Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Взаимодействие вирусов с клетками врожденного иммунитета 11
1.2 . Клеточные механизмы иммунитета в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом 33
Собственные исследования 37
Глава 2. Материал и методы 37
2.1. Инфекционные агенты и экспериментальные животные 37
2.2. Методы выделения клеток врожденного иммунитета и условия их заражения 38
2.3. Иммуногистохимические методы 43
2.4. Методы оценки морфофункциональной активности фагоцитирующих клеток 45
2.5. Методы статистической обработки 48
Глава 3. Характеристика нейтрофилов, зараженных хантавирусом 50
Глава 4. Взаимодействие субпопуляций клеток моноцитарного ряда с хантавирусом 60
4.1. Морфология субпопуляций моноцитов/макрофагов при их взаимодействии с хантавирусом 60
4.2. Активность ферментных систем субпопуляций моноцитов/макрофагов, зараженных хантавирусом 69
Глава 5. Функциональная активность макрофагов, зараженных хантавирусом, при воздействии на них nk клеток 77
Глава 6. Характеристика дендритных клеток, зараженных хантавирусом 83
6.1. Морфологическая характеристика дендритных клеток, зараженных хантавирусом 86
6.2. Функциональная активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом 89
Заключение 98
Выводы 107
Список сокращений 109
Список литературы
- . Клеточные механизмы иммунитета в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом
- Иммуногистохимические методы
- Активность ферментных систем субпопуляций моноцитов/макрофагов, зараженных хантавирусом
- Функциональная активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом
. Клеточные механизмы иммунитета в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом
Взаимоотношения между вирусом и клеткой разнообразны и определяются вирулентными свойствами, как инфекционного агента, так и защитными реакциями клетки-мишени. Следствием цитопатического действия вируса является его ускользание от фагоцитоза, нарушение процессинга белков в эндосомах, подавление синтеза клеточных макромолекул, ведущих к трансформации клеток и переходу инфекционного процесса в персистирующую форму (Болдырев М.Н., Алексеев Л.П., 2006; Макаренкова И.Д., 2013; Blander, 2004; Vo, 2010). В качестве длительного источника персистенции и диссеминации вирусов в организме могут служить клетки, имеющие на своей поверхности специфические гликопротеиновые рецепторы - интегрины. Особую роль играют интегрины LFA-1, Мас-1 и р2 группы VLA, распознающие белки внеклеточного матрикса (Плехова Н.Г., 2009). Так, для проникновения в клетки-мишени полиовирус использует рецептор CD155 (Плехова Н.Г., 2007; Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2009), хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae - ECHO 1, Коксаки А21, А9 и ВЗ - интегрины, состоящие из комбинаций а- и Р-цепей, энтеровирусы 70, ECHO 7, Coxsackie В1, ВЗ и В5 используют рецептор CD55 (Decay-Accelerating Factor - DAF) (Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2010; Helmy K.Y. et al., 2006). Причем Коксаки ВЗ вирус прикрепляется к клеточной поверхности через молекулы семейства нуклеолинов и общий для него и аденовирусов рецептор - CAR, а флавивирусы могут связываться с гепарансульфатным рецептором (Chen D. et al, 2008; Плехова Н.Г., 2007; Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2009). Ряд вирусов ингибируют активацию каспаз, выделяя белки-гомологи с антиапоптозными свойствами (vBcl-2).
Многие вирусы, проникая в иммунные клетки, вызывают состояние иммуносупрессии в организме, нарушая процесс созревания клеток и их функциональную активность (Болдырев М.Н., Алексеев Л.П., 2006; Макаренкова И.Д., 2013). Вирус иммунодефицита человека повреждает CD4+ Т-лимфоциты, вирус клещевого энцефалита подавляет функциональную активность моноцитов, вирус кори ингибирует продукцию IL-12 мононуклеарными фагоцитами, аденовирусы ингибируют образование комплекса пептида с МНС I класса, а цитомегаловирус подавляет экспрессию молекул МНС I и II класса, что минимизирует способность инфицированных антигенпрезентирующих клеток (АПК) представлять вирусные пептиды Т-лимфоцитам (Макаренкова И.Д., 2013; O Brain М., 2013; Lanier L.L., 2008).
Вирус папилломы человека (ВПЧ) для ускользания от иммунной системы использует несколько механизмов. К одному из них относится ограничение цитолитического эффекта. Так, этот вирус не обладает способностью к репликации в антигенпрезентирующих клетках иммунной системы, в результате чего не происходит их активации (Кизей И.Н. и др., 2010). Уменьшение или прекращение экспрессии рецепторов МНС I класса на мембране антигенпрезентирующей клетки происходит за счет их связи с белком Е5 вируса, который удерживает этот комплекс в эндоплазматическом ретикулуме (Forslund О. et al., 2003). Вирусные белки Е6 и Е7 оказывают супрессорное влияние на механизмы интерфероновой защиты, также наблюдается экспрессия белков, инактивирующих апоптоз цитотоксических Т-лимфоцитов. В результате этого нарушается Т-клеточное распознавание за счет супрессии клеточно-поверхностных молекул, таким образом, ВПЧ не индуцирует выраженного антительного ответа. Отсроченная выработка поздних капсидных белков L1 и L2 вирусов в базальных слоях эпителия приводит к медленному антительному ответу через 3-12 месяцев от начала инфекционного процесса, к 18-му месяцу только у 50% пациентов определяются антитела в низких титрах. Антитела иммуноглобулина G LI, L2 ВПЧ связывают с существующей инфекцией, а иммуноглобулина G Е6, Е7 - с излеченной инфекцией (Кизей И.Н. и др., 2010).
Рецептор NKG2D, который экспрессируется на всех NK клетках мышей, распознает белки комплекса гистосовместимости (МНС I), а именно: ранний транскрипт 1 ретиноевой кислоты (RAE1), мышиный ЦЫб-связывающий белок (иЪВР)-подобный транскрипт 1 (MULTl) и Н60 (Lanier L.L., 2008). Примечательно, что мышиный цитомегаловирус затрачивает значительные ресурсы на блокирование экспрессии этих NKG2D лигандов на поверхности инфицированных клеток: так вирусный Ml52 белок ингибирует экспрессию рецептора RAE1 (Lodoen М. et al., 2003); тогда как белки М155иМ138 подавляют экспрессию Н60 (Lodoen М. et al, 2004; Lenac Т. et al., 2006), a MULTl является мишенью для вирусных белков М145 и М138 (Krmpotic A. et al, 2005; Lenac Т. et al., 2006). В инфицированных мышиным цитомегаловирусом NK-клетках гены, кодирующие лиганды NKG2D, транскрибируются, но вирусные белки взаимодействуют и вызывают деградацию NKG2D лиганд протеинов, тем самым обходя обнаружение NKG2D по NK-клеткам.
Лизис инфицированных вирусом коровьей оспы клеток NK-клетками может быть частично блокирован антителами, специфичными к МСрЗО, NKp44 и NKp46. Эти клетки вызывают снижение экспрессии лейкоцитарного антигена Е человека (HLA-E), но не других белков МНС I класса, которые преимущественно и вызывают лизис этих клеток-мишеней NK-клетками, экспрессирующих ингибирующий CD94-NKG2A рецептор, который распознает HLA-E (Brooks C.R. et al., 2006). Помимо этого, вирусы натуральной и коровьей оспы способны синтезировать растворимые белки, которые функционируют как антагонисты рецепторов NKG2D. В то время как цитомегаловирусы развивали стратегию сохранения и деградации NKG2D лигандов внутри инфицированных клеток, вирусы натуральной и коровьей оспы разработали другой механизм уклонения от МС020-опосредованного иммунитета хозяина: они маскируют рецептор NKG2D на NK-клетках и Т-клетках, прежде чем у них появится возможность взаимодействовать с зараженными клетками (Lanier L.L., 2008).
Вирус Эпштейна-Барр трансформирует В-клетки, в результате чего они становятся относительно устойчивы к NK-клеточной атаке за счет экспрессии МНС I типа. Тем не менее, недавнее исследование показало, что когда латентный вирус Эпштейна-Барр восстанавливает трансформированные В-клетки, они становятся восприимчивыми к NK-клеточному лизису, что ранее частично подавлялось путем блокирования активации NKG2D и DNAM1 рецепторов на NK-клетках (Pappworth I.Y. et al, 2007). Вирус гриппа А блокирует активацию NK-клеток с помощью нейтрализующих антител, специфичных к NKG2D и NKp46 (Lanier L.L., 2008).
Обнаружено, что способность организма избавляться от вируса гепатита С связана с наличием киллинг ингибирующих белков, которые экспрессируются на NK-клетках (KIR2DL3) и лейкоцитарный антиген С1 человека (HLA-C1) аллелями (Khakoo, 2004, Vilches, 2002). Это позволило исследователям высказать предположение, что низкая выраженность экспрессии указанных белков KIR2DL3 и HLA-C 1 аллелей определяет более сильное воздействие против вируса (Lanier, 2008).
Иммуногистохимические методы
Западного Нила и полиовирус способен к репродукции только в зрелых макрофагах (Rios М. et al., 2006). Также было установлено, что при заражении хантавирусом перевиваемой линии клеток -предшественников моноцитов и первичной культуры моноцитов/макрофагов иммунореактивность последних была выше. J.S. Yao с соавторами (1992) предположили, что макрофаги могут способствовать распространению вируса Хантаан, а также поддерживают репликацию вируса Пуумала (Temonen М. et al., 1993). Репликация патогенных хантавирусов происходит в эндотелиальных клетках и моноцитах/макрофагах, не вызывая прямого цитопатического эффекта (Pensiero M.N. et al, 1992; Temonen M. et al, 1993; Zaki S.R. et al, 1995). Вирус японского энцефалита (JEV) активирует макрофаги на выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов, которые резко снижаются в JEV-инфицированных макрофагах (Chen S. et al., 2012).
Таким образом, макрофаги играют важную роль в иммунном ответе и противоинфекционной защите организма, принимая непосредственное участие в обезвреживании возбудителя, фагоцитируя зараженные вирусом клетки-мишени и их фрагменты, а также адсорбируя на своей поверхности вирус с его последующим внутриклеточным поглощением, а за счет регуляции межклеточных взаимодействий инициируют развитие адаптивного иммунитета. Механизмы активации макрофагов при разных вирусных заболеваниях не идентичны друг другу и, на наш взгляд, этот вопрос изучен пока недостаточно.
Дендритные клетки (ДК). Одним из ключевых элементов врожденного иммунитета являются ДК, которые взаимодействуют с инфекционными агентами (Steinman R.M., Hemmi Н., 2006; Liu G. et al, 2009). Во время миграции ДК созревают и приобретают характерный набор поверхностных рецепторов, становясь, таким образом, самыми мощными профессиональными антигенпрезентирующими клетками иммунной системы (Steinman R.M., 1991; Banchereau J., Steinman R.M., 1998). Показано, что ДК способны оказывать влияние на тип иммунного ответа через индукцию регуляторных механизмов (O BrainM. etal.,2013). По морфологическим признакам определяются пять степеней зрелости ДК (Алексеенко О.И. и др., 2006). При первой степени зрелости ДК имеют шаровидную форму и узкий ободок интенсивно базофильной цитоплазмы с небольшим количеством ее коротких тонких отростков и единичными длинными отростками, которые располагаются радиально от ядерной оболочки к периферии цитоплазмы. Ядро таких клеток гиперхромное, округлое с неровным контуром и с равномерной компактной структурой хроматина. Ядрышки не выявляются. Ядерно-цитоплазматическое соотношение составляет 1:1,2.
При второй степени зрелости для ДК характерно наличие умеренно развитой цитоплазмы и многочисленных тонких радиальных отростков. Ядерный хроматин равномерной компактной или мелкоглыбчатой структуры. Ядерно-цитоплазматическое соотношение составляет приблизительно 1:2.
При третьей степени зрелости, в отличие от второй, в ДК определяется более развитая умеренно базофильная цитоплазма с отдельными мелкими или крупными вакуолями. Ядерно-цитоплазматическое соотношение увеличивается до 1:3.
Цитоморфологическая характеристика ДК четвертой степени зрелости подобна третьей, однако отличается более развитой цитоплазмой. При этом ядерно-цитоплазматическое соотношение составляет приблизительно 1:4.
К пятой степени зрелости отнесены «вуалевидные» ДК округлой формы с развитой тонкой слабо базофильной мелко- и крупновакуолизированной цитоплазмой. У таких клеток наблюдаются отдельные радиально расположенные отростки. Площадь округлого гиперхромного ядра клеток меньше, чем у ДК четвертой степени зрелости. Ядерно-цитоплазматическое соотношение колеблется приблизительно от 1:5 до 1:6, при этом с увеличением объема цитоплазмы уменьшается количество радиальных отростков, а цитоплазма приобретает «сетчатую» структуру.
В процессе созревания ДК размеры ядер постепенно уменьшаются в 1-2 раза, тогда как объем цитоплазмы увеличивается в 3,5-4 раза за счет увеличения количества и длины отростков, а также появления вакуолей. Цитоплазма ДК включает многочисленные разнообразные вакуоли и включения, эндосомы, лизосомы, хорошо развитый аппарат Гольджи, митохондрии и многочисленные элементы гладкой и шероховатой эндоплазматической сети. Под действием индуктора роста TNF-a в ДК выявляется повышенное содержание РНК, гликогена и гликозаминогликанов (Лебединская О.В., 2006, Кремер Е.Э., 2012).
ДК, способные поглощать экзогенные антигены посредством пиноцитоза, называются незрелыми или вуалевыми клетками, при этом они обладают большими цитоплазматическими "завесами", а не дендритами. К ним относятся популяции отростчатых прилипающих клеток, обладающих высокой антигенперерабатывающей способностью, сохраняющих и презентирующих антиген (Прокопович С.К., Виницкий В.Б., 2001).
Незрелые ДК экспрессируют хемокиновые рецепторы (CCR-1, -2, -5, -6 и CXCR-1) и способны активно мигрировать в очаг воспаления в ответ на воспалительные хемокины (семейства МСР и МІР-1, RANTES и IL-8) (Пащенков М.В., Пинегин Б.В., 2001; Shortman К., Naik S.H. , 2007). Процесс созревания ДК инициируется различными факторами, к которым относятся PAMPs микроорганизмов, экспрессия провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-2, IL-6, TNF-a, GM-CSF) и продукты некроза тканей, в норме отсутствующие в межклеточной среде (Пащенков М.В., Пинегин Б.В., 2006; Fritz J.H. et al., 2005; Hubo, 2013; O Brein, 2013). В процессе дифференцировки на поверхности клеток снижается экспрессия антигенраспознающих рецепторов, прекращаются микропиноцитоз и фагоцитоз, изменяется морфология, повышается активность лизосомальных ферментов и иммунопротеасом, осуществляющих процессинг синтезируемых внутриклеточно белковых антигенов, а на поверхности увеличивается экспрессия молекул адгезии CD54 и CD58, а также приобретается способность к миграции, с последующей презентацией антигена Т-лимфоцитам (Прокопович С.К., Виницкий В.Б., 2001).
Активность ферментных систем субпопуляций моноцитов/макрофагов, зараженных хантавирусом
Несмотря на наличие в литературных источниках сведений о взаимодействии нейтрофилов с вирусами, отсутствуют сведения о влиянии хантавируса на функциональную активность этих клеток. Нами были проведены исследования на нейтро филах перитонеального экссудата морских свинок.
В наших экспериментах было выявлено специфическое свечение в цитоплазме после 1 ч контакта хантавируса с нейтрофилами (рис. 1). Через 1-2 ч инкубации определялось внутриклеточное свечение в виде глыбок, и его интенсивность достигала 42,6 ± 5,6 усл. ед. Максимальные показатели составили 234,56 ± 15,7 усл. ед. после 4 ч инкубации, затем они кратковременно снижались и вновь нарастали, до 24 ч наблюдения, оставаясь на значительном уровне. В дальнейшем, к 2 сут. наблюдения количество антигенпозитивных нейтрофилов было минимальным вследствие деградации клеток.
С помощью сканирующей микроскопии исследовали изменение поверхности нейтрофилов в ответ на заражение хантавирусом. В трехмерном пространстве неактивированные клетки имели характерные выросты треугольной формы на поверхности и, в целом, поверхность мембраны была гладкой, с небольшими выемками. У адгезированных к субстрату клеток исчезали выросты, поверхность мембраны сглаживалась, нейтро филы становились округлыми и по их периметру наблюдались псевдоподии фибриллярного типа, посредством которых осуществлялся контакт между клетками (рис. 2а).
При воздействии вируса в течение 15 мин обнаруживались признаки специфической стимуляции нейтрофилов, на что указывало появление на их поверхности многочисленных округлой формы складок. В это же время на поверхности нейтрофилов наблюдались вирусные частицы, а также обнаруживались группы клеток, находящиеся в плотном контакте, опосредованном с помощью многочисленных вытянутых псевдоподий (рис. 26). Рисунок 1 - Первичная культура нейтрофилов, зараженная хантавирусом. Антигенсодержащие клетки через 1 (а), 2 (б), 3 (в), 4 (г), 5 (д), 24 (е) ч инкубации. Метод нМФА, ЛСКМ, для регистрации в клетках меченного антигена использован Аг+ - лазер с генерацией волны 543 нм, дихроичное зеркало NFT 545 и узкополосный фильтр ВР 560-615, соответствующий эмиссии Alexa Fluor 546. Увеличение X 800. Рисунок 2 - Архитектоника поверхности нейтрофилов: а) интактная культура клеток; нейтрофилы после 15 (б), 45 мин (в), и 1 (г), 4 (д), 6 (е) ч после заражения ХВ. Длина отрезка соответствует: а) 2 от; б, в, г) 1 от; г, д, е) 2 цт. Через 45 мин специфическая стимуляция клеток была более выражена, складчатость поверхности нейтрофилов увеличивалась, а также усиливалась адгезия клеток к поверхности, о чем свидетельствовало уплощение клеток (рис. 2в).
Нейтрофилы с наличием на поверхности экзоцитированных компонентов обнаруживались через 1 ч контакта с хантавирусом (рис. 2г). Поверхность отдельных клеток сглаживалась в результате исчезновения складок, и появлялись группы нейтрофилов, находящиеся в плотном контакте друг с другом. Это указывало на хемотаксическую активность клеток под воздействием вируса.
Через 4 ч количество клеток со сглаженной поверхностью увеличивалось, помимо этого появлялись сильно уплощенные клетки, на поверхности которых обнаруживалось большое количество вирусных частиц (рис. 2д). В результате практически полного исчезновения псевдоподий и складок на поверхности отмечалось еще большее округление нейтрофилов. Наряду с этим отмечалось увеличение количества клеток, находящихся в плотном контакте друг с другом. После 6 ч контакта с хантавирусом все нейтрофилы принимали округлую форму и их поверхность приобретала пенистый вид в результате появления многочисленных выемок. Причем в местах прикрепления нейтрофилов к поверхности выявлялось округление границ, в результате уменьшения количества псевдоподий.
Указанные изменения клеток с течением времени нарастали, появлялись немногочисленные фибриллоподобные псевдоподии, которые соединяли нейтрофилы между собой (рис. 2е). Через 18 ч после инфицирования хантавирусом общее количество клеток уменьшалось вследствие их деградации, оставшиеся нейтрофилы были округленной формы без псевдоподий и обнаруживались клетки с наличием межклеточного вещества на поверхности. Через 24 ч культура нейтрофилов под воздействие вируса полностью разрушалась.
Исследование изменений нейтрофилов, инфицированных хантавирусом, с помощью трансмиссионной электронной микроскопии показало, что вирусные Рисунок 3 - Ультраструктурные изменения зараженных хантавирусом нейтрофилов: а) вирусные частицы в фагосомах (Ф) нейтрофила - 15 мин; б) вирусная частица (Вч) в цитоплазме нейтрофила - 45 мин; в) лизис вирусной оболочки (В) в вакуоле цитоплазмы нейтрофила - 2 ч; г) экскреция гранул (Г) нейтрофила во внеклеточное пространство -2 ч. частицы обнаруживались в фагосомах клеток после первых 15 мин контакта (рис. За), а после 45 мин наблюдались в цитоплазме (рис. 36). Лизис вирусной оболочки в фагосомах, и экскреция гранул во внеклеточное пространство обнаруживались через 2 ч после заражения (рис. Зв, г).
В последующем (6 ч), около ядерных пор нейтрофила отмечался активный синтез белкового компонента, а в цитоплазме наблюдалось образование многочисленных вакуолей, окруженных многослойной мембраной (рис. 4а, б). В это же время обнаруживалось большое количество свободнолежащих рибосом и, напротив, уменьшение числа гранул и лизосом (рис. 4в). Через 24 ч после заражения хантавирусом фагосомы в нейтрофилах увеличивались в размерах и в Рисунок 4 - Ультраструктура нейтрофилов, зараженных хантавирусом: а) синтез белкового компонента около ядерной поры (Яп) нейтрофила; б) вакуоли (В) с многослойной мембраной в цитоплазме нейтрофилов; в) нейтрофил с вакуолизированной (В) цитоплазмой, отмечается большое количество свободнолежащих рибосом (СР) и малым числом гранул и лизосом; г) вирусная частица (Вч) в цитоплазме нейтрофила. 6 ч после заражения.
них наблюдались вирусные частицы и вакуоли, окруженные многослойными мембранами (рис. 5а, б). Там же выявлялись образования из многослойных мембран, видимые и при сканирующей микроскопии через 24 ч после заражения.
Таким образом, нами установлено, что хантавирус способен адгезировать к наружной мембране нейтрофилов и изменять архитектонику их поверхности. Поглощение вируса нейтрофилами преимущественно происходило с помощью фагоцитоза, после чего в фагосомах обнаруживался лизис его оболочек. В последующем морфология таких клеток изменялась, увеличивался их размер, в околоядерном пространстве отмечался активный синтез белкового компонента, в
Ультраструктурные изменения нейтрофилов, зараженных хантавирусом через 24 ч после заражения: а) нейтрофил с фагосомой (Ф), содержащей вирусные частицы (Вч) и вакуоли (В), окруженные многослойными мембранами; б) образования из многослойных осмиофильных мембран (Ом), сформированные нейтрофилом в ответ на заражение вирусами. цитоплазме снижалось количество гранул и выявлялся экзоцитоз биологически активного компонента во внеклеточное пространство.
Известно, что при хемотаксисе плазматическая мембрана нейтрофилов пространственно преобразуется, и данный процесс находится в прямой зависимости от активности ее эктоферментов - 5Л-нуклеотидазы и АТФазы. Результаты исследования показали, что на фоне увеличения числа антигенположительных клеток отмечалось понижение активности 5Л-нуклеотидазы (рис.6а). Минимальные показатели активности этого фермента наблюдались через 15 мин и 3 ч после заражения (20,3 ± 0,65 %) по отношению к контролю, который принят за нуль.
Функциональная активность дендритных клеток при их взаимодействии с хантавирусом
Для комплексной оценки активности кислородзависимого метаболизма в этих клетках нами были проведены цитохимические исследования внутриклеточного содержания ферментов СДГ, ЛДГ и ЦХО. Выявлено по отношению к контролю, который принят за нуль, повышение внутриклеточного содержания СДГ в зрелых моноцитах, инфицированных хантавирусом (рис.166). Так, через 6 ч после заражения индекс стимуляции составил 72,9 ± 0,072 %, затем отмечалось снижение его показателей до 14,5 ± 0,09% (8 ч) и последующее возрастание до 82,3 ± 0,04 5 (24 ч). Также в этих клетках по отношению к контролю, который принят за нуль, наблюдалось повышение активности ЛДГ до 6 ч инкубации (24,3 ± 0,024%) при последующем понижении (-2,7 ± 0,002 %), и повторное повышение с максимальным показателем через 48 ч инкубации 35,1 ± 0,05 % (рис. 176). Установлено (рис. 16в), что через 4 ч после заражения активность ЦХО повышалась в указанной популяции моноцитов (1,9 ± 0,037 %), достигая максимальных значений в конце срока наблюдения (48 ч), и составила 14,4 ± 0,075 % по отношению к контролю, который принят за нуль.
Таким образом, по показателям активности 5 -нуклеотидазы и АТФазы обнаружено, что хантавирус не оказывает стимулирующего действия на незрелые моноциты, тогда как в отношении зрелых моноцитов проявляется его выраженное действие. При этом хантавирус оказывает влияние в большей степени на сукцинатоксидазную систему моноцитов, о чем свидетельствовало повышение активности ферментов СДГ и ЦХО при низкой активности ЛДГ. При этом нитроксидобразующая активность как в незрелых, так и в зрелых моноцитах, зараженных хантавирусом, находилась на низком уровне.
В результате исследований нами установлено, что в перитонеальных макрофагах, зараженных хантавирусом, по отношению к контролю, который принят за нуль, индекс стимуляции 5 -нуклеотидазы достигал минимальных значений через 6 ч (-7,2 ± 0,01 %), а индекс стимуляции АТФазы - через 5 ч (-5,1 ± 0,028 %) совместной инкубации с вирусом (рис. 17а). Данные показатели отражали реакцию клеток на внедрение возбудителя.
При изучении активности кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов, зараженных хантавирусом, определено, что в этих клетках индекс стимуляции СДГ и ЛДГ возрастал в начальные сроки после заражения (до 7 ч) а затем неравномерно снижался к концу срока наблюдения (48 ч) по отношению к контролю, который принят за нуль. Показатели индекса стимуляции в эти сроки составили для СДГ 37,2 ± 0,01 % и 7,9 ± 0,073 %, а для ЛДГ 20,9 ± 0,039 % и 7,6 ± 0,09 %. Эти данные свидетельствуют о том, что в ответ на внедрение хантавируса в макрофагах увеличивалась продукция активных форм кислорода. т,% T, %
Тогда как активность ЦХО повышалась в перитонеальных макрофагах, инфицированных хантавирусом, до 8 ч (22,4 ± 0,08 5) после заражения, а затем снижалась до конца срока наблюдения (-3,3 ± 0,01 %) по отношению к контролю, который принят за нуль. Повышенные значения на начальных сроках инфицирования свидетельствуют об эффекторных свойствах макрофагов в ответ на внедрение хантавируса в клетки.
Необходимо отметить, что если в незрелых и зрелых моноцитах мы не обнаруживали активности нитроксидобразующей системы, то в перитонеальных макрофагах, инфицированных хантавирусом, выявлялась продукция нитритов.
Так, количество внеклеточных нитритов плавно повышалось, достигая максимальных значений через 48 ч после заражения (236,4 ± 0,51 %) по отношению к контролю, который принят за нуль (рис. 17г). Причем внутриклеточные показатели нитритов повышались через 1 и 4 ч после инфицирования хантавирусом. Индекс стимуляции составил 19 ± 0,1% и 38,5 ± 0,09 % соответственно. Это свидетельствует о том, что происходило выделение метаболитов оксида азота во внеклеточное пространство.
Таким образом, по данным 5 -нуклеотидазы и АТФазы установлено, что хантавирус оказывал более выраженную стимуляцию перитонеальных макрофагов по сравнению с популяциями незрелых и зрелых моноцитов. При этом реализуется защитная реакция этих клеток путем активации их кислородзависимой и нитроксидобразующей систем. Внеклеточное выделение нитритов можно расценивать как проявление эффекторных функций перитонеальных макрофагов.
Нами установлено, что в альвеолярных макрофагах, зараженных хантавирусом, индекс стимуляции АТФазы находился в отрицательных значениях на протяжении всего срока наблюдения, достигая минимальных значений через 1 ч и составил -13,1 ± 0,08 % по отношению к контролю, который принят за нуль (рис. 18а). Данные показатели указывали на ярко выраженную стимуляцию альвеолярных макрофагов в ответ на внедрение вируса.
При исследовании кислородобразующей системы альвеолярных макрофагов, зараженных хантавирусом, индекс стимуляции ЛДГ и СДГ по отношению к контролю, который принят за нуль, находился в отрицательных значениях на протяжении всего срока наблюдения (рис. 196), что отражало несостоятельность системы, принимающей участие в образовании активных форм кислорода, и являлось следствием цитотоксического действия вируса.
Нами определено, что активность ЦХО в альвеолярных макрофагах по отношению к контролю, который принят за нуль, повышалась через 1 ч контакта клеток с хантавирусом (рис. 19в), показатель составил 40,3 ± 0,035 %. Затем выявлялось снижение до 11,7 ± 0,026 % (24 ч) и повторное повышение к 48 ч после заражения (18,9 ± 0,04 %). Эти данные свидетельствуют о том, что при внедрении хантавируса в альвеолярные макрофаги выработка активных форм Т,% т,% о
Активность ферментов в инфицированных хантавирусом альвеолярных макрофагах первичной культуры: а) АТФазы; б) ЛДГ (1) и СДГ (2); в) ЦХО; г) внеклеточное содержание метаболитов оксида азота. кислорода все равно происходит даже если активность ЛДГ и СДГ находится в подавленном состоянии. При изучении активности нитроксидзависимой системы альвеолярных макрофагов установлено, что количество внеклеточно расположенных метаболитов оксида азота находилось в отрицательных значениях (рис. 19г), возрастая лишь к концу срока наблюдения (48 ч, 14,1 ± 0,05 %) по отношению к контролю, который принят за нуль.
