Введение к работе
Актуальной проблемой современной биологии является исследование биогенеза пиплентного аппарата фотосинтеза. В этой связи большой интерес представляет выяснение структурно-функциональной организации аппарата биосинтеза хлорофилла, путей образования молекул этого пигмента и его предтеогвенников, их локализации в структуре хлоропласта и связи с другими компонентами фотосинтетического аппарата.
К настоящему времени практически полноотью установлена последовательность реакций, в результате которых из 5-углеродного скелета глутаминовой киолоты образуется молекула хлорофилла (зеаіе, v?einBtein,I990). Показано, что хлороплаоты растительных клеток содержат все ферменты, необходимые для превращения глутаминовой кислоты в хлорофилл. Предполагается, что фермента ран -них этапов хлорофилл ообразования - от образования молекулы 5-ами-нолевулиновой кислоты до синтеза протопорфириногена IX, локали -зованы в стреме, а ферменты, катализирующие все последующие ота-дии процесса - в мембранах хлоропластов (CastelfrAnco, Beale, 1983).
Систематическое исследование локализации аппарата биосинтеза хлорофилла в структуре хлороплаотов зеленых растений было инициировано и активно проводилось А.А.Шпыкш и сотрудниками. Данные о том, что наиболее легкие и лабильные оубмембранные час-типы, получаемые при дезинтеграции хлоропластов, обогащены ове-жеобразованными молекулами иЗ-хлорофилла, его предшественника - хлорофиллидом а, протохлорофиллидом, мономотиловым эфиром Mg-протопорфирииа IX, а также свежеобразованными молекулами кароти-нсидов.хлорофиллазой и ферментом, превращавши хлорофилл а в хлорофилл в, послужили основой для формирования представлений о метаболической гетерогенности фотосинтетических мембран и наличии в них особых структурных элементов - центров биосинтеза хлорофилла, которые содержат высокоорганизованные полиферментные комплексы хлорофилл-синтетазы. Віло показано, что в, центрах биосинтеза хлорофилла осуществляется широкий круг реакций, начиная, по крайней мере, с этапов образования и метилирования Mg-прото-порфирина IX и завершая процесс синтезом самого хлорофилла (Шик и оотр., 1967, 1969, 1975,-1980).
Параллельно о этими работами представления о полиферментаой оиотеме - олигомере о интегрированным активним центром, осуществляющим полностью формирование молекулы хлорофилла, начиная от образования молекулы 5-аминолевулиновой кислоты, развивались Ка-лероь: и сотр. CKaler et el., 1969; Калер, 1976; Калер, Фридлянд, 1978; Фридлянд, Калер, 1980) на основании математического моде -лировачия процесса биосинтеза хлорофилла.
Однако и на сегодняшний день еще мало известно о внутренней организации полиферментных комдлексов, входящих в состав центров биосинтез хлорофилла, о локализации центров в структуре хлоро-пластов. Неясно, насколько широк круг реакций, осуществляемых хлорофилл-синтетазой, какова природа ряда механизмов, контролирующих активность отдельных ферментов биосинтеза хлорофилла. До-полнгтельную информацию об этом могло дать изучение биосинтеза, нативного состояния, локализации в мембранах хлороаластов и вза-имоорганиэации ранних предшественников хлорофилла - протопорфи-рина IX, Mcjj-протопорфирина IX, его монометилового эфира и прото-хлорофиллида.
Развитие представлений о структурно-функциональном устройстве системы биосинтеза хлорофилла органически включает в себя вопросы, касающиеся природа механизмов контроля процесса хлорофил-лообразования. Важным достижением последних лет явилось открытие существования в растениях нескольких путей биосинтеза хлорофилла, образующих химически различающиеся вида молекул этого пигмента, которые, по-видимому, связаны с разными пигмент-белковыми комплексами фотооинтетичеокого аппарата и выполняют, таким образом, различные функции в фотосинтезе { Rebels et nl.,I982). Представляло значительный интерес изучить метаболические особенности поведения промежуточных и конечных продуктов темнового биооинтеза хлорофилла в различных биосинтетических путях. С этой целью изучали образование моно- и дивинильных производных предшеотвенни -ков хлорофилла - протохлорофиллида и монометилового эфира Mg-npo-топорфирина IX в однодольных и двудольных растениях.
Сокращения. АЛК - &-аминолевулиновая киолота; ПП - протопор-фирин IX; Ш - Мд-протопорфирин IX; МПЭ - монометиловый вфир МП; МП(Э) - сумма МП и МПЭ; Цц - цротохлорсфшшзд; Хл - хлорофилл; ЦБХ - центр биосинтеза хлорофилла; СФ и СВФ - спектры флуорео -ценции и возбуждения флуоресценции; Ш - 2,2-дипиридил; MB - пиг-
менты, содержащие во 2-ом положении порфиринового макроцикла ви-нильную группу; ДБ- - пигменты, содержащие во 2-ом и 4-ом положениях порфиринового макроцикла винилыше группы; Ос и С - осадки и супернатаиты, полученные при центрифугировании фрагментов хло-ропластных мембран.
Цель и задача работы. Основная цель работы заключалась в получении новых данных о структурной организации, функционировании и регуляции активности аппарата биосинтеза Хл через изучение образования, нативного состояния и взаимоорганизации тег.шовых предшественников Хл - ПП, МП(Э) и Пд. Вали поставлены следующие задачи:
Г. Изучить нативное оостодаие, локализацию в мембранах хло-ропластов и пространственную взаимоорганизацив ранних мембрано -связанных предаесгвеиников Хл - ІШ, Ш(Э) и Пд m vivo.
-
Исследовать возможное энергетическое сопряжение Ш и' Ш(Э) с каротиноїдами.
-
Изучить активность одного из ферментов Mg-участка пути биосинтеза Хл - S -аденозил-1 -метионингМ^-протопорфирин IX ме-тилтрансферазы в листьях пшеницы, снабжаемых экзогенной АЛН.
-
Изучить химическую гетерогенность молекул Пд и МПЭ в ряде этиолированных, поотэтиолированкых и зеленых однодольных и двудольных растений в норме и при обработке их экзогенной АЖ и хелаторами металлов. '
Научная новизна работы. Обнаружено сцепленное сооредоточе -нив ПП, МП(Э) и Пд в участках хлоропластных мембран, характеризующихся повышенным содержанием ЦБХ. Сделан вывод, что все мемб-раносвязанкые стадии формирования молекула Хл, начиная,.по меньшей мере, с образования ПП, осуществляются в ЦБХ и катализируются единым поляферментным комплексом.
Описаны in vivo низкотемпературные СФ и СБФ Ш и МП(Э) в этиолированных лиотьях ячменя и пшепкца и з клетках мутанта Chla-mydomoafts г. H-I9. Показано, что образованные из экзогенной АЛК молекулы ПП и Ш(Э) накапливаются в растениях в монемзрном состоянии. Установлено, что m vivo существует миграция энергии от ПП и МП(Э) к Пд, тогда как ПП и Ш(Э) энергетически разобщены о каротиноидами.
По мере накопления в этиолированных и зеленых листьях пшеницы МПЭ и Пд из экзогенной AJIK активность S-аденозил- ь-мэтионин:
МоЧіротопорфирин IX мзтилтрансферазы заметно снижается.
Обнаружен различный характер накопления подфондов MB- и ДВ-Пд в ходо темпового развития этиолированных семядолей огурцов, в ходе ресинтеза Пд после светового воздействия и"доследующего затемнения семядолей, а также при накоплении пигментов из экзогенной АЛК. В двудолышх растениях существуют два типа ЦБХ, одни из которых синтезируют Ш-, а другие - ДВ-Пд. ЦБХ ИЗ- и ДТЗ-типов в двудольных растениях функционируют независимо друг от. друга. У однодольних растений ДВ-Пд является интермедиатом в цепи хлорофиллообрезования - предшественником МВ-Цд. Ш индуцирует накопление MB- п ДВ-производных Пд и ШЭ, активируя, таким образом, МЗ- и ДВ-типы ЦЕХ.
Практическое значение, йооледование нативного состояния, внутримембранной локализации и взаимоорганизации молекул предшественников Хл, а также их химической гетерогенности способствует лучшему понимания принципов структурной организации и функционирования аппарата биосинтеза Хл. Сведения о сопряженной вну-трихлоропластной локализации и энергетическом взаимодействии Ш, МП(Э) и Пд яэляютоя вдашш свидетельством их пространственной близости, что экспериментально подтверждает существование ЦБХ и полиферментного комплекса, катализирующего мембраносвязанные реакция процесса биосинтеза Хл.
Разработанный наїли опектрофлуориметрический метод количественного определения ПИ в экстрактах этиолкрованнах и зеленых лиотьев, содержащих помимо ІШ такке МП(Э), Дц и хлорофиллид, нашел широкое использование в работах лаборатории по изучению метаболизма ранних интермадиатов цепи хлорофиллообразования.'
Полученные в работе фундаментальше данные имеют практическое значение при создании гербицидов, обладающих фотодинашчес-ким типом действия.
' Апробация работа. Материалы работа докладывались и ебсузда-лиоь на ІУ Всесоюзной конференции по яиши и примокошію порфири-нов, Иваново, 1984; U Всесоюзной конференции до "Биологии клетки'", Тбилиси, 1985; Региональной конференции "Молекулярные механизма регуляции метаболических процессов", Минск, 1987; Всесоюзном совещании по поотицидш, Черноголовка, 1288; У Всесоюзной конференции по координационной и физической химии порфиринов, , Иваново, 1988; Всесоюзно;.»! осваивании по молекулярной лшинеоцон-
ции, Караганда, 1939; ІУ Всесоюзной конференцій! молодых ученых по физиологии растительной клетки, Минск, 1990; 2-ом Всесоюзном съезде физиологов растений, Минск, 1990; Международной конференции "Фотосинтез и фогобиотехнология", Пущино, 1991.
Публикации. Результаты опубликованы в работах.
Структура диссертации. Диссертация содержит: введение, об
зор литературы, 2 главы, обсуждение результатов, выводы, приложе
ние и список цитируемой литературы из j??$ наименований. Материал
содержит страниц машинописного текста, таблиц и рисун-
ков.
Объекты и методы исследования. Работу проводили о этиолированными, постэтиолированными и зелеными листьями рада однодоль -них и двудольных растений, а также пигментным мутантом Chlamydo-топаз г. Культуру мутанта любезно предоставил А.С.Чунаез. Зеленые растения выращивали под люминесцентными лампами ЛБ-40 (освещенность 3,2 ВтДг), а этиолированные - в темноте, при 24С в обоих случаях. Клетки мутанта культивировали в темноте при 24С на плотной среде Я2 с ацетатом в течение нескольких суток (Квитко, Борцевская, Чунаев, .1983).
Измерения флуоресценции экстрактов листьв проводили с помощью спектрофлуориметра, изготовленного ЦКБ АМН СССР, регистрируя некоррелированные спектры (Аверина, Шалыго, Фрадкин, 1980).-Нескорректированные С$ и СВФ листьев и клеток водоросли при ~196С регистрировали на спектрофлуориметре, описанном в работе (Доман-ский, Самойленко, Лис, 1986), при спектральной ширине щели воз -бувдающего и регистрирующего монохроматоров 2 нм оо светофильт -ром 0C-I3 перед регистрирующим монохроматором.
Для выделения хлоропластов листья растирали в 0,2 М Трио -ГОІ буфере с добавлением сахарозы, после чего гомогенат пропускали через 2 слоя капроновой ткани и осаждали пластида в течение 15 глин при I 000 g. Для выделения фрагментов мембран использовали либо механическую дезинтеграцию листьев, либо добавление к хлоропластам 0,5 раствора дигитонина. Фракционирование мембран проводили с помощью выоокоокоростнсго дифференциального центрифугирования фрагментов хлоропластов в режиме: 10 мин - 2 000 р, 30 мин - 10 000 g, 50 мин - 50 000 , 60 мин - 144 000 g. Легкие частица, содержащиеся в конечном оупернатанте (Сj^), высаливали о помощью 30-, 60- и 100$ сульфата аммония и осаждали центрифуги-
рованием 60 мин при 144 000 $.
Количества ПП, МП(Э) и Пд определяли по СФ отмытых гексаном водно-ацетоновых экстрактов листьев (Аверина и др., 1980, 1984). Содержание Хл а и в в гексане рассчитывали из спектров поглощения ( Kooki, 1950).
Хромат ографическое разделение ПП, МП, МПЭ и Пд осуществляли в тонком слое силикагеля ЛС 5/40 мык в системе растворителей: бензол- этилацетат-этанол (4:І:І,У/УД) ( Ввіап^ет, Rebeiz, 1980). Разделение пулов Пд и МПЭ на MB- и ДВ-кошоненты осуществляли с ' помощью хроматографии в тонком слое полиэтиленового порошка марки ПНД 20508040, выпускаемого Гурьевским химкомбинатом (СССР), модифицировав известную методику ( Belonger, aebeia, 1980).
Активность s-аденозил-1>-метионин;М-протопорфирйН IX метил-трансферазы определяли по количеству МПЭ, образованному гомогенатами листьев пшеница из S-аденозил- Ь-ыетионина И МП ( Ellsworth, , Pierre, 1974).
НАТГОНОЕ СОСТйШИЕ, ВЗАИМНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Б ІЯЕРАНАХ ПЛАСТИД ПРОТОПОРФИРИНА IX, Mg-ПРОТОПОРФИРИНА IX, МОНОЫЕТИЛОВОГО ЭФИРА М^-ПРОТОПОРФИРжГіХ И ПР0Г0ХЛ0Р0ФИ.О.ИДА..
СпектроФлуориметричеокое исследование нативного состояния ПП и Ш(3) в растениях. В результате исследований спектральных свойств этиолированных и зеленых листьев получена значительная информация о натизном состоянии Хл и его ближайшего тешового предшественника - Пд (Красновский, 1974; Virgin, 1981). Сведения о опзктральных характеристиках других болео ранних интермеднатов цепи хлорофиллообразования - ПП и Ш(Э), весьма ограничены. Спектра поглощения мутантов водорослей к- высших растений с повышен -ннм содержанием зтих пигментов осложнены полосам! поглощения других продуктов цепи биосинтеза Хл и каротинокдов. Известная нам информация о люминесцентных свойствах ПП и Ш(Э) in vivo к началу данного исследования сводилась к данным о положении полосы Соре ПП в' клетках порфириновых ыутантов chloayaoaonas г. (Чунаев ' и др., 1981) и основной полосы свечения МЩЭ) в зеленеющих листьях ячменя (Аверина, Шалыго, Фрадкин, 1980).
Исследование нативного состояния Ш1 проводили о использованием малопигментированной этиолированной ткани (2-дневше проростки или нижняя часть 12-дневных лиотьев ячменя), обработанной она-
чала растворами хелаторов металлов - ДП или 1,10-фенантролина,. блокирующими превращение МПЭ В Пд (Du>an, Gaseman, 1974), а за -тем экзогенной АЛК в сочетании о хелатором. Подвергнутые такой процедуре листья содержали практически только ПП.
СФ (-196) этиолированного лиота, накопившего Ш (рио.1), имеет сложную структуру о основной полосой при 632-633 нм и тремя менее интенсивными полосами при 664, 682 и 701 нм. В зарегистрированном при 701 нм СВФ такого листа наблюдаются полосы при 631, 605-607, 577 о плечом при 585, 542, 512 и 418 (Спре) им. СФ и СВФ m vivo показывают независящее от температуры регистрации батохромнре смещение по оравнению оо спектрами Ш в растворе 0,05 MNajHPo^ (для полосы Соре смещение составляет 14 нм). Различным оказалось и соотношение ингенсивноотей полос в СВФ. ПП in vivo и In vitro. Нами, так. же как и другими авторами (Ьагаоїа et al.,I98I), показано, что добавление сывороточного аіьбумина к раствору ПП в 0,05 М ИагНР0. приводит к батохромному смещению полосы Соре на 13 нм и основного максимума в СФ на 10 нм, так что в присутствии белка СФ и СВФ приближаются к спектрам порфирина в листе. Вероятно, связь ПП о мембранами определяется в основном гидрофобным взаимодействием пигмента о белковыми компонентами мембраны. Однако, поскольку связывание о альбумином не влияет на соотношение между интенсивноотями полос в СВФ ПП, можно говорить о дополнительных специфических особенностях микроокружения порфирина в клетке.
Поскольку в ассимилировавших экзогенную АЛК этиолированных листьях ПП накапливается в количествах, сопоставимых с уровнем эндогенного Пд (Аверина и др.,1988), спектральные свойства длинноволновой форма которого определяются агрегацией пигментных молекул (Фрадкин, Шшк, 1978), можно было ожидать, что ПП накапливается также в агрегированной форме. Однако никаких спектральных проявлений агрегации, характерных для ПП in vitro, таких как гип-сохромный сдвиг полосы Соре, "размывание" и батохромний сдвиг Q-полосы, появление новых полоо в СФ, в опектрах изученных расти -тельных объектов не наблюдается. Использование воздействий, ведущих к разрушению агрегатов Пд и Хл в листьях, таких как инфильтрация в них дигитонина, пиридина, многократное замораживание-оттаивание образцов, не влияет на спектры ПП в растениях. Сделал вывод, что in vivo ПП находится в мономэрном оостояшіт.
I фа..отв.ед.
7CQ,EH
Ряс. I. Спектры флуоресценции (-196) при возбуждения 410 ш (I) и возбуждения флуоресценция при 701 ем (2), 580 км (3), 550 н?л (4) и 530 нм (5) 2-дневного этиолированного листа ячменя,инкубированного 3 ч на растворе 10 ьй ДП,а затем 18 ч на растворе 10 мМ АПК в сочетания с ДП. Приведен такке спектр возбуждения флуоресцен -ции водного раствора рибофлавина при 585 нм (6)
Рве. 2. Спектры флуоресценции (-196) при возбуждении 420 нм (I) и возбуждения флуоресценции прз 593 (2,3). 580 (4), 550 (5) и 530 нм (6) 7-дневного этиолированного листа ячменя,инкубированного 3 ч на растворе 10 мМ ДП, а затем 18 ч на растворе 10 Ш АЛК. Приведен также спектр возбуждения флуоресценции водного раствора рибофлавина при 585 нм (7).Масштаб спектров 3-6 увеличен в 10 раз.
В СФ (-196) 7-дневных этиолированных листьев, обработанных в темноте растворами хелаторов, а затем подкормленных экзогенной АЖ, присутствует узкая полоса МП(Э) о максимумом при 593 нм (рис.2). Наблюдение второй полосы флуореоценции МП(Э) in vivo затруднено из-за наличия полос Цд в области 630-660 нм. В СВФ нативного МП(Э) присутствуют полосы с максимумами при 42S (Соре), 555 и 592 нм. Вид спектров Ш(Э) in vivo практически не зависит от температуры регистрации. Полоса Соре эндогенного МЩЭ) смещена в красную облаоть на 8 нм по сравнению с полосой Соре МП в 0,5 М п^г^о4 Отношение интенсивноотей полос Соре и полос при 555 нм у нативного пигмента меньше (1,6), чем у раство -ренного (6,0). При добавлении к раствору МП в фосфатном буфера сывороточного альбумина, как и в случае Ш, наблюдаотся'батохрсм-ное смещение полосы Сорз (до 10 нм), возрастание лктенсявности свечения, сужение основной полоси флуоресценции и гипсохрсмшй сдвиг второй полоса свечения.
Низкотемпературные спектра МП в Трис-ЮЇ буфере с добавлением ДОЗО и Тритона Х-100 наилучшим образом воспроизводят опектрц нативного пигмзнга и по положении максимумов, и по соотношению интенсивностей полос в СФ и СВ. Полосы МП в модельной системе уже, чем in vivo, что макет объясняться более жесткой фиксацией и ориентацией молекул пигмента з замороженном растворе.
Ни на одной из стадий накопления Ш(Э) в листьях, как и в случае ГОІ, не наблюдалось признаков агрегации этого пигмента, характерных для агрегатов МП in vitro (Гуринознч, Севченко, Соловьев, 1968).
Таким образом, особенности нативного состояния ІШ и Ш(Э), накапливаемых из экзогенной АІК з этиолированных листьях, обусловленные их взаимодействием с мембранами, определяются в основном гидрофобным взаимодействием пигментов с белками мембран, а также другими особенностями ыикроокружея:гя порфярднов в клетке. in vivo и Ш(Э), и ШІ находятся в моноиерноа состоянии.
Отсутствие переноса энергии от каротинодлов к ПП и Щ(.Э).._в растениях. Эффективность переноса энергии от каротиноидсп к Хл в светособирающих комплексах хлорояласгоз достигает 100$ (Фрадкин и др., 1975; 1986; Siefermann-m»rra3,IS35), тогда как миграция энергии от каротинокдов к Дц как в этиолированных (Batier, 1961; Pradkin at nl., 1969), так и в зеленых растениях (ІІЬінк и
др., 1967) либо отсутствует, либо имеет место о очень низкой эффективностью - 2-5/2 (Стадничук, Литвин, 1989). Миграция энергии от каротиноидов к Пд и Пхл в модельных системах (Зенькевич и др., 1975; Фрадкин и др., 1985) показывает принципиальную возможность переноса анергии между этими пигментами и свидетельствует о сте-рической разобщенности желтых пигментов и Пд в мембранах пластид (Фрадкин, ІШшк, 1967). Данные об энергетической сопряженности каротиноидов и более ранних интермедиатов цепи хлорофиллообразова-ния в высших растениях к началу данного исследования отсутотво -вали.
Анализ СФ и СВФ (-196С) этиолированных и зеленых листьев ячменя, накопивших Ш(Э), показал, что в зарегистрированном при наблюдении в максимуме свечения МЩЭ) - 593 нм - СВФ помимо по -лос МК(Э) - 426 и 55S нм, отмечается слабая полоса о максимумом при 477-480 нм (рио.2). При регистрации флуоресценции в более коротковолновой области спектра - 580, 550, 530 нм, где МП(Э) не флуоресцирует, полоса о макимумом при 477-480 нм становится более интенсивной и наряду о ней появляется полоса с максимумом при 453 нм. Это означает, что на флуоресценцию МП(Э) при 593 нм налагается длинноволновый спад свечения, максимум которого находится в более коротковолновой области. Одним из источников коротковолновой люминесценции в листьях могут быть вещества флавино-воЙ природы, излучающие в области 450-650 нм (Katald., Yagi, 1970). Так, водный раствор рибофлавина обладает широкой полосой флуоресценции в области 500-700 нм и двумя полосами в СВФ о максимумами при 449 и 480 нм, напоминающими полосы СВФ нативного этиолированного листа.
В СВФ этиолированного лиота, накопившего практически только ПП (рио.1), так же присутствует малое плечо в области 480 нм, которое, по-видимому, обусловлено поглощением оамого ПП, поскольку оно отчетливо проявляется в СВФ этого порфирина в растворах. Регистрация СВФ содержащих ШІ лиотьев при наблюдении в более корот-волновой области спектра, где ПП не флуоресцирует, свидетельствует об усилении полосы при 478 и появлении новой - при 454 нм, что, вероятно, так же следует связать оо свечением веществ флавиновой природа.
Спектрофлуориметрическое исследование клеток мутанта СЫвгау-domonaB гч содержащего только ШІ, показало отсутствие в СВФ ПП
полос переноса энергии от каротиноидов. В зеленых листьях ячменя и пшеница, обогащенных Ш и МП(Э), миграция энергии от каротиноидов н этим пигментам также отсутствует.
Таким образом, отсутствие переноса энергии от каротиноидов к ПП и Ш(Э) в этиолированных и зеленых растениях указывает на то, что эти порфирины, как и Пд, разобщены с каротиноидами, скорее всего, в силу пространственной удаленности пигментов друг от друга.
Перенос энергии мекду ПП. Ш(Э) и Пд в растениях. Поскольку ПИ и Ш1(Э), как и Пд, изолированы от желтых пигментов, логично предположить, что все эти предшественники Хл находятся в одних и тех же локусах мембраны и между ними возможен обмен энергией. Анализ СФ и СВФ (-196) этиолированных листьев ячменя и пшеница, ассимилировавших экзогенную АПК и накопивших как Пд, так и ПП, показал, что в зарегистрированных при 656 пм СВФ таких листьев наряду с полосами Пд присутствуют и полосы ПП. Поскольку собст -венное свечение ІЇЇІ в области 656 им незначительно (рис.3), наличие полос ПП в СВФ при" 656 нм монет объясняться миграцией энергии от ПП к Пд. Сопоставление интенсивности полос ПП я Пд в СВФ и СФ нативных листьев г в спектрах, соответствующих вкладам собственного свечения и поглощения этих порфиринов, показывает, что перекос энергии отвечает более чем за 90$ интенсивности полос ПП в СВФ (А наблюдения 656 им) и более чем за 7С$ интенсивности флуоресценции Пд при 656 нм, что указывает на интенсивный перенос энергии мевду этими пигментами. Дополнительное подтверждение наличия миграции энергии от Ш к Пд получено в экспериментах, з которых наблюдалось возгорание собственной флуоресценции Ш и ослабление его полно в СВФ Пд656 при инфильтрации 2 дигитогаша в содержащие порфирины листья, а также при их многократном замораживании-оттаивании.
Сложность спектров нативных листьев затрудняет количественный расчет эффективности миграции энергии от ПП к Пд. Относительны!.! количественным показателем, характеризующим эффективность переноса, кожет быть изменение интенсивности полосы при 512 нм в СВФ Ш яри переходе от длины волны наблюдения 633 к 656 нм. Наибольшее значение этой величины наблюдалось для листьев, обработанных МК и г.инетином (0,53+0,14). Наименьшее - при обработке листьев сначала ДЇЇ, а затем ДП и АЖ (0,06^0,03), в результате
7І0,ни :
\
542 Л
/1
; Ч і
600, вы
w
Рис, 3. Спектры флуоресценции (-196С) при возбуждении 410 нм (А) и возбуждения флуоресценции при 656 нм (Б): І, Ґ- спектры 7-дневнго этиолированного листа пшеницы, инкубированного 16 ч на растворе 10 мМ АЛК; 2, 2'и 3, 3'- вклады в спектры I и 1^ обусловленные собственной флуоресценцией ПП (2, 2') и Пд (З, З'); 4 -сумма спектров 2 и 3.
согорой практически не накапливалась промежуточная форма Дц, &луоресвдрущая в облаоти 637-643 им. Высказано предположение, іто леренос энергии от Ш к Пд656 осуществляется через более коротковолновые промежуточные форш Пд. Отсутствие или слабое знер-?етич80кое сопряжение между ШІ и Пд655 в обработанных хелатораш іиотьях метет быть вызвано нарушением натнвного состояніія мем-5ран этиопдастоз, о которыми связаны порфирит, в результате хе-іатирования ионов металлов, присутствующих в мембранах. Рибарг я зоавт. показали, что обработка этиолированной пшеницу 8-гидрок-зшшнолином приводит к уменьшению внутрит-илакоидного пространот-за этяопластов (Ryborg,I9S3).
При инкубации отполированных лкотьез в течение І ч на раот-зоре ДП, а затем в течение 16 ч на растворе АЛК в них образуется 1д637-643 и МП(Э). Показано, что СВФ такого листа, зарегиотриро-запный при 700 ни, где Ш(Э) практически не флуоресцирует, наряду з полосами Пд содержит также и полоси Ш(Э), что timer саидвтель-зтвовать о миграции энергии от И1(Э) к Ид. В листьях, получивших гесткую обработку хелаторами, хороідо видны полосы собственной люминесценции Ш(Э), что говорит о низкой эффективности стока энергии от Ш1(Э) на другие пигмента в таких объектах. Как и в случае з ШІ, это может быть связано с отсутствием накопления промзлуточ-шх форм Пд и/или о нарушением нативного состояния-мембран под действием хелатороэ.
С учетом мембранной локализации фзрманїов биосинтеза Хя: іротопорфириноген-оксидази (Jacobs, Jeoob»,r$84), Mg-хелатазы (Rsbein et а1І978), s-адеиозііл-іі ч.;етиопин:Ш мзтилтряпсфзразы (Robots et 0..,1970), Mg-цкклазы (Caatelfroneo, Scale, 1983) и ЩФН-Пд-оксидоредуктазн (riitz et а1.,ШЗї) обнаруженная нами зространственная близость In vivo ряда интермздкатов биосинтеза Li в значительной степени укрепляет представление о оу^ествоза -;ши мембрашюсвязанного ферментного ког.шлокоа биосинтеза Хл.
Структурная организация аппарата бповвптвза Хл, при которой осуществляется сток поглощенной порфіринами энергия на агрегированные, неактивные з фотодішамнчеокпх процессах длішнсзолновуо $ормц Дц (йгатрова, Назарова, ISS8) racer иахноо фйзкепагическое значение: с одной сторони, повышается вероятность фототрансфор -«ации Цд656 в хлорофиллзд, с другой - осушеогвдлотся элективная запета растительного организма от фотодеструкимоняш-. проі^'осол,
сенсибилизируемых порфкринами.
Локализация Ш в мембранах хдороплаотов зеленых листьев ячменя, ассимилировавших экзогенную АЛК. Полиферментный комплеко Хл-синтетазы, обеспечивающий работу ЦБК, осуществляет широкий круг иооинтетических реакций, начиная их, по крайней мере, о этапов, овязашшх о мембранами - включения 1 в ІШ, этерифика-ций последнего до метилового эфира и завершая процесс синтезом молекул Хл & и в (Шлык и др., 1970, 1975, 1981). Образование . предшественника Ш - Ш, происходит в аоооциацйи о мембранами хлоролластсв (Jacobs, Jacobs, 1984). Чтобы выяснить, связано ли образование Ш о ЦБХ,изучали внутрихлоропластную локализацию и распределение во фракциях мембран хдороплаотов ПП, образованного in vivo в отрезках зелених листьев ячменя, ассимилировавших экзо-геннук АЛК. Дезинтеграцию мембран хдороплаотов ооущеоталяли о помощью механического разрушения листьев, либо путем пропускания выделенных хдороплаотов через Френч-преоо, либо обрабатывая хло-роплаогн 0,5$ дагитонином. Фракционирование чаотиц хлорояластов осуществляла о помощью высокоскоростного дифференциального центрифугирования. Легкие частица, оодержащиеоя в конечном оуперна-танте - Cj44, ваоаяивали о помощью 3l$Z, 60 и 100$ (iih.)2so. и осаждали центрифугированием в течение60 мин при уокорении 144 тыс. , пооле чего осадки Оо**, Оо6С^ и Ос100^ промывали соответствующим по концентрации раствором (W^^so^ для удаления водорастворимых порфиринов - уронорфириаа и копропорфирина, оо-ооаждагадахоя с частицами.
Ошты о простым растиранием зелених листьев ячменя, ассимилировавших экзогенную АЛК, последующим дифференциальным центрифугированием полученного гомогеката и высаливанием частиц С-^. о- помощью 30# (11114.)2304 показали, что основные количества ПП (до 95,). гакш как и остальных шгиенгов - Хл а+в, Пд и Ш(Э), обнарушшаюгоя в ооатаве крупшх чаотиц. На долю легких фрагментов мембран Оо24* и Оз * прішдаиш соответственно лишь около 3-4 Ш, ЩЭ), Пд в 0, Хл ци*. В оупернатанте, оотающемоя пооле высаливания чаотпц Cj^» бшш обнаруяака лишь водораотворимые првдшеотвенюіки Хл - МК, порфобилиноген, уропорфирин и копропор-фирин. Оценка соотношения количеотв Хл и Хл в во фракциях показала саше высокие аначения у легких чаотиц Oc5Q, 0о14д и 0о30# (соответственно 5,3; 4,5 н 4,3) и 3,5 для тяжелых чаотиц.В любом типе
выделенных чаотиц количества Цд оказалиоь в ореднем в 39 раз выше, чем количества МЛ(Э) и в 12 раз выше, чем количества Ш1. Пигментные фонда оамых легких чаотиц - Ooj^ и Оо ^, оказалиоь обогащены как ІШ, так и Ш(Э) и Пд в расчете на единицу Хл +в.
При использовании резкого дерепада давления в качестве опо-ооба фрагментирования мембран хлороплаотов ооновные количества всех пигментов также концентрировались в осадках тяжелых чаотиц. Относительное содержание ШІ оказалось самым высоким в наиболее легких частицах мембран хлороплаотов, содержащихся в Оо '" - в 9,4 раза выше, чем в исходной суспензии хлороплаотов и в 8,1 раза выше, чем a 0oj44» Таку*0 же картину наблюдали и в отношении распределения относительных количеотв Пд и Ш(Э), Соотношения количеств Пд, Ш(Э) и ІШ в различных фракциях оказалиоь практически одинаковыми и равнялись 38,0 для Пд/МП(Э) и 12,3 для Пд/ПП.
При обработке хлороплаотов 0,5% дигитонином значительно увеличился выход легких фрагментов мембран, не ооаздающихся при, ускорении 144 тыс . Однако соотношение количеотв Пд, Ш(Э) и ЇЇП в конечных оупернатантах после высаливания 60$'и ЮЦ-ым (мн4)2304 оставалось практически таким да как и в иоходном материале и в осадках. Это овидетельотвует о том, что в С ^* и С! и?" сосредоточены очень мелкие фрагменты мембран, а не свободные пигменты. Наиболее высоким относительным содержанием ШІ, Пд и МЛ(Э) к Хл а+в обладала фракция самых легких чаотиц, не осаада-ющихоя при высаливании чаотипСод йиьфаїш аммония. Так, относительное содержание ПП в С и с*0^ превасіїло его относительное содержание в ближайших к пим ооадках - Оо60^ и Ос100^, соответственно в 2,6 и в 2,0 раза, а в Oo-j-^ - ооответотвенно в 11,5 и 22,0 раза.
Таким образом, исследование показало, что независимо от способов разборки хлороплаотов наиболее легкие и лабильные фрагменты фотосинтетических мембран оказалиоь обогащены не только магниевыми предшественниками Хл, но и безметальшм кнтермедиатом цепи биооинтеза Хл - ПП. Обнаружение оцепленного оооредоточешя ПП, Ш(Э) и Пд в определенных участках мембран и обогащение ими одних и тех же субмембраняах чаотиц, характеризующихся повышенным содержанием ЦБХ (Шлык, 1975), означает, что образование ПД так же происходит в центрах и, следовательно, все стадии формирования молекулы Хл, начиная, по меньшей море, от ПП, ооущеотвля- "
ютоя единым полифарыенгшш комплексом.
Поскольку биосинтез Хл является сложным физиологическим процессом, осуществляемым интегрированной ферментативной системой, невозможно понять механизмы регуляции образования пигмента только на основании изучения отдельных стадий процесса или его элементарных звеньев. Создание концепции ЦЕХ открыло возможности для анализа регуляторних явлений в процессе хлорофиллообразоза-нкя на урозне функционирования целостных надмолекулярних структур, осуществляющих весь процесс биосинтеза молекула Хл, начиная от образования молекулы АПК. В этой связи какется ванным получение информации о механизмах, контролирующих накопление пигментов в оптимальных условиях: функционирования ЦБХ, когда растения не иопытаваю'!1 дефицита основного субстрата - АЛК. С этой целью нами осуществлено изучение активности одного из ферментов Мр-участка пути биосинтеза Хл - S-адонозил- ІнявтиошгасМд-цротопорфирин DC іле тил трансферази в листьях, накапливающих кз окзогенной АЛК избыточные количества Ид и его предшественников.
В настоящее'время развивается представление о существовании в растениях нескольких путей биосинтеза хлорофилловое пигментов, синтезирующих химически гетерогенные молекула Хл, которые, по-видиыоыу, связаны с разными ппгкект-белковкж комплексами фото-оинтетичвокого аппарата и выполняют, таким образо;.!, разные функции в фотосинтезе ( Rebels, 1982; Фрадкин и др., 1988). 'Предложенная Ребейзсм и соавг. модель образования Хл, включающая в себя ряд функционально гетерогенных путей формпрозакия зтого пигмента, достаточно олоина к для ее обоснования, несомненно, потребуются значительные экспериментальные усилия. Рабогк по выяспонюо функциональной значимости химически различающихся ввдоз Хл в про-, цеосо фотосинтеза только начинается и в етой связи особенно ванны исследования хидшческой'гетерогенности предшественников Хл.
Изучение активи опта 5-аденпзил- Дг:Мвтітонкн:М.о;-протоп_орфчРкп_. ГХ мстилтрансфераэд в листьях пшеницы, аоокмилиррвавших экзогенную АЛК, Изучение кинетики накопления предшественников Хл из окзогенной АЛК в этиолированных и зеленых листьях ячменя и пшеницы показало постепенную оогановку в синтезе и накопление предельных уровней не только Пд (Шлык, Косткж, 1972), но и его предиествен-
іка - молекул МП(3) (Аверина, Шалыго, Шлык, 1985). Это указыва- на существование в растениях механизма, контролирующего оинтез Пыточных количеств предшественников Хл, действие которого лока-:зовано на ступени более поздней чем оинтез АЖ (Шлак, Коотюк, 72; Oarlsson., Sundqvlst, 1979). Природа этого механизма не ясна, вестно лишь, что в мутанте Chlanyflomonae г. Пд при определеншх ловиях угнетает включение Щ + в Ш. (Wane: e-fc а!., 1977), высту-я, до-видимому, в роли ретроингибитора этого процесса (Caetel-aneo, Beale,l983). Чтобы понять причину остановки оинтеза пиг-нтов, изучали активность иембранноовязанного фермента S-адено-л-іі -метионин:Мр;-цротопорфирин IX метилтрансферазы, катализиру-;ей образование МПЭ из МП и S-аденозил-Ь -метионина в гомогена-х из этиолированных и затемненных зеленых листьев пшеницы, инку-руемых разное время в темноте на растворе 10 мМ АЛК и/или кидана (50 мг/л). В спзциальном опыте было показано, что экзогенная К, добавленная в гомогенат, не ингибирует активность фермента.в де инкубации препаратов с МП и S-аденозил-Ь -метионином.
Шло обнаружено, что в процессе образования Пд и ШЭ из эк-генной АЛК активность метилтрансферази снижается, так что ко змени завершения накопления пигментов активность фермента сос-зила лишь 15/5 от активности метилтрансферазы в.контрольных листе этиолированных и ЗА% - зеленых растений. По-видимому, в ус-зиях избыточного накопления в листе МП(Э) и Пд из экзогенной і ограниченность мест связывания порфиринов на структурном но-геле может приводить к инактивации ферментов, оинтезирующих їдшсствеюшни Хл, например, в результате прекращения транспор-продуктов реакций от своих ферментов и, следовательно, прекрати диссоциации комплексов фермент-продукт. Ингибирование чао-шо очищенных препаратов метилтрансферазы оо стороны Пд, Ід и ) ранее было продемонстрировано Элсворсом (Ellsworth, Pierre, '6). При этом максимальное ингибирование наблюдалось продуктом ітельности фермента- - ШЭ.
Регуляция биосинтеза моно- и дивинильных предшественников в высших растениях. Обнаружение химической гетерогенности пу-г і молекул Хл и его предшественников в растениях (Веїші^ег, Re-la, 1980; Rebels, IS32; Rebelz et nl.,1984, 11-35) поставило рад :рооов, касающихся регуляции их образования, структурни-функцао-.ьной связи разных биосинтетических путец и пигментных систем '
фотоокнтетического аппарата и др. Мы остановились на изучении осбенноотей образования MB- и ДВ-форм Пд и МПЭ у ряда однодольных и двудольных растений в норме и при обработке их АЖ, ДО и светом - агентами, которые индуцируют а растениях накопление предшественников Хл de novo.
Количественная оценка химически гетерогенных подфондов Пд в этиолированных семядолях огурцов показала разный характер накопле ния MB- и ДВ-Дц в ходе темнового развития растений, при инкубации семядолей на растворе экзогенной АЛК (рис.4), а также в ходе ре-синтеза Пд после кратковременного освещения и последующего затемнения семядолей (рио.5). Эти данные свидетельствуют о том, что об разование MB- и ДВ-Дц в этиолированных семядолях огурцов осуществляется в разных типах ЦБХ, одни из которых синтезируют MB-, а другие - ДВ-производные молекул Пд.
Кинетические кривые накопления MB- и ДВ-Пд в ходе темнового развития этиолированных семядолей огурцов показывают ьракращение накопления ДВ-Пд к 5-6 дню развития, в то время как МВ-Пд активно синтезируется вплоть до 9-II дней. Снабиение семядолей разного возраста экзогенной АЛК приводит к дополнительному накоплении обоих типов Пд, однако с преобладанием пигмента ДБ-гипа. Причем при переходе от 3-х к 6-ти дневным семядолям содержание как эндогенного Пд, так и Пд, образованного из экзогенной АЛК, увеличи -лооь в одно-и то ае число раз - 3,6 раза для ДВ-Пд и в 1,8 раза для МВ-Пд. Это означает, что накопление Пд в растущей ткани связано о формированием новых ЦБХ.
Начальная скорость и предельный уровень накопления ДВ-Пд из экзогенной АДК в этиолированных оемядолях огурцов оказались выае, чем эти ке характеристики для МВ-Пд (рис.4), тогда-как соотношения между начальными скоростями и предельными уровняли накопления для обоих типов молекул Пд, характеризующие форму кинетической кривой, оказались практически-одинаковыми - соответственно 0,022 и 0,024 ч . Это означает, что наблюдаемые кинетические различия определяются разним количеством функционирующих, перерабатываю-щих экзогенную АЛК в Пд ЦБХ MB- и ДВ-типов. Максимальная ае активность единичных центров обоих типов з оптимальных условиях функционирования, когда нет ограничений в их онабжении АЖ, а тпкжо предельная емкость',' предназначенная для депонирования мак-оишиьного количества образованных из экзогенной АЛК молекул Пд,
>
Рис. 4. Изменение количеств МВ-Пд (3), а ДВ-Пд (2), их сум-| мы (I) и величины f соотношений МВ-Пд 1<0 и ДВ-Пд (4) в 5-дневных этиолиро-0,6 ванных семядолях огурцов, инкуби-0,2 рованных на раот-ворв 10 мМ МК.
10 . 20 30 40 50 ч
одинакова в обоих типах центров.
Кинетические кривые накопления MB- и ДВ-Пд в ходе их ресин-теза после освещения (рио.5) свидетельствуют о том, что пооле снятия светом ограничений с синтеза эндогенной МК, начальная скорость образования ДВ-Пд, определяемая большим количеством функционирующих центров этого типа, намного превысила начальную окорость ресинтеза МВ-Пд. Уровни же, достигаемые к 24 ч затемнения семядолей, оказались практически одинаковы для обеих форм Пд и близки к ишвшимоя в семядолях до их освещения. Это означает, что за время освещения произошла преимущественная, как и в случае о экзогенной АШС (рис.4), активация ЦБХ ДВ-типа. Разная форма кинетических кривых ресинтеза MB- и ДВ-Пд свидетельствует о том, что как образование МК, так и регуляция активности этого участка цепи биосинтеза Хл в ЦБХ MB- и ДВ-типов ооущеотвляютоя независимо. Можно также предположить, что в раотениях существуют и независимые каналы поступления МК в разные типы ЦБХ.
В результате обработки этиолированных семядолей огурцов ДП, активирующим оинтез молекул МК путем увеличения числа активных ЦБХ (Аверина, Яронская, Дудкина,1991), возрооло количеотво как МВ-, так и ДВ-Пд. МПЭ так же накапливался в виде MB- и ДВ-произ-водных. Эти данные могут означать,что под действием хелатора произошла активация обоих типов ЦБХ, и свидетельствовать об одинаковых механизмах контроля ферментной активности системы синтеза МК в них со'стороны гема.
Исследование пигментного состава других однодольных этиолированных растений - фасоли, люпина, хлопчатника, бобоа, кабачков,
Рис.5.Изменение количеств МВ-Нд (4), ДВ-Пд (3) и их суммы (2) в ходе ресинтеза пигментов после 2 мин освещения и последующего затемнения 5-дневных этиолкрован-
10 14 18 22 НЫХ СеМЯДОЛеЙ
теьшота, ч огурцов. Кривая I
соответствует исходному уровни суммарного Пд, имевшемуся до освещения семядолей..
гороха показало, что в отличие от оешздолей огурцов, в таких объектах MB-ІІд преобладал не только в норме, но и после их инкубации на экзогенной АЛК. В некоторых зеленых растениях - лебеда, фаооль, обработанных экзогенной АПК, так ze образовывался преимущественно МВ-Цц. По~виднмо?лу, ато означает, что в таких растениях соотношение мевду числом центров обоих типов другое, чем в случае семядолей огурцов. Однако во всех изученных двудольных растениях, как и в случае с сшадмнык огурцов, относительный прирост образованного из экзогенной МК Д8-2д всегда превышал относительный прирост АЛК-МВ-Пд при расчете величины прибыли на исходный уровень каждого из них, кмєевшйся до помещения растений на раствор МК.
Отмеченным вышо особенностям накопления MB- и ДВ-Пд из экзогенной МК, а также в ходе их ресинтеза наиболее полно соответс-вует модель, предполагающая изначальную разнокачественность ЦБХ MB- и ДЗ-типов, обусловленную мзньшіш количеством эндогенного Пд в единичном центре ДВ-типа.
У изученных нами однодольных этиолированных, либо затемненных зеленеющих или зеленых растений, в отличие от двудольных организмов, на всех стадиях онтогенеза обнаруживался только МВ-Цц и лишь при снабжении отрезков экзогенной МК в них накапливался в незначительных количествах и ДВ-Пд. Метаболические особенности поведения ДВ-Пд в этиолированных листьях злаков позволяют црзпо- .
ложить, что у злаков ДВ-Пд являетоя интермедиатом биооинтетичео-кого пути, в данном случае предшественником МВ-Пд. Последний, по-видимому, являетоя единственным конечным продуктом темпового синтеза Хл в этих видах растений. Выделение из этиолированных- . лиотьев пшеницы и частичная очистка 4-винид-редуктазы ( Richards, Fung, Wessler, 1987), которая характеризовалась высокой специфичностью к ДВ-МПЭ и ДВ-Пд, превращая их в МВ-аналоги, поддерживает нашу точку зрения о том, что в однодольных этиолированных растениях, в отличие от двудольных организмов, реакция восстановления ДВ-Пд до Ш-Пд действительно имеет место. Таким образом, данные Ребейза и ооавтД Hebeia, Tripathy, 1986) о существовании в листьях ячменя биосинтетичеокого взаимодействия между ДВ- и МВ-путями на стадии синтеза ШІ и ШЭ дополняютоя данными о существовании подобной связи и на стадии образования Ид.
Свет, активируя в злаках звено синтеза АЛК, включает в работу все ЦБХ и образование ДВ-Пд как интэрмедиата в одежном потоке предшественников Хл становится отчетливо регистрируемым.
Таким образом, основным результатом проведенного исследования является обнаружение в двудольных организмах двух типов ЦБХ, синтезирующих химически- различающиеся MB- и ДВ-молекулы. ШЭ и Пд. Образование АЛК и регуляция зтого процесса в обоих типах ЦБХ происходит независимо. В изученных однодольных и двудольных растениях продемонстрирован различный характер метаболизма предшественников Хл.
