Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 8
1. Общие свойства холинэстераз 8
2. Макромолекулярные и изоферментные формы АХЭ 9
3. Функциональные центры АХЭ 12
4. Механизм ферментативного катализа АХЭ 14
5. Биосинтез АХЭ 16
6. Медиаторная регуляция биосинтеза белков в нервных 18 клетках
1). Взаимосвязь процессов функциональной активности и синте за РНК и белков 18
2). Влияние медиаторов на синтез РНК и белков в бесклеточных (модельных) системах 22
III. Материалы и методы,. 26
1. Модельная бесклеточная система биосинтеза АХЭ 26
I). Система из мозга 26
2). Система из печени 27
3). Диализуемые цитоплазматические факторы 27
2. Модельная система с исходно ингибированной АХЭ микросом и цитозоля 29
3. Влияние эзерина (in vivo ) на активность АХЭ микросом печени 29
4. Определение активности АХЭ 30
5. Количественное определение белка 32
7. Статистическая обработка экспериментальных данных.. 34
8. Реактивы 35
ІV. Результаты и их обсуждение 36
1. Влияние ацетилхолина и пуромицина на активность АХЭ микросом мозга в бесклеточной системе 36
2. Эффект АХ на фоне ингибиторов синтеза РНК и белков и в безъядерной системе 36
3. Действие цАМФ на активность АХЭ микросом 44
4. Действие цГМФ на активность АХЭ микросом 48
5. Эффекты АХ в бесклеточной системе с необратимо ингибированной АХЭ 55
6. Цитоплазматические факторы, участвующие совместно с АХ и циклическими нуклеотидами в регуляции биосинтеза АХЭ 59
I). Фактор, взаимодействующий с АХ 59
2). Фактор, взаимодействующий с цАМФ 63
3). Фактор, взаимодействующий с цГ'МФ 63
7. Выделение цитоплазматического фактора, взаимодействующего с АХ в биосинтезе АХЭ 69
8. Сравнение действия АХ на биосинтез АХЭ мякросом мозга и печени 73
9. Влияние эзерина in vivo на уровень АХЭ микросом печени 73
V. Заключение 77
VІ. Выводы 83
VII. Цитированная литература 85
- Макромолекулярные и изоферментные формы АХЭ
- Диализуемые цитоплазматические факторы
- Количественное определение белка
- Эффект АХ на фоне ингибиторов синтеза РНК и белков и в безъядерной системе
Макромолекулярные и изоферментные формы АХЭ
В 1926 г Леви и Навратил (Loewi a. Navratii , 1926) обнаружили в сердце лягушки фермент, обладающий способностью быстро инактивировать ацетилхолин путем расщепления его на холин и уксусную кислоту. Б 1932 г. Стедман и сотрудники (stedman et ai, 1932) открыли аналогичный фермент в сыворотке крови лошади и назвали его "холинэстераза".
Основная функция холинэстераз состоит в гидролитическом разрушении эфиров холина. В "Номенклатуру ферментов" (1979) внесены две холинэстеразы: ацетилгидролаза ацетилхолина (НФ 3.1,1.7) и ацилгидролаза ацилхолинов (НФ 3.1.1.8) или соответственно ацетилхолинэстераза и бутирилхолинэстераза.
АХЭ локализована преимущественно в синаптических образованиях и плазматических мембранах клеток и её роль состоит в инактивации АХ. По мнению Кёлле (коеііе , 1954) основную функциональную нагрузку несет поверхностно локализованный фермент, тогда как внутриклеточный представляет резерв и служит для пополнения запасов наружного. Предполагается также, что и внутриклеточная АХЭ выполняет определенную физиологическую функцию, регулируя уровень АХ в клетке и его накопление в синаптических везикулах.
В мышечных клетках куриного эмбриона примерно одна треть АХЭ локализована на плазматической мембране, большая же часть фермента находится внутри клеток (Rotundo a. Fambroygh ,1980). АХЭ синтезируется внутри мышечных клеток и переносится к плазматической мембране в течение 2-3 час, где накапливается со скоростью 2 - 3% (от исходного уровня) в час. Время полужизни АХЭ плазматической мембраны мышечных клеток составляет около 50 час. Прирост АХЭ в культуре клеток за один час составляет около 20$ от общего связанного с клетками количества фермента, причем большая часть АХЭ секретируется в среду инкубации. Только небольшая часть новосинтезированной АХЭ удерживается на плазматической мембране. Перенос молекул АХЭ из клеток в среду происходит практически без задержки на плазматической мембране. Приведенные примеры свидетельствуют о существовании динамической системы биосинтеза и распределения фермента. Очевидно, функции АХЭ гораздо шире, чем предполагалось ранее; не имеет пока адекватного объяснения значимость освобождаемого во внеклеточное пространство фермента. Не вполне понятным также остается факт преимущественной локализации АХЭ в плазматической и эндоплазматической мембранах нервных клеток, а не в холинергических синапсах (Brzin et al, 1979).
Существует несколько молекулярных форм АХЭ. Например, в развивающейся сетчатке глаза цыпленка обнаружены глобулярные АХЭ и АХЭ, связанные с коллагеном (Ramirez et al ,1981). Глобулярные формы АХЭ представлены мономерами, димерами и тетра-мерами. Коллагеновая форма АХЭ представляет собой три тетра-мера АХЭ, соединенных коллагеновыми филаментами. Коллагеновые СВЯЗКИ чувСТВИТеЛЬНЫ К ДеЙСТВИЮ КОЛЛагенаЗЫ (Allemand et al , 1981). Глобулярные формы АХЭ могут быть полностью экстрагированы из ткани растворами, содержащими соли в высоких концентрациях и детергенты. Для приведения в растворимое состояние коллагеновых форм АХЭ среда гомогенизации должна содержать также ЭДТА . В растворе 1%-ного натрия холевокислого тетрамер-ная глобулярная АХЭ электрического органа Torpedo californica легко диссоциирует на димеры. Денатурация её приводит к образованию субъединиц с молекуля рной массой 80000. Такие субъединицы НЄ МОГУТ бЫТЬ ПОЛучеНЫ ИЗ КОЛЛагеНОВОЙ формы (Viratelle a. Bemhard t 1980). Тем не менее, глобулярная и коллагеновая формы имеют идентичные по молекуля рной массе каталитические субъединицы и одно и то же число оборотов на один активный центр.
Белое вещество мозга свиньи содержит преимущественно глобулярную форму АХЭ, а серое - коллагеновую (G ai et ai f 1981). Причем, АХЭ в белом веществе мозга более прочно связана с мембранами. При центрифугировании в градиенте плотности сахарозы обе формы фермента из белого вещества мозга образуют один пик активности с константой седиментации около I0s(молекулярная масса 260000). В препаратах обеих форм прослеживались фракции АХЭ с молекулярными массами 660000, 180000, 130000, II5000. Очевидно, эти формы представляют переходные состояния при образовании основных олигомерных форм АХЭ.
Вилдмер и сотрудники (wildmer et ai , 1979) изучили влияние различных детергентов на степень агрегации и активность мембранной АХЭ эритроцитов человека. Детергенты приводят к диссоциации агрегированных форм АХЭ и образованию 6,5!3-формы при концентрациях детергента выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Ферментативная активность 6,5s -формы АХЭ проявляется только в присутствии детергентов, причем для стабилизации активности достаточна концентрация детергента, существенно ниже ККМ. Общие липиды эритроцитарной мембраны также способствуют сохранению активности 6,5s -формы АХЭ. При концентрациях фермента, больших 2,5 мкг/мл, происходит реагрегация с образованием множественных форм. При этом ферментативная активность перестает зависеть от присутствия детергентов, так как белок - белковые взаимодействия оказывают стабилизирующее влияние. Предполагается, что АХЭ проявляет максимальную активность только при наличии гидрофобных взаимодействий с такими амфифильными веществами, как детергенты, липиды или белки.
Из электрического органа Torpedo marmorata выделены различные молекулярные формы АХЭ: 5s ; 6,3s j 8s ; lis ; и I4s (Bon et al ,1980). На различных стадиях эмбрионального развития Torpedo marmorata обнаружены существенные изменения В составе форм фермента (Witzemann a. Whittaker , 1981). Вначале для постсинаптической мембраны характерна I7S -форма; в момент образования функционирующих синапсов появляется также 6s -форма.
Диализуемые цитоплазматические факторы
Очевидно, что эти: функции АХ и НА нужно рассматривать уже не как медиаторные, а как внутриклеточные гормональные. Принципиально новым фактом явилось также обнаружение в цитоплазме нервных клеток термостабильных факторов неферментативной природы, с которыми взаимодействуют как медиаторы, так и циклические нуклеотиды, в процессах их регуляции работы генома.
Таким образом, рассмотренные литературные данные позволяют считать, что регуляторное влияние нейромедиаторов на биосинтез белков включает три эффекта: два опосредованных (изменение соотношения ионов при де- и гиперполяризации и синтез циклических нуклеотидов) и прямое действие.
В настоящей работе исследовано влияние АХ и циклических нуклеотидов на уровень активности АХЭ мембран нервных клеток в модельной системе. Для суждения о зависимости активности фермента мембран от белок-синтетических процессов был использован ингибиторный анализ. Сопоставлено также влияние физиологически активных веществ на биосинтез АХЭ в нервных и печеночных клетках с целью выяснения элементов общности процессов регуляции биосинтеза фермента. Настоящее исследование представлялось необходимым, учитывая недостаточность сведений о регуляции биосинтеза АХЭ при её чрезвычайно важной роли в процессах жизнедеятельности. Предполагалось также, что многосторонний анализ регуляции биосинтеза одного белка может выявить новые аспекты нейромедиаторной регуляции биосинтеза белков.
В настоящей работе за основу была взята модельная бесклеточная система, разработанная ранее при изучении биосинтеза М,К-АТФазы (Н.Р.Елаев, 1980, 1981). Система включала: I) изолированные ядра как аппарат синтеза РНК; 2) микросомно--цитоплазматическую фракцию как аппарат синтеза белков и акцепции фермента; 3) соли /(M sO ; MnS 04; MgC ); глута-тион и четыре рибонуклеозидтрифосфата для создания оптимальных условий работы ядерных РНК-полимераз; 4) эквимолярнуто смесь 20 аминокислот.
I). Система из мозга. Опыты выполнены на белых крысах массой 150 - 200 г. Животных быстро обезглавливали, цельный мозг (исключая мозжечок и каудальную часть продолговатого мозга) гомогенизировали в растворе 2,45 М сахарозы из расчета 7 мл на I мозг. Все процедуры (без специальной оговорки) проводили на холоду. Гомогенат центрифугировали 75 мин при 27000g. Осадок, содержащий ядра (микроскопический контроль - рис. I), ре суспендировали в растворе А: 0,33 М (Ш sQ l 2 »10 М №s04; 5 10"3 М % й2; Ю"3 М глутатион (восстановленный); Ю"3 М АТФ; 3-Ю""4 М ГТФ; 5-Ю"5 М ЦТФ; 5-Ю"5 М УТФ; 5-Ю-2 М трис-НСі, рН 8,0; эквимолярная смесь 20 аминокислот (50 мкг/мл). Ядра ресуспендировали в растворе А из расчета 2,5 мл на один мозг. К аликвотам ядерной суспензии (2,5 мл) добавляли равный объем микросомно-цитоплазматической фракции. Последнюю получали путем центрифугирования гомогената мозга (2,5 - 3,0 мл 0,3 М сахарозы на один мозг) при 8000g в течение 10 мин. Ранее было показано, что мембраны, входящие в состав микросомно-цитоплазматической фракции, полученной таким образом, не содержат митохондрий (Н.Р.Елаев, 1980).
Опытные пробы содержали либо АХ (10 - 10 М), либо цАМФ (Ю 6 М), либо пГМФ (Ю 6 М), либо пуромицин (25.жг/мл). В тех случаях, когда действие АХ изучали на фоне пуромицина (50 мкг/мл), актиномицина Д (50 мкг/мл) или рибонуклеази (100 мкг/мл), все пробы - контрольные и опытные - содержали антибиотик или фермент. При отсутствии в системе ядер их суспензию заменяли равным объемом раствора А. Пробы инкубировали 60 мин при 37С с периодическим перемешиванием, добавляли равный объем 0,3 М сахарозы и центрифугировали 7 мин при 4000g . Надосадочную жидкость отбирали и центрифугировали 75 мин при 27000g . Осадок микросом ресуспендировали в 3 мл (в расчете на один мозг) ОД М la-фосфатного буфера, рН 7,8, содержащего 0,075 М №аС1 и 0,04 М MS&Q» И определяли активность АХЭ.
2). Система из печени. Печень гомогенизировали в 7 объемах 2,45 М сахарозы. Ядра выделяли при тех же условиях, что и из мозга. Микросомно-цитоплазматическую фракцию получали путем центрифугирования гомогената печени (2,5 объема 0,3 М сахарозы) в течение 10 мин при 1200( . Условия инкубации проб и последующего выделения микросом и определения активности АХЭ были те же, что и в случае бесклеточной системы из мозга.
3). Диализуемые цитоплазматические факторы. При изучении вопроса о существовании низкомолекулярных цитоплазматических факторов, участвующих с АХ и циклическими нуклеотидами в регуляции биосинтеза АХЭ микросомно-цитоплазматическую фракцию (см. I.) диализовали в течение 20 час против 20 объемов 0,3 М сахарозы (две смены). Когда преследовали цель возврата этих факторов в модельную систему диализ микросомно-цитоплазмати-ческой фракции проводили против равного объема раствора А и изолированные ядра ресуспендировали в этой среде.
Количественное определение белка
Более низкая активность АХЭ в микросомах, проинкубированных с пуромицином и рибонуклеазо!, по сравнению с контрольными свидетельствует о спонтанном синтезе фермента в использованной нами модельной системе. Новосинтезированный за I час фермент обусловливает 10%-шш прирост холинэстеразной активности макросом. Таким образом, потенциально полное обновление фермента в мембранах в результате спонтанного синтеза может осуществиться за 10 час. В связи с этим следует отметить, что период полужизни АХЭ в модельной системе составляет 10 час (Soreg et al , 1982). В полной бесклеточной системе АХ ускоряет прирост активности фермента в 3 раза. Поскольку действие АХ полностью снимается ингибиторами синтеза РБК и белков (актиномицин Д, пуромицин и рибонуклеаза), то его необходимо интерпретировать в том смысле, что АХ является эффектором биосинтеза АХЭ..Снятие активирующего действия АХ актиномицином Д, а также при изъятии из системы ядер, свидетельствуют о локализации этого эффекта в ядрах. Он может состоять либо в активации АХ синтеза РНК на ДНК генов АХЭ, либо в ускорении посттранскрипционного процессинга этой РНК. Наиболее показательными являются эксперименты с модельной системой, содержащей обработанные ДФФ микросомы и цитозоль. В этом случае относительный" прирост активности АХЭ составляет 140 - 260$. Тот факт, что в этой системе на фоне рибонуклеази не только не проявляется эффект АХ, но и активность фермента много ниже контрольной, однозначно свидетельствует о спонтанном синтезе АХЭ в модельной системе и ускорении этого синтеза ацетилхолином.
В безъядерной модельной системе АХ снижает активность АХЭ микросом и этот эффект снимается пуромицином и рибонуклеазой. Последнее позволяет заключить об участии АХ в регуляции сборки белковых единиц АХЭ в цитоплазме в качестве ингибитора. Следовательно, ацетилхолиновый контроль биосинтеза АХЭ можно представить как систему регуляции с обратными связями: активация на ядерном уровне и ингибирование - на цито-плазматическом. Поскольку в полной модельной системе проявляется активирующее действие АХ, то первое влияние нужно считать основным, а второе - корректирующим, поддерживающим количество фермента в мембранах на каком-то определенном уровне.
Проведенный анализ влияния циклических нуклеотидов в той же модельной системе дает основание полагать, что регуля-торное действие АХ на биосинтез АХЭ в микросомах не опосредуется ни цГМФ, ни цАМФ. Циклические нуклеотиды участвуют в регуляции биосинтеза АХЭ иным способом. цАМФ подавляет экспрессию генов АХЭ на ядерном уровне и активирует на цитоплаз-матическом. Следовательно, регуляторное влияние цАМФ на биосинтез АХЭ макросом представляет так же, как и в случае АХ, систему с обратными связями. Ингибиторное действие цАМФ в полной модельной системе свидетельствует о том, что первое влияние является основным, а второе корректирующим. цГМФ оказывает ингибиторное действие как на ядерном, так и на цито-плазматическом уровне.
В настоящей работе показано, что в цитоплазме нервных клеток присутствуют низкомолекулярные факторы, участвующие совместно с АХ, цАМФ и цГМФ в регуляции биосинтеза АХЭ на ядерном уровне. В цитоплазме АХ, цАМФ и цГМФ регулируют биосинтез АХЭ без участия указанных факторов. Регуляторный фактор к АХ удалось выделить. Изучение его химической природы составляет предмет дальнейшей работы.
Если попытаться экстраполировать результаты, полученные в модельной системе, на цельную клетку, то можно представить систему регуляции биосинтеза АХЭ микросом нервных клеток АХ, цАМФ и цГМФ следующим образом: I). АХ (+ цитоплазматический фактор) - активатор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 2). АХ - ингибитор трансляции; 3). цАМФ (+ цитоплазматический фактор) - ингибитор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 4). цАМФ - активатор трансляции; 5). цГМФ (+ цитоплазматический фактор) - ингибитор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 6). цГМФ - ингибитор трансляции. В основу же всей системы регуляции биосинтеза АХЭ в нервных клетках должно быть положено влияние АХ (в комплексе с цитоплазматический фактором) на ядерный уровень экспрессии генов АХЭ, так как только АХ является активатором на этом уровне. Все другие влияния нужно рассматривать, очевидно, как корректирующие звенья, не позволяющие уровню фермента в клетке выйти за определенные функционально обусловленные рамки. На рис.6 сделана попытка схематизировать систему регуляции биосинтеза АХЭ нервных клеток АХ и циклическими нуклеотидами. Регуляторное влияние на экспрессию гена АХЭ может оказывать как внутриклеточный АХ, содержание которого изменяется в зависимости от функционального состояния, так и, возможно, поступающий в клетки из синапсов. В этом отношении в настоящее время известно, что нейроны в принципе способны к активному (против градиента концентрации) транспорту ацетилхолина (Schuberth a.Sundwall f 1968; Polak f 1969; Неі1ЬгоппД970).
Эффект АХ на фоне ингибиторов синтеза РНК и белков и в безъядерной системе
Более низкая активность АХЭ в микросомах, проинкубированных с пуромицином и рибонуклеазо!, по сравнению с контрольными свидетельствует о спонтанном синтезе фермента в использованной нами модельной системе. Новосинтезированный за I час фермент обусловливает 10%-шш прирост холинэстеразной активности макросом. Таким образом, потенциально полное обновление фермента в мембранах в результате спонтанного синтеза может осуществиться за 10 час. В связи с этим следует отметить, что период полужизни АХЭ в модельной системе составляет 10 час (Soreg et al , 1982). В полной бесклеточной системе АХ ускоряет прирост активности фермента в 3 раза. Поскольку действие АХ полностью снимается ингибиторами синтеза РБК и белков (актиномицин Д, пуромицин и рибонуклеаза), то его необходимо интерпретировать в том смысле, что АХ является эффектором биосинтеза АХЭ..Снятие активирующего действия АХ актиномицином Д, а также при изъятии из системы ядер, свидетельствуют о локализации этого эффекта в ядрах. Он может состоять либо в активации АХ синтеза РНК на ДНК генов АХЭ, либо в ускорении посттранскрипционного процессинга этой РНК. Наиболее показательными являются эксперименты с модельной системой, содержащей обработанные ДФФ микросомы и цитозоль. В этом случае относительный" прирост активности АХЭ составляет 140 - 260$. Тот факт, что в этой системе на фоне рибонуклеази не только не проявляется эффект АХ, но и активность фермента много ниже контрольной, однозначно свидетельствует о спонтанном синтезе АХЭ в модельной системе и ускорении этого синтеза ацетилхолином.
В безъядерной модельной системе АХ снижает активность АХЭ микросом и этот эффект снимается пуромицином и рибонуклеазой. Последнее позволяет заключить об участии АХ в регу- ! ляции сборки белковых единиц АХЭ в цитоплазме в качестве ингибитора. Следовательно, ацетилхолиновый контроль биосинтеза АХЭ можно представить как систему регуляции с обратными связями: активация на ядерном уровне и ингибирование - на цито-плазматическом. Поскольку в полной модельной системе проявляется активирующее действие АХ, то первое влияние нужно считать основным, а второе - корректирующим, поддерживающим количество фермента в мембранах на каком-то определенном уровне.
Проведенный анализ влияния циклических нуклеотидов в той же модельной системе дает основание полагать, что регуля-торное действие АХ на биосинтез АХЭ в микросомах не опосредуется ни цГМФ, ни цАМФ. Циклические нуклеотиды участвуют в регуляции биосинтеза АХЭ иным способом. цАМФ подавляет экспрессию генов АХЭ на ядерном уровне и активирует на цитоплаз-матическом. Следовательно, регуляторное влияние цАМФ на биосинтез АХЭ макросом представляет так же, как и в случае АХ, систему с обратными связями. Ингибиторное действие цАМФ в полной модельной системе свидетельствует о том, что первое влияние является основным, а второе корректирующим. цГМФ оказывает ингибиторное действие как на ядерном, так и на цито-плазматическом уровне.
В настоящей работе показано, что в цитоплазме нервных клеток присутствуют низкомолекулярные факторы, участвующие совместно с АХ, цАМФ и цГМФ в регуляции биосинтеза АХЭ на ядерном уровне. В цитоплазме АХ, цАМФ и цГМФ регулируют биосинтез АХЭ без участия указанных факторов. Регуляторный фактор к АХ удалось выделить. Изучение его химической природы составляет предмет дальнейшей работы. Если попытаться экстраполировать результаты, полученные в модельной системе, на цельную клетку, то можно представить систему регуляции биосинтеза АХЭ микросом нервных клеток АХ, цАМФ и цГМФ следующим образом: I). АХ (+ цитоплазматический фактор) - активатор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 2). АХ - ингибитор трансляции; 3). цАМФ (+ цитоплазматический фактор) - ингибитор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 4). цАМФ - активатор трансляции; 5). цГМФ (+ цитоплазматический фактор) - ингибитор транскрипции (или посттранскрипционного процессинга); 6). цГМФ - ингибитор трансляции. В основу же всей системы регуляции биосинтеза АХЭ в нервных клетках должно быть положено влияние АХ (в комплексе с цитоплазматический фактором) на ядерный уровень экспрессии генов АХЭ, так как только АХ является активатором на этом уровне. Все другие влияния нужно рассматривать, очевидно, как корректирующие звенья, не позволяющие уровню фермента в клетке выйти за определенные функционально обусловленные рамки. На рис.6 сделана попытка схематизировать систему регуляции биосинтеза АХЭ нервных клеток АХ и циклическими нуклеотидами. Регуляторное влияние на экспрессию гена АХЭ может оказывать как внутриклеточный АХ, содержание которого изменяется в зависимости от функционального состояния, так и, возможно, поступающий в клетки из синапсов. В этом отношении в настоящее время известно, что нейроны в принципе способны к активному (против градиента концентрации) транспорту ацетилхолина (Schuberth a.Sundwall f 1968; Polak f 1969; Неі1ЬгоппД970) Образуется в результате взаимодействия АХ с холиноре-цепторами, а цАМФ образуется при освобождении катехоламинов, которое может индуцироваться в результате возбуждения ацетил-холином вставочных тормозных катехоламинергических нейронов. Обнаруженный Н.Г.Алексидзе и М.В.Балавадзе (1977) факт активирующего действия цАМЗ? на биосинтез АХЭ in vivo нужно рассматривать как одно из звеньев предлагаемой нами системы регуляции биосинтеза фермента.
