как в очаге поражения и вне его. Похожие результаты наблюдали и другие исследователи [Li, Chopp, 1999; Sharp et al., 2002; Nakamura et al, 2003; Fukuda et al.; 2003, Michalczyk, Ziman, 2005 и др.].
Результаты наших экспериментов свидетельствуют о зависимости экспрессии нестина от времени после ишемии. Через неделю после пережатия сосудов в очаге появляется большое количество нестин-иммунопозитивных клеток; затем экспрессия нестина увеличивается, достигая пика к 2 неделям, и снижается к 4-м неделям. Сходная динамика описана в работе Y. Li и М. Chopp [Li, Chopp, 1999] с единственной разницей в том, что в их исследовании нестин начинает экспрессироваться в очаге поражения уже через 6 часов после ишемии, пик приходится на 7 день, а затем постепенно снижаясь. Разницу в сроках можно объяснить различными моделями ишемии — фокальная ишемия в экспериментах Li и общая ишемия в наших. Интересно, что количество пролиферирующих клеток вгиппокампе после общей ишемии также сначала увеличивается, а затем снижается [Sharp et al., 2002]. Принимая во внимание, что регуляция функций нестина осуществляется посредством преимущественно С(1с2-киназы, способствующей переходу из G2 вМ фазу клеточного цикла [Sahlgren et al., 2001], можно сделать предположение, что по крайней мере часть нестин-иммунопозитивных клеток в гиппокампе после ишемии есть клетки новообразованные.
По своему строению нестин-иммунопозитивные клетки напоминают астроциты (рис. 57), хотя и встречаются округлые делящиеся клетки и клетки неопределенной формы. Для уточнения предположения, что нестин синтезируется астроцитами была исследована экспрессия белка ПФ III класса GFAP, являющегося маркером астроцитарной глии и виментина, белка ПФ Ш класса, с которым нестин образует гетерополимеры [Herrmann, Aebi, 2000]. Выраженность реакции на GFAP через 1 неделю после ишемии увеличивается (причем как за счет увеличения числа астроцитов, так и усиления иммуногистохимической реакции в них), что соответствует данным других авторов [Clarke et al., 1994; Коржевский и др., 2004]. Любопытно, что затем (на сроке 2 недели) количество GFAP-иммунопозитивных астроцитов снижается и становится даже меньше, чем в контроле. Аналогичные изменения происходят и с виментин-иммунопозитивными клетками: сначала их количество резко возрастает, а к двухнедельному сроку несколько понижается.
На основании результатов применения наиболее совершенного из существующих методов выявления колокализации двух (и более) антигенов— конфокальной лазерной микроскопии — можно заключить, что в большинстве своем нестин экспрессируется в астроцитах. На рисунке 62 видно, что реакция на нестин является в тех же клетках, что и реакция на GFAP. При этом степень колокализации двух белков ПФ различна. В то время как в большинстве случаев нестин колокализуется с GFAP, распространенность реакции на GFAP больше, чем на нестин, из чего следует, что не все астроциты синтезируют нестин. Однако выявляются и нестин-иммунопозитивные/СГАР-иммунонегативные клетки (на рис. 62 отмечена стрелкой). Не смотря на то, что в указанной нарис. 62 клетке мы наблюдаем реакцию на GFAP, выраженность этой реакции не достаточна, чтобы можно было говорить о колокализации нестина и GFAP (рис. 63. Объяснения в подписи к рисунку). По своей морфологии (размеры, отросчатая форма) их сложно отнести к нейронам или олигодендрогии. Также нельзя сказать, что это клетки сосудистой стенки, мигрирующие клетки или радиальные глиоциты. Поэтому нами высказывается предположение, что эти нестин-иммунопозитивные/СРАР-иммунонегативные клетки есть низкодифференцированные предшественники астроцитов (судя по отростчатой форме), хотя не исключено, что и предшественники нейронов.
Таким образом, на основании полученных данных можно предположить следующий ход событий. Через несколько дней после ишемии в очаге поражения начинают пролиферировать астроциты [Коржевский и др., 2004]. Во время деления происходит перестройка ПФ [Chou et al., 2003] и астроциты начинают экспрессировать эмбриональный белок нестин [Коржевский и др., 2006]. При этом они изменяются структурно (набухают), что в литературе называется "активируются" [Clarke et al., 1994; Коржевский и др., 2004 и др.].
Вне очага поражения нестин-иммунопозитивные клетки выявляются преимущественно в области субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга [Li, Chopp, 1999]. Полученные результаты дополняют данные других авторов. Наши данные позволяют сделать заключение, что ответная реакция на ишемию SVZ происходит в отсроченный период (1—2 недели). Экспрессия нестина в SVZ через 1 неделю после ишемии такая же, как в контроле: в субэпендиме выявляются единичные клетки иммунопозитивные к нестину, а в слое эпендимоцитов нестин не обнаруживается. Хотя уже на этом сроке появляются единичные нестин-иммунопозитивные эпендимоциты. В дальнейшем (14 дней после ишемии) нестин выявляется по всей SVZ боковых желудочков. При исследовании экспрессии GFAP выявляется аналогичная картина. На основании описанного пространственно-временого распределения иммуногистохимических реакций можно предположить, что на сроке 1 неделя после ишемии в субэпендимном слое SVZ начинается пролиферация и, возможно, дифференцировка клеток-предшественников. Еще через неделю начинают пролиферировать эпендимоциты. С этим предположением согласуются результаты иммуногистохимического исследования экспрессии маркера пролиферации PCNA. В контроле, PCNA определяется в небольшом количестве клеток в субэпендимном слое, но не в эпендимоцитах.
