Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов 12
1.2. Биологическая роль кремния 20
1.3. Биологически активные органические соединения кремния 24
1.4. Источники кремния для человека 25
1.5. Физиологическая роль кремния и биологические эффекты от поступления его соединений в избыточном количестве 30
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материал исследования 40
2.2. Методы исследования 42
Глава 3. Собственные исследования
3.1. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой
3.1.1. Общеморфологическая характеристика тимуса 50
3.1.2. Тучные клетки тимуса 52
3.1.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки тимуса 57
3.1.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки тимуса 63
3.1.5. Гистаминсодержашие структуры тимуса 67
3.2. Структурно-функциональное состояние селезенки лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой
3.2.1. Общеморфологическая характеристика селезенки 71
3.2.2. Тучные клетки селезенки 74
3.2.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки селезенки 75
3.2.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки селезенки 81
3.2.5. Гистаминсодержашие структуры селезенки 85
3.2.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков селезенки 89
3.3. Структурно-функциональное состояние пейеровых бляшек (подслизистых агрегированных лимфоидных узелков тонкого кишечника) лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой
3.3.1. Общеморфологическая характеристика пейеровых бляшек 92
3.3.2. Тучные клетки пейеровых бляшек 95
3.3.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) 95 клетки пейеровых бляшек
3.3.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки пейеровых бляшек 98
3.3.5. Гистаминсодержашие структуры пейеровых бляшек 101
3.3.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек 104
Обсуждение результатов исследования 107
Заключение 121
Выводы 123
Список использованной литературы 125
Список сокращений 159
Список иллюстративного материала 160
- Биологически активные органические соединения кремния
- Физиологическая роль кремния и биологические эффекты от поступления его соединений в избыточном количестве
- Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки тимуса
- Структурно-функциональное состояние пейеровых бляшек (подслизистых агрегированных лимфоидных узелков тонкого кишечника) лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Кремний содержится во всех тканях и органах растений, животных и человека (Матыченков В. В., 2008; Голохваст К. С., 2010; Currie H. A. et al., 2007; Maehira F. et al., 2008). В животном организме он входит в состав гликозами-ногликанов, принимает участие в формировании костной ткани (Мансурова Л. А. и соавт., 2009; Kim M. Н. et al., 2009; Macdonald H. M. et al., 2012).
Соединения кремния не являются биологически инертными. Вопросы, связанные с поступлением в организм кремния в его различных соединениях и формах, остаются актуальными в мировой науке. Интерес ученых разных стран, касающийся действия соединений кремния на организм, в том числе и на иммунную систему, возрос за последние годы. Многочисленные витральные исследования показывают, что соединения кремния действуют на макрофаги, пролиферацию Т-лимфоцитов, вызывают апоптоз дендритных клеток, влияют на синтез интерлейкинов клетками иммунной системы (Smalley D. et al., 1998; Migliaccio C. et al., 2005; Brown J. М. et al., 2007; Winter M. et al., 2011). Опыты на животных представлены интратрахеальным, внутривенным, алиментарным (пищевые добавки) поступлением в организм диоксида кремния (Сапожников С. П. и соавт., 2013).
Изучение действия кремния на организм человека связано с ретроспективными исследованиями больных силикозом легких, носителей силиконовых имплантатов и страдающих аутоиммунными заболеваниями (Авцын А. П. и со-авт., 1991; Teuber S. S. et al., 1995; Ojo-Amaize E. A., et al., 1996). Независимо от способа поступления в организм, диоксид кремния, асбест, силикон и наноча-стицы кремния способны оказывать сходное выраженное воздействие на звенья иммунной системы, вплоть до участия в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Murakami S. et al., 2009; Speck-Hernandez C. A., Montoya-Ortiz G., 2012).
Согласно нормам физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации (Методические рекомендации. МР 2.3.1.2432-08), суточное потребление кремния человеком составляет 30–50 мг в сутки, однако, биодоступность соединений кремния при этом не учитывается. Некоторое количество биодоступной ортокремниевой кислоты образуется при контакте с водой и биологическими жидкостями диоксида кремния, считающегося нерастворимым (Jurki L. M. et al., 2013). Диоксид кремния входит в состав зубной пасты, декоративной косметики, присутствует в пищевых добавках как разрыхлитель, входит в состав антацидных препаратов (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Ердакова В. П., 2007; Акулович А. В. и соавт., 2011; Powell J. J. et al., 2007).
Источником ортокремниевой кислоты (H4SiO4), главной формы биодоступного кремния для человека и животных, выступают, в основном, растворимые соединения кремниевых кислот. Превращение силикатов природных вод, в частности, метасиликата натрия, в биодоступную ортокремниевую кислоту происходит под действием соляной кислоты желудка (Jurki L. M. et al., 2013).
С питьевой водой может поступать от 50 до 80 процентов от суточной потребности, в зависимости от его содержания в природных источниках, которое может превышать 70 мг/л (Сапожников С. П., 2001; Jugdaohsingh R., 2007; Li Zh. et al., 2010). Содержание силикатов в питьевой воде в Российской Федерации регламентировано 10 мг/л в пересчете на кремний (ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02).
Имеются исследования, подтверждающие связь концентрации водорастворимых соединений кремния в водно-пищевых рационах жителей различных биогеохимических провинций с возникновением дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта, изменениями иммунного статуса, включая формирование аутоиммунных заболеваний (Сапожников С. П., 2001; Сусликов В. Л. и соавт., 2009; Толмачева Н. В., 2011; Ефейкина Н. Б. и соавт., 2012, 2013; Junnila S. K., 2011).
Показано, что под воздействием соединений кремния, поступающего с питьевой водой, происходит морфологическая перестройка и перераспределение биогенных аминов в главном органе иммунитета – тимусе (Дьячкова И. М., 2011; Сергеева В. Е. и соавт., 2013).
Однако, имеющихся литературных данных недостаточно для того, чтобы восполнить пробел в исследованиях, посвященных кремнию, и утверждать, что при поступлении в организм соединений кремния с питьевой водой морфо-функциональные изменения носят системный характер и происходят не только в тимусе, но и в других органах иммунной системы. В связи с этим, вполне обоснован поиск морфологического субстрата адаптационных реакций на поступление водорастворимых соединений кремния со стороны центрального и периферических лимфоидных органов.
Цель работы – изучение морфо-физиологического состояния лимфоид-ных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек) лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой.
Задачи исследования:
1. Изучить микроморфологические изменения тимуса, селезенки, пей-
еровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении соединения
кремния с питьевой водой в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний.
2. Исследовать гистаминсодержащие структуры изучаемых лимфо-
идных органов в моделируемых условиях эксперимента.
-
Определить состояние тучноклеточной популяции в изучаемых лимфоидных органах.
-
Изучить воздействие водного кремния на состояние популяций клеток, имеющих моноцитарно-макрофагальное происхождение (Iba-1-позитивных), в структурах тимуса, селезенки, пейеровых бляшек.
-
Исследовать воздействие водного кремния на состояние популяций антигенпредставляющих (MHС-II-позитивных) клеток в изучаемых лимфоид-ных органах.
6. Оценить пролиферативную активность в герминативных зонах
лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек при поступлении кремния с питьевой водой.
Научная новизна
Впервые при комплексном исследовании показаны микроморфологические особенности тимуса, селезенки и пейеровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой.
Проведена оценка изменения обеспеченности гистаминсодержащих структур изучаемых лимфоидных органов в моделируемых условиях эксперимента.
Получены новые научные данные, отражающие количественные и качественные изменения тучных, антигенпредставляющих клеток (MHC-II позитивных клеток) и моноцитарно-макрофагальных (Iba-1 позитивных) клеток тимуса, селезенки и пейеровых бляшек исследуемых животных при воздействии на организм кремния, поступающего с питьевой водой.
Впервые с помощью маркеров пролиферации PCNA и Ki-67 показаны пролиферативные изменения в герминативных центрах пейеровых бляшек при длительном поступлении кремния с питьевой водой.
Теоретическая и практическая значимость работы
Научные положения и выводы диссертационного исследования в значительной степени расширяют представления о возможных механизмах иммуно-модулирующего действия кремния, в течение длительного времени поступающего ad libitum с питьевой водой, и дополняют современные данные о соcтоянии структурно-функционального статуса лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек) лабораторных животных при адаптации к хроническим воздействиям.
Результаты и практические рекомендации диссертации применяются в учебном процессе и могут быть использованы при написании учебных пособий по клеточной биологии, цитологии, гистологии, общей иммунологии, а также в профилактической медицине.
Реализация результатов исследований
Научные разработки и положения диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе БУ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики», БУ «Чебоксарская районная больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики». Рационализаторское предложение № 1171 «Способ описания морфологического и функционального состояния тучноклеточной популяции в гистологических препаратах», выданное 9 сентября 2013 г. Гордовой В. С., применяется в работе научного студен-
ческого кружка кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии Чувашского государственного университета им. И. Н. Ульянова.
Степень достоверности и апробация результатов
В литературном обзоре подвергнуто критическому анализу большое количество источников. Выбранная модель хронического поступления соединения кремния в организм с питьевой водой соответствует поставленной цели диссертационного исследования. Фактический экспериментальный материал получен на сертифицированном оборудовании. Примененные иммуногистохи-мические маркеры широко используются для оценки морфо-функционального состояния лимфоидных органов. Адекватно выбранные современные методы исследования с использованием методов параметрической и непараметрической статистики с последующей обработкой полученных данных обеспечивают достоверность результатов проведенных экспериментов.
Основные научные положения, выводы и результаты работы доложены и обсуждены на: Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» (Тбилиси, Грузия, 23–26 сентября 1999 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения профессора Д. С. Гордон (Чебоксары, 14 ноября 2012 г.); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммуннореабилитации (ОАЭ, Дубай, 11–15 октября 2013 г.); Международной научной школе «Наука и инновации – 2013» ISS «SI-2013» (Йошкар-Ола, 7–12 июля 2013 г.); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Современные проблемы естественнонаучных исследований» (Чебоксары, 2012, 2013, 2014 гг.); IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Россия, Санкт-Петербург, 18–21 июня, 2013 г.) и расширенном заседании кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» (Чебоксары, 23 мая 2014 г.).
Научные положения, выносимые на защиту:
-
Структурно-функциональные особенности лимфоидных органов лабораторных крыс при поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой заключаются в изменении строения долек тимуса, абсолютном и относительном увеличении площадей герминативных центров лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек.
-
Происходят количественные и качественные изменения популяции антигенпрезентирующих клеток при участии гистамина в селезенке и лимфоидных узелках пейеровых бляшек, что отражает процессы пролиферации в морфо-функциональных зонах, ответственных за формирование пула антигенспецифических лимфоцитов при поступлении с питьевой водой кремния.
Публикации
Основные положения диссертационной работы отражены в 14 опубликованных работах, из них 4 – в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, входящих в перечень, определенный ВАК Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертационный материал изложен на 164 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала. В работе представлено 14 таблиц и 29 рисунков, из которых 24 – микрофотографии. Список литературы содержит 167 отечественных и 128 иностранных источников.
Личное участие автора
Автором самостоятельно собрана и подвергнута анализу научная литература для написания литературного обзора и обсуждения результатов исследований. При непосредственном участии автора проводилась формулировка задач исследования, выбор иммуногистохимических маркеров, планирование эксперимента, проведение экспериментов с животными с последующим выделением лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек), приготовление криостатных срезов с постановкой реакции по методу Кросса, заливка органов в парафин с приготовлением препаратов, окрашенных гематоксилином-эозином и толуидиновым синим по методу Унна. Фотографирование полученных препаратов с последующей морфометрией, статистической обработкой с применением методов параметрической и непараметрической статистики, интерпретация результатов экспериментов, написание текстов научных статей по полученным данным осуществлялось лично автором.
Биологически активные органические соединения кремния
С развитием кремнийорганической химии стало возможным синтезирование ряда биологически активных соединений кремния, в частности, силатранов – внутрикомплексных трициклических кремниевых эфиров триэтаноламина и их производных. Широкий спектр их биологической активности позволяет применять эти вещества одновременно в медицине, косметологии, животноводстве и растениеводстве (Воронков М. Г., Барышок В. П., 2005; Глазко В. И., 2007; Колесникова О. П. и соавт., 2009; Puri J. K. et al., 2011).
Наиболее изучен силимин (I-(хлорметил)силатран), вызывающий повышение концентрации коллагена и гликозаминогликанов и ускоряющий тем самым развитие грануляционной ткани и заживление переломов (Мансурова Л. А. и со-авт., 1983). В стоматологии модифицированные силимином имплантаты усиливают пролиферацию остеобластов и их биосинтетическую деятельность, повышают содержание кальция и фосфора, снижают концентрацию сиаловых кислот, повышают синтез гликозаминогликанов (Мансурова Л. А. и соавт., 2009). Доказано, что 1-хлорметилсилатран стимулирует рост волос, что позволяет использовать его в составе линиментов в различных прописях (Воронков М. Г., Барышок В. П., 2005; Овчаренко Ю. С., 2009).
В животноводстве 1-хлорметилсилатран используется под названием «Ми-вал-Зоо» (Паймерова И. С., 2011; Приходько Е. В., 2012), а в сельском хозяйстве применяется содержащий силатран препарат «Мивал-Агро» (Козлов Ю. В., 2010; Медведева И. Н., Черномордик А. О., 2011; Лякина О. А., 2012).
Несмотря на то, что силатраны обладают противоопухолевым действием, вследствие участия кремния во многих стадиях деятельности естественных киллеров, попытки добиться усиления эффекта путем увеличения дозового режима не увенчались успехом из-за высокой токсичности силатранов (Кудрин А. В., Скальный А. В., 2001; Puri J. K. et al., 2011).
Органические соединения кремния, содержащие Si-O-C группировки, например, полиолаты кремния, также проявляют определенную биологическую активность. Так, был разработан кремнийсодержащий глицеро-гидрогель «Силати-вит», проявляющий выраженную ранозаживляющую, регенерирующую, транску-танную и трансмукозную активность (Хонина Т. Г., 2012).
Следует отметить, что в настоящее время идет как активный поиск новых типов потенциально биологически активных кремнийорганических соединений, так и изучение физиологических свойств этих веществ (Солдатенко А. С., 2011; Сурменева М. А. и соавт., 2012).
Ежедневная потребность человеческого организма в кремнии составляет 20–30 мг, из поступающего в сутки кремния (с пищей и водой – 3,5 мг, из воздуха – 15 мг) усваивается 9–14 мг. Балансовые опыты на животных показали, что почти весь кремний, поступающий с пищей, проходит через пищеварительный тракт транзитом и выводится с калом, а всосавшийся кремний выводится с мочой. У человека в сутки с мочой выводится 9 мг кремния (Авцын А. П. и соавт., 1991). Согласно нормам физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации (Методические рекомендации. МР 2.3.1.2432-08), суточное потребление кремния составляет 30–50 мг в сутки, при этом биодоступность соединений кремния не учитывается.
С воздухом в организм человека поступает 15 мг кремния (Авцын А.П. и соавт., 1991). Считается, что кремний, поступающий в дыхательные пути с пылью, не принимает участия в общем метаболизме кремния в организме, однако, это утверждение можно считать справедливым, если речь не идет о промышленном производстве. Содержание кремния в плазме крови человека составляет 0,5 мг/л (Авцын А. П. и соавт., 1991).
Биодоступность кремния из питьевой воды составляет 50–80%, с водой ежедневно поступает 20-30% суточного кремния (Jugdaohsingh R., 2007). Однако, содержание кремния в питьевой воде открытых источников не является постоянной величиной и зависит от глубины и характера водоносных горизонтов (Siva-sankaran M. A. et al., 2004; Камбалина М. Г., Пикула Н. П., 2012). Неравномерное насыщение питьевой воды силикатами отмечено в Англии, в которой северные провинции характеризуются низким содержанием кремния, а южные – высоким (Jugdaohsingh R., 2007). В минеральной воде кремниевых источников на островах Фиджи, концентрация кремния составляет 86 мг/литр (Li Zh. et al., 2010). В природных водах термальных источников содержание кремневой кислоты достигает 150–200 мг/л. (Камбалина М. Г., Пикула Н. П., 2012). В Чувашской республике были выделены «кремневые» провинции, на территории которых содержание кремния в природных водах превышало 20 мг/литр (Сапожников С. П., 2001). В Российской Федерации содержание силикатов в питьевой воде, в пересчете на кремний, строго регламентировано и составляет 10 мг/л (ГОСТ Р 51232-98 (2002), СанПиН 2.1.4.1074-01, ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02).
Пищевые продукты также являются существенными источниками кремния. Так, кремнием богаты зеленые бобы, кенийская и стручковая фасоль, шпинат, кориандр, высоко его содержание в однодольных растениях – овсе, ячмене, пшенице, особенно в рисе (Currie H. A. et al., 2007, Jugdaohsingh R, 2007, Шаззо А. А., 2010). В европейских странах в организм человека с пищей ежесуточно поступает в среднем 13–62 мг кремния, в Индии – 143–204 мг, в Китае – 139 мг (Jugdaoh-singh R., 2007). Существенная разница в показателях легко объясняется тем, что в рационе жителей Индии и Китая превалирует рис, который относят к «кремние-фильным» растениям (Ma J. F. et al., 2007, 2011; Mitani-Ueno N., et al., 2011). Кремнезем органического происхождения обладает большей биодоступностью, чем неорганический. Биодоступный кремний в концентрации 9–17 мг/г содержится также в биодобавках на основе хвоща, около 50% биодоступного кремния содержит препарат «Monomethyltrisilano» (Ирландия), около 30% – препарат «BioSil» (Бельгия) (Jugdaohsingh R., 2007).
Разрыхлитель двуокись кремния (Е551) отнесен к «пищевым добавкам, не оказывающим вредного воздействия на здоровье человека при использовании, для изготовления пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.,1078-01), «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», М., 2002, Приложение 7). Прошедшая государственную регистрацию синбиотическая добавка к пище «Нормобакт», в состав которой в качестве разрыхлителя входит двуокись кремния, разрешена к применению для детей, достигших шестимесячного возраста (Боровик Т. Э. и соавт., 2010).
Физиологическая роль кремния и биологические эффекты от поступления его соединений в избыточном количестве
В организме человека и млекопитающих кремний входит в состав соединительной ткани. Связанный с гликозаминогликанами и компонентами коллагена, он ускоряет синтез гликозаминогликанов, способствует развитию архитектуры фиброзных элементов соединительной ткани, вносит вклад в их структурную целостность, обеспечивая упругость и эластичность соединительнотканных элементов (Авцын А. П. и соавт., 1991; Мансурова Л. А. и соавт., 2009; Nielsen F. H., 1991, 2008; Seaborn C. D., Nielsen F. H., 2002; Jugdaohsingh R. et al, 2008). Метаболизм кремния в костной ткани тесно связан с метаболизмом кальция (Kim M. N. et al., 2009).
Избыточное поступление соединений кремния неблагоприятно отражается на всех системах организма. Многочисленные опыты in vitro позволяют получить представление о патогенетических основах изменений, происходящих с лабораторными животными при воздействии соединений кремния. Обращает на себя внимание тот факт, что биологический эффект от воздействия кремния наступает вне зависимости от путей их поступления, либо при однократном воздействии высоких доз, либо при хроническом воздействии низких доз. Для лабораторных животных биологические эффекты соединений кремния зависят от способа введения и дозировки.
Считается, что первичный ответ организма на действие нерастворимых частиц стереотипен и заключается в мобилизации неспецифических бактерицидных систем фагоцитов (Величковский Б. Т., 2009). В легких мышей частицы кремния, поступающие с пылью, контактируют с альвеолярными макрофагами, и впоследствии могут быть обнаружены в медиастинальных лимфоузлах и в тимусе (Vacek Р. М. et al., 1991).
Кремнезем потенцирует рост патогенных микобактерий в макрофагах in vitro, однако не оказывает влияния на рост в макрофагах атеннуированного штамма микобактерий (Allison A. C. et al., 1968). Было доказано, что инкубация с кремнеземом в течение 1-3 ч снижает жизнеспособность макрофагов и нейтрофилов у мышей. Кремнезем уменьшает способность макрофагов и нейтрофилов к фагоцитозу эритроцитов и бактерий, подавляет способность клеток к уничтожению факультативно-внутриклеточных бактерий Listeria monocytogenes (Zimmermani B. T. et al., 1986). Под воздействием диоксида кремния мыши, резистентные к микобак-териям туберкулеза, становятся чувствительными к этому возбудителю, что авторы расценивают как появление под воздействием диоксида кремния новой популяции альвеолярных макрофагов (Pasula R. et al., 2009).
Доказано, что внутривенное введение диоксида кремния мышам при системном кандидозе активирует макрофагальное звено (Lee K. W., Balish E., 1983). При интраназальном введении диоксида кремния мышам в интерстинальных и альвеолярных макрофагах значительно увеличивается экспрессия маркеров антигенпрезентирующих клеток (Cassela S. L. et al., 2008).
Кроме того, при воздействии диоксида кремния in vitro, экспрессия этих маркеров увеличивается в макрофагах, извлеченных из костного мозга, (Migliac-cio C. T. et al., 2005). Было обнаружено, что инкубация макрофагов с асбестом приводит к увеличением количества в них ядерного белка Ref-1 (Flaherty D. M. et al., 2002). Как известно, белок Ref-1 выполняет функцию экзонуклеазы, вырезающей участки ДНК и может модифицировать активность белка р53 за счет восстановления одного из цистеинов в случае его окисления (Чумаков П. М., 2007).
Внутритрахеальное введение частиц диоксида кремния мышам приводит к увеличению количества в легочной ткани Т-лимфоцитов (хелперов и супрессоров) через три недели, В-лимфоцитов – через 6 недель. Была выдвинута гипотеза, что лимфокины, секретируемые Т-лимфоцитами, могут вызывать поликлональные пролиферации В-лимфоцитов и стимулировать синтез иммуноглобулинов этими клетками. Это могло бы объяснить неупорядоченный синтез иммуноглобулинов, который наблюдается при развитии силикоза у человека (Kumar R. K., 1989).
На основании того, что при инкубации Т-лимфоцитов периферической крови человека с хризотилом (силикат магния) в них повышается концентрация внутриклеточного кальция, увеличивается синтез IL-2 (в CD4+ клетках), японскими учеными было выдвинуто предположение, что диоксид кремния способен выступать в качестве суперантигена (Ueki A. et al., 1994). Несколько позднее обнаружилось, что Т-клеточный ответ на диоксид кремния зависит от моноцитарно-макрофагального звена (Smalley D. L. et al., 1998, Migliaccio C. T. et al., 2005). Это исследование подтвердило, что для реакции Т-лимфоцитов на хризотил необходимо участие продуктов главного комплекса гистосовместимости МНС класса II. При инкубации эпителиальных бронхиальных клеток человека с кристаллическим кремнием в них происходит изменение экспрессии некоторых генов, ответственных за воспалительный ответ, например, IL-6 и IL-8, однако, аморфный кремний таких изменений не вызывает (Perkins T. N. et al., 2012). При инкубации тучных клеток с кристаллическим кремнием наблюдается увеличение их протеазной активности, выделение ими медиаторов воспаления, однако на дегрануляцию окрашенных азуром тучных клеток кремний влияния не оказал (Brown J. M. et al., 2007).
Изучение острого и хронического силикоза легких у крыс показало, что острый процесс связан с повышенной активацией каспазы-3 и других молекулярных маркеров апоптоза, в то время как хронический силикоз характеризуется уменьшением воспалительного процесса и повышенной экспрессией антимаркеров апоптоза и снижением активности каспазы-3 (Langley R.J. et al., 2010).
Небезучастными к поступлению кремния оказались регуляторные CD4+CD25+ Т-лимфоциты (Tregs). Как известно, эти клетки принимают участие в подавлении продукции провоспалительных цитокинов и антигенпрезентирующих функций дендритных клеток и макрофагов, в индукции апоптоза, снижении генерации Т-хелперов первого и второго типов (Th1 и Th2), а также продукции ими цитокинов, подавлении цитотоксической активности естественными киллерами и CD8+ цитотоксическими лимфоцитами (цит. по: Железникова Г. Ф., 2011). Су-прессорная активность Tregs очень тесно связана с наличием внутриклеточного фактора транскрипции – молекулы Foxp3 (Ярилин А. А., Донецкова А. Д., 2006).
Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки тимуса
При постановке реакции на Iba-1-позитивные структуры (имеющие моноци-тарно-макрофагальное происхождение) в срезах тимуса животных обеих групп четко различаются корковое и мозговое вещество долек. Однако, по сравнению с окраской гематоксилин-эозином, наблюдается противоположная картина – корковое вещество долек тимуса выглядит светлее мозгового, а в мозговом веществе можно выделить более темную границу между корковым и мозговым веществом долек тимуса и светлую зону собственно мозгового вещества.
Наибольшая концентрация Iba-1-позитивных клеток отмечается на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Под соединительнотканной капсулой тимуса также выявляются цепочки Iba-1-позитивных клеток. В корковом веществе долек тимуса лабораторных крыс контрольной группы клетки моноцитар-но-макрофагального происхождения располагаются достаточно равномерно, имеют разную форму и размеры, в подавляющем большинстве это клетки с неровными краями и ярко выраженными выростами. Расположение в них исследуемого белка неравномерное – цитоплазматическая мембрана окрашена более интенсивно, чем цитоплазма (Рисунок 3, А).
При поступлении с питьевой водой кремния происходит изменение интенсивности светопропускания мембраны (90,58±1,14 у.е. и 105,50±1,29 у.е. для опытной и контрольной групп соответственно, p 0,001). Рисунок 4. Iba-1-позитивные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. А – контроль. Б – опыт. Интенсивность светопропускания цитоплазмы Iba-1-позитивных клеток коркового вещества тимуса не изменяется (114,91±1,37 у.е. и 113,74±1,89 у.е. для опытной и контрольной групп соответственно), средняя площадь этих клеток также не претерпевает изменений (76,03±4,4 мкм2 и 77,31±7,46 мкм2 для опытной и контрольной групп соответственно).
На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса также происходит изменение интенсивности светопропускания мембраны (90,56±1,12 у. е. и 94,23±0,68 у. е. для опытной и контрольной групп соответственно, p 0,001) при неизменных показателях для цитоплазмы (125,21±1,53 у. е. и 124,64±0,99 у. е. для опытной и контрольной групп соответственно). Кроме того, отмечается значительное увеличение площади Iba-1-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса (123,79±8,48 мкм2 и 88,37±4,37 мкм2 для опытной и контрольной групп соответственно, p 0,001).
Обращает на себя внимание, что корреляционные связи между характеристиками Iba-1-позитивных клеток претерпевают определенные изменения . Так, в корковом веществе долек тимуса показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,41, 0,65 и 0,41, а для опытной – 0,04, 0,22 и 0,24. То есть, у животных опытной группы наблюдается уменьшение силы корреляционных связей между всеми характеристиками Iba-1-позитивных клеток: значимая положительная связь слабой силы между площадью клетки и интенсивностью светопропускания мембраны и цитоплазмы, а также положительная связь средней силы между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и цитоплазмы мембраны прекращают свое существование.
Корреляционные связи между характеристиками Iba-1 -позитивных клеток. М-П - сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М - сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П - сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А - корковое вещество долек тимуса. Б - граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса.
На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,07, 0,41 и 0,03, а для опытной - 0,10, 0,04 и 0,28 соответственно. Наблюдается исчезновение положительно направленной связи слабой силы между интенсивностью светопропускания в мембране и в цитоплазме Iba-1 -позитивных клеток.
Таким образом, Iba-1-позитивные клетки, располагающиеся на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса, реагируют на поступление кремния увеличением площади, изменением интенсивности светопропускания как в мембране, так и в цитоплазме, а также изменением корреляционных связей между этими показателями. 3.1.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки тимуса
При постановке реакции на MHC-II-позитивные (антигенпрезентирую-щие)структуры в срезах тимуса животных обеих групп корковое и мозговое вещества долек тимуса мало отличаются друг от друга по цвету, определить их можно благодаря рядам из темно окрашенных клеток на границе между корковым и мозговым веществом. При сопоставлении между собой срезов тимуса, обработанных иммуногистохимическими маркерами на Iba-1 и MHC-II, для обоих методов мозговое вещество долек выглядит темнее коркового, а самая большая концентрация позитивных клеток в обоих случаях наблюдается на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса (Рисунок 6).
На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных обеих групп обнаруживаются единичные MHC-II-позитивные макрофаги, подавляющее большинство Iba-1-позитивных макрофагов MHC-II-негативны. MHC-II-позитивные макрофаги имеют интенсивную, темно-коричневую окраску цито-плазматической мембраны и неокрашенную светлую цитоплазму.
Граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса, представленная MHC-II-позитивными клетками, в дольках тимуса лабораторных крыс контрольной группы ровная, состоит из одного ровного протяженного ряда, представленного овально-округлыми клетками, располагающимися на некотором расстоянии друг от друга (Рисунок 7). Цитоплазма этих клеток равномерно окрашена в коричневый цвет, цитоплазматическая мембрана клеток имеет чуть более выраженный коричневый цвет.
Структурно-функциональное состояние пейеровых бляшек (подслизистых агрегированных лимфоидных узелков тонкого кишечника) лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой
Макропрепараты пейеровых бляшек животных контрольной и опытной групп существенно отличаются друг от друга. В увеличенных, более выпуклых, пейеровых бляшках животных опытной группы, напоминающих тутовые ягоды, можно различить четко выделить отдельные лимфоидные узелки (Рисунок 22).
При окраске срезов лимфоидных узелков пейеровых бляшек гематоксилином-эозином в органах контрольных, и опытных животных различимы лимфоидные узелки с выраженными герминативными центрами, имеющими более светлую окраску. Обращает на себя внимание увеличение герминативных центров лимфоид-ных узелков пейеровых бляшек у животных, получавших с питьевой водой соединение кремния .
Из приведенной таблицы видно, что у животных опытной группы увеличивается средняя высота и длина лимфоидного узелка, расстояние между герминативными центрами, что отражается на средней площади лимфоидных узелков. Средняя площадь герминативного центра лимфоидного узелка у животных опытной группы увеличивается в 1,5 раза (р 0,001).
При постановке реакции на моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки в срезах пейеровых бляшек животных как контрольной, так и опытной группы данные структуры наблюдаются во всех их морфо-функциональных зонах.
Поскольку под воздействием соединения кремния, поступающим с питьевой водой, наибольшему влиянию подвержены герминативные центры, мы сосредоточили внимание на Iba-1-позитивных структурах в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек (Рисунок 24).
В герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек крыс контрольной группы Iba-1-позитивные структуры в основном представлены фагоцитирующими макрофагами, содержащими внутри апоптотические тельца. Цито-плазматическая мембрана этих макрофагов имеет коричневый цвет, их цитоплазма не окрашена. У крыс опытной группы Iba-1-позитивные структуры герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек представлены как фагоцитирующими макрофагами, содержащими внутри апоптотические тельца, так и большими клетками неправильной формы.
Цитоплазматическая мембрана Iba-1-позитивных структур имеет коричневый цвет, их цитоплазма либо не окрашена, либо окрашена в светло-коричневый цвет. Визуально фагоцитирующие макрофаги с апоптотическими тельцами меньше макрофагов, наблюдаемых у животных контрольной группы, по размерам.
Наблюдаемая картина подтверждается статистической значимостью различий в средних размерах Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфо-идных узелков пейеровых бляшек. Так, для животных контрольной группы этот показатель составил 222,80±16,87 мкм2, а для животных опытной группы – 173,27±16,57мкм2 (р 0,05). При неизменной интенсивности светопропускания цитоплазматической мембраны (109,25±1,3 у. е. для клеток животных контрольной группы и 108,91±1,6 у. е. для клеток животных опытной группы) наблюдается некоторое уменьшение плотности светопропускания цитоплазмы (143,06±1,89 у. е. для клеток животных контрольной группы и 137,90±1,59 у. е. для клеток животных опытной группы, р 0,05).
Кроме того, имеется статистическая значимость различий в количестве Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек на поле зрения. Для животных контрольной группы это число составило 17,71±0,32, а для животных опытной группы – 24,17±0,03 (р 0, 001).
Обращает на себя внимание то, что претерпевают определенные изменения корреляционные связи между площадями Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек и интенсивностями свето-пропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны в них (Рисунок 25).
Так, показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,23, 0,48 и 0,15, а для опытной – 0,37, 0,52 и 0,62 соответственно. У лабораторных крыс, получавших с питьевой водой соединение кремния, наблюдается появление связи средней силы положительной направленности между интенсивностью светопро-пускания цитоплазмы и площадью клетки.
Таким образом, при воздействии соединения кремния, поступающего с питьевой водой, в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек лабораторных крыс параллельно с увеличением количества Iba-1 -позитивных клеток происходит уменьшение их средней площади и изменение интенсивности светопропускания в их цитоплазме.
При постановке реакции на МНС-II-позитивные клетки в срезах пейеровых бляшек животных как контрольной, так и опытной группы данные структуры наблюдаются во всех морфо-функциональных зонах: в герминативных центрах, в межфолликулярных зонах, а также по краю лимфоидных узелков, прилежащем к соединительнотканной оболочке тонкой кишки.
